CN104634779B

CN104634779B - 基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法

Info

Publication number: CN104634779B
Application number: CN201510069027.0A
Authority: CN
Inventors: 陈伟; 邓豪华; 沈奕珉; 李光文; 刘爱林
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: CN104634779A

Abstract

本发明公开一种基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用脲酶催化尿素反应体系耦合纳米金模拟过氧化物酶‑过氧化氢‑3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于脲酶及其抑制剂含量的测定。在1.8~90 U/L范围内，A₄₅₀与脲酶浓度呈线性关系，检测限为1.8 U/L。通过软件拟合得到脲酶抑制剂乙酰氧肟酸的IC₅₀为0.05 mmoL/L。本发明操作简便、灵敏度高，能够作为分析方法应用于环境及生命科学体系中脲酶及其抑制剂含量的测定。

Description

基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法

技术领域

本发明涉及基于纳米金模拟过氧化物酶催化显色体系的脲酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术

脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。脲酶抑制剂作为一种药物可溶解尿结石，阻止尿液生成新的晶体。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。为了减少环境污染和提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制剂的使用是一个极佳的选择。由上可知，脲酶及其抑制剂的检测具有十分重要的意义。

随着纳米技术的发展，许多种类的纳米材料，例如，金属纳米材料、氧化物纳米材料、半导体纳米材料和导电纳米聚合物等已经广泛被应用于化学及生物传感器领域。在所有的纳米材料中，金纳米粒子（Gold nanoparticles, GNPs）由于其易于制备和生物功能化、优良的生物稳定性和独特的光谱特性最受到研究者们的关注。基于纳米金的色度传感器近年来得到了广泛关注，其中的大部分均是基于纳米金聚集或聚集再分散过程中的等离子体耦合而产生的颜色变化。纳米金已越来越多地应用于比色法检测细胞、蛋白质、DNA、金属离子和小分子等。

本发明利用纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系与脲酶催化尿素水解反应体系耦合，构建了一种简便、灵敏的脲酶及其抑制剂的检测新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系的脲酶及其抑制剂的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用脲酶催化尿素水解反应体系耦合纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于脲酶及其抑制剂含量的测定。

上述所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶测定方法，其特征是将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液和尿素溶液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL 质量分数为30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，在1.8 ~ 90 U/L浓度范围内，A₄₅₀与脲酶浓度呈线性关系，检测限为1.8 U/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

所使用的尿素溶液的体积为0.1 mL，浓度为0.5 moL/L。

本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶测定土壤中脲酶的方法，包括如下步骤：取5g直径< 2 mm的干燥土壤样品，加入9 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲溶液和0.2 mL甲苯，充分混匀后，置于6000转/分钟离心20分钟，取上清液进行超滤纯化，得样品溶液，将0.05 mL样品溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL 质量分数为30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，通过吸光度值标准曲线进行定量，获得土壤样品中脲酶的含量。

本发明所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶抑制剂测定方法，其特征是将脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL含不同浓度乙酰氧肟酸的浓度为10mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，计算抑制率，通过软件拟合得到乙酰氧肟酸的IC₅₀为0.05 mmoL/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

所使用的脲酶溶液的体积为0.05 mL，浓度为18 U/L。

具体地说，本发明采用的技术方案为：

（一）纳米金的制备

以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。纳米金的制备：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温。所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

（二）脲酶的测定

将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL步骤（一）制备的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定450 nm波长处的吸光度值（A₄₅₀）。通过吸光度值标准曲线进行脲酶含量测定。

（三）脲酶抑制剂的测定

将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL含不同浓度乙酰氧肟酸（脲酶抑制剂）的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL步骤（一）制备的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀。通过吸光度值标准曲线进行脲酶抑制剂含量测定。

本发明的优点：

（1）本发明利用脲酶催化尿素水解反应体系耦合纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于脲酶及其抑制剂含量的测定。

（2）本方法所使用的纳米金直接由柠檬酸三钠还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。

（3）检测步骤简单，不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。

（4）本发明的检测灵敏度高，分光光度法测定脲酶的检测限为1.8 U/L。

附图说明

图1为脲酶检测显色体系外观图：图中：（A1）对照组：纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（B1）对照组：尿素+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（C1）对照组：脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（D1）实验组：尿素+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐。

图2为脲酶检测显色体系吸光度值A₄₅₀图：图中：（A1）对照组：纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（B1）对照组：尿素+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（C1）对照组：脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（D1）实验组：尿素+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐。

图3为纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系的吸光度值A₄₅₀与脲酶浓度的关系变化图。

图4为纳米金模拟过氧化物酶-过氧化氢-3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐催化显色体系的吸光度值A₄₅₀与脲酶浓度的线性关系图。

图5为乙酰氧肟酸检测显色体系外观图：图中：（A）对照组：尿素+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（B）实验组：尿素+乙酰氧肟酸+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐。

图6为乙酰氧肟酸检测显色体系吸光度值A₄₅₀图：图中：（A）对照组：尿素+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐；（B）实验组：尿素+乙酰氧肟酸+脲酶+纳米金+过氧化氢+3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐。

图7为乙酰氧肟酸的脲酶活性抑制率曲线图。

具体实施方式

实施例1：

1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温。所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

实施例2：

将0.05 mL18 U/mL的脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，目视观察颜色的变化或测定吸光度值A₄₅₀。目视观察颜色变化时，对照组溶液颜色均为深黄色，实验组显色体系颜色变为浅黄色（见图1）。测定A₄₅₀时，对照组A₄₅₀几乎不发生变化，实验组A₄₅₀明显减小（见图2）

实施例3：

将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀。由图3可知，随着脲酶浓度的增大，A₄₅₀值逐渐减小。在1.8 ~ 90 U/L范围内，A₄₅₀值与脲酶浓度呈线性关系，检测限为1.8 U/L（见图4）。

实施例4：

将0.05 mL 54 U/L脲酶溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀。重复上述实验步骤6次，得相对标准偏差（RSD）为3.2%，表明本方法重现性良好。

实施例5：

取5g干燥土壤样品（直径< 2 mm），加入9 mL磷酸缓冲溶液（10 mmoL/L, pH=6.40）和0.2 mL甲苯，充分混匀后，置于6000转/分钟离心20分钟，取上清液进行超滤纯化，得样品溶液。将0.05 mL样品溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL磷酸缓冲液中（10mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀。结合实施例3计算土壤样品中脲酶的含量，样品的测定回收率为97.0%~109%，相对标准偏差为1.3~4.1%。

实施例6：

将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL 0.5mmoL/L乙酰氧肟酸的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，目视观察颜色的变化或测定吸光度值A₄₅₀。目视观察颜色变化时，实验组显色体系颜色变为深黄色，对照组溶液颜色仍为浅黄色（见图5）。测定A₄₅₀时，与对照组相比，实验组A₄₅₀明显增大（见图6）。

实施例7：

将0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL含不同浓度乙酰氧肟酸的磷酸缓冲液中（10 mmoL/L，pH=6.40），摇匀后37°C温浴30分钟。反应结束后，加入0.2 mL 30%（m/m）的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL实施例1所制得的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟。立即加入0.2 mL 20%（V/V）的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，计算抑制率。结果如图7示，通过软件拟合得到乙酰氧肟酸的IC₅₀为0.05 mmoL/L。

Claims

1.一种基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶测定方法，其特征是将0.05 mL不同浓度的脲酶溶液和尿素溶液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL 质量分数为30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，在1.8~ 90 U/L浓度范围内，A₄₅₀与脲酶浓度呈线性关系，检测限为1.8 U/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

2.根据权利要求1所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶测定方法，其特征是所使用的尿素溶液的体积为0.1 mL，浓度为0.5 moL/L。

3.一种基于纳米金模拟过氧化物酶测定土壤中脲酶的方法，包括如下步骤：取5g直径<2 mm的干燥土壤样品，加入9 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲溶液和0.2 mL甲苯，充分混匀后，置于6000转/分钟离心20分钟，取上清液进行超滤纯化，得样品溶液，将0.05mL样品溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL 质量分数为30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10 mL的纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，通过吸光度值标准曲线进行定量，获得土壤样品中脲酶的含量。

4.根据权利要求3所述的基于纳米金模拟过氧化物酶测定土壤中脲酶的方法，其特征是所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13 nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

5.一种基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶抑制剂测定方法，其特征是将脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL含不同浓度乙酰氧肟酸的浓度为10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸缓冲液中，摇匀后37°C温浴30分钟，反应结束后，加入0.2 mL质量分数为 30%的过氧化氢溶液、0.05 mL浓度为16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和0.10mL纳米金溶液，混合均匀后37°C温浴10分钟，立即加入0.2 mL 体积分数为20%的硫酸溶液终止反应，测定吸光度值A₄₅₀，计算抑制率，通过软件拟合得到乙酰氧肟酸的IC₅₀为0.05mmoL/L；所使用的纳米金采用柠檬酸三钠还原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加热煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的柠檬酸三钠溶液，反应溶液由从浅黄色变成酒红色，继续回流15分钟后，将反应溶液慢慢冷却至室温，所得的纳米金粒径为13nm，浓度为3.1 nmoL/L，4 °C保存。

6.根据权利要求5所述的基于纳米金模拟过氧化物酶的脲酶抑制剂测定方法，其特征是所使用的脲酶溶液的体积为0.05 mL，浓度为18 U/L。