CN104215760B - 基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法 - Google Patents

基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种<b>基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法</b>，其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，而脲酶抑制剂可以阻止脲酶催化尿素分解这一过程，抑制荧光猝灭，从而用于脲酶抑制剂的检测。测定F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到巯基乙胺和对苯醌的IC50分别为2.8 μmol/L和11.9 μmol/L。本发明可应用于脲酶抑制剂的高通量筛选。

Description

基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法
技术领域
本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶抑制剂的测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。脲酶抑制剂作为一种药物可溶解尿结石，阻止尿液生成新的晶体。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。为了提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制剂的使用是一个极佳的选择。因此，脲酶抑制剂的筛选对医学及农业领域具有重要的现实意义。
近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层（如硫醇）保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直径一般小于2nm，接近于电子的费米波长（约0.7nm）。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（goldnanoclusters，AuNCs）因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。
本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的脲酶抑制剂检测的新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶抑制剂的测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法,其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，而脲酶抑制剂能阻止脲酶催化尿素分解这一过程，抑制荧光猝灭，从而用于脲酶抑制剂的检测。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650nm处的发射光强度值（F650）以判断脲酶抑制剂对脲酶活性的抑制作用，所使用的激发波长为355nm。
将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度脲酶抑制剂的1mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到脲酶抑制剂的IC50。
将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度巯基乙胺的1mol/L、pH=6.0尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，再在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到巯基乙胺的IC50为2.8μmol/L。
将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度对苯醌的1mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到对苯醌的IC50为11.9μmol/L。
所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
具体地说，本发明采用的技术方案为：
（一）金纳米团簇荧光材料的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备方法如下：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
（二）脲酶抑制剂的测定
脲酶活性的测定分两步进行：（1）将0.05mL浓度为1.5U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2mL（pH=6.0）浓度为1mol/L的尿素溶液（含不同浓度抑制剂）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min。（2）将0.2mL的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，结束后取出测定F650值。通过软件拟合，得到各个抑制剂的IC50值，即酶活性被抑制一半时抑制剂的浓度。
本发明的优点：
（1）本发明基于脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳，新生成的氨能提高体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，而脲酶抑制剂可以阻止脲酶催化尿素分解这一过程，抑制荧光猝灭，从而可用于脲酶抑制剂的检测。
（2）本发明所使用的金纳米团簇直接由N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸得到，无需进行进一步的修饰，制备过程简单快速。
（3）本发明可用于脲酶抑制剂的高通量筛选。
附图说明
图1为紫外灯下的外观图：图中：（A）实验组：金纳米团簇溶液+脲酶+尿素+巯基乙胺；（B）实验组：金纳米团簇溶液+脲酶+尿素+对苯醌；（C）对照组：金纳米团簇溶液+脲酶+尿素。
图2为荧光发射光谱图：图中：（A）金纳米团簇溶液+脲酶+尿素+巯基乙胺；（B）金纳米团簇溶液+脲酶+尿素+对苯醌；（C）金纳米团簇溶液+脲酶+尿素。
图3为巯基乙胺抑制率曲线图。
图4为对苯醌抑制率曲线图。
具体实施方式
下述实例所用的脲酶抑制剂优选巯基乙胺或对苯醌，而对于其它种类的脲酶抑制剂,本发明的测试方法具有同样的效果。
实例1：
将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。所得到的金纳米团簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处保存，能保持至少一个月的相对稳定。
实例2：
将0.05mL浓度为1.5U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2mL分别含有巯基乙胺（8μmol/L）或对苯醌（50μmol/L）的浓度为1mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min。（2）将0.2mL的实例1所制得的溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min。设置一组无脲酶抑制剂的空白对照组。反应结束后，在紫外灯下观察，加入8μmol/L巯基乙胺（图1中的A）或50μmol/L的对苯醌（图1中的B）后，金纳米团簇有红色荧光，而对照组红色荧光发生猝灭（图1中的C）。图2为相应的荧光发射光谱图。
实例3：
将0.05mL浓度为1.5U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2mL含有不同浓度巯基乙胺的浓度为1mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min。将0.2mL的实例1所制得的溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率。结果如图3所示，通过软件拟合得到巯基乙胺的IC50为2.8μmol/L。
实例4：
将0.05mL浓度为1.5U/mL的脲酶溶液（pH=6.0）加入到0.2mL含有不同浓度对苯醌的浓度为1mol/L的尿素溶液（pH=6.0）中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min。将0.2mL的实例1所制得的溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率。结果如图4所示，通过软件拟合得到对苯醌的IC50为11.9μmol/L。

Claims (6)

1.一种基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法,其特征是将脲酶溶液与含有不同浓度脲酶抑制剂的尿素溶液混合均匀，恒温反应后，加入N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液，测定荧光强度值；所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
2.根据权利要求1所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
3.根据权利要求1或2所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650nm处的发射光强度值（F650）以判断脲酶抑制剂对脲酶活性的抑制作用，所使用的激发波长为355nm。
4.根据权利要求1或2所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度脲酶抑制剂的1mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到脲酶抑制剂的IC50。
5.一种基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度巯基乙胺的1mol/L、pH=6.0尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，再在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到巯基乙胺的IC50为2.8μmol/L；所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
6.一种基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法，其特征是将0.05mL浓度为1.5U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2mL含有不同浓度对苯醌的1mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25°C的恒温水浴槽中反应40min，将0.2mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25°C的恒温水浴槽中反应3min，测定发射光强度值F650值，计算抑制率，通过软件拟合得到对苯醌的IC50为11.9μmol/L；所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液与0.4mL浓度为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。
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