CN106323934A

CN106323934A - 一种同时检测Cu2+、Mg2+和Pb2+三种离子的荧光生物探针及其检测方法

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Publication number: CN106323934A
Application number: CN201611024223.7A
Authority: CN
Inventors: 云雯; 杜云峰; 吴虹; 尤琳烽; 刘兴燕; 黄昱
Original assignee: Chongqing Technology and Business University
Current assignee: Chongqing Technology and Business University
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2036-11-18
Also published as: CN106323934B

Abstract

本发明属于检测领域，具体涉及一种荧光生物探针、包含该荧光生物探针的生物检测系统及其检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺浓度的方法。本发明提供的荧光生物探针及含有该荧光生物探针的生物检测系统可以同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种金属离子浓度，且灵敏度高、操作简单快捷、成本低廉，能够广泛应用于药品、食品安全、临床和环境检测等领域。

Description

一种同时检测Cu2+、Mg2+和Pb2+三种离子的荧光生物探针及其检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种可以同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种离子的荧光生物探针、包含该荧光生物探针的生物检测系统及其检测方法。

背景技术

随着科技的发展，土壤、水源、食品等逐渐被工业废气、废水、废渣所污染，土壤中汞(Hg²⁺)、铜(Cu²⁺)、铅(Pb²⁺)、镁(Mg²⁺)等多种金属污染物大量富集、累积，并通过食物链在生物体内累积，给人们带来了严重的健康危害，如铅(Pb²⁺)，作为对人体危害最大的重金属，即使在很低的浓度下，对人体各系统也有着严重的毒害作用，并对儿童的生长发育影响极大，严重影响儿童的智力发育和行为；镁(Mg²⁺)可引起过敏性皮炎或湿疹，久而不愈，对眼睛和粘膜有很强的刺激性，对皮肤有中度刺激性，吸入还可导致肺栓塞和肝损害，镁(Mg²⁺)中毒严重者甚至威胁到生命安全；铜(Cu²⁺)具有抗生育作用，低浓度的Cu²⁺即对男性精子表现出毒害作用等。因此，有必要发展一种高选择性和高灵敏性的分析方法用于环境中金属离子的检测。脱氧核酸酶由于高催化活性、高稳定性、能与某种特定的金属离子特异性结合等特点，通过结合一些信号转换策略，发展了许多不同的金属检测方法，如比色法、荧光法、拉曼、电化学法等。但现有的基于脱氧核酸酶技术的金属检测方法大多只能检测一种金属离子，Li L等人[Li L,Feng J,Fan Y,et al.Simultaneous imaging of Zn²⁺and Cu²⁺inliving cells based on DNAzyme modified gold nanoparticle[J]报道了将两种不同的脱氧核酸酶固定在纳米金粒子表面，可以同时检测Zn²⁺和Cu²⁺两种离子的浓度，但由于纳米金粒子体积较大，会干扰固定于其表面的脱氧核酸酶的催化活性，影响金属检测灵敏度等。因此，开发一种能够同时检测多种金属及其浓度、且灵敏度高、操作方便的高效率金属检测方法，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种荧光生物探针，本发明的荧光生物探针可以同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种金属离子，且灵敏度高、操作简单快捷、成本低廉，能够广泛应用于药品、食品安全、临床和环境检测等领域。

本发明的另一个目的是提供一种用于同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种金属离子浓度的荧光生物检测系统，其特征在于包括本发明的荧光生物探针和氧化石墨烯(GO)。

本发明的还一个目的是提供一种同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种金属离子浓度的生物检测方法。

为实现上述发明目的，提供以下技术方案：

一种荧光生物探针，由三种核酸片段S1、S2和S3组成，S1、S2和S3的碱基序列见图2，其中S1、S2和S3的5’端分别标记不同的荧光基团，S1、S2和S3通过碱基互补形成”Y”字形刚性双链结构。本发明的荧光生物探针的工作原理见图1，每种核酸片段包含一种金属酶链和另一种金属底物链，当环境中不存在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺时，三种核酸片段S1、S2和S3通过碱基互补形成如图1的”Y”字形刚性双链结构，难以吸附于氧化石墨烯表面而发出荧光信号，当环境中存在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺中的至少一种金属离子时，相应的金属酶链会在该金属离子的作用下，对其底物链进行剪切，形成游离的底物链吸附于氧化石墨烯表面，相应的荧光信号淬灭。如当环境中存在Cu²⁺时，包含Cu²⁺酶链的核酸片段在Cu²⁺作用下，对包含Cu²⁺底物链的核酸片段进行剪切，游离出5-’末端标记了荧光基团的Cu²⁺底物链，吸附于氧化石墨烯表面，相应的荧光信号淬灭；又如当环境中同时存在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种离子时，三种核酸片段分别在Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺作用下，对其底物链进行剪切，游离出三种5-’末端标记了不同荧光基团的Cu²⁺底物链、Mg²⁺底物链和Pb²⁺底物链，吸附于氧化石墨烯表面，所有的荧光信号淬灭。

根据本发明，所述的荧光生物探针S1、S2和S3组成的”Y”字形刚性双链结构可以通过95℃下搅拌5min获得。

根据本发明，所述的荧光基团选自FAM、Cy5和ROX。

第二方面，本发明提供一种用于同时检测Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺的荧光生物检测系统，包括本发明的荧光生物探针和氧化石墨烯，其特征在于所述的荧光生物探针由三种核酸片段S1、S2和S3组成，S1、S2和S3的碱基序列见图2，其中S1、S2和S3的5’端分别标记不同的荧光基团，S1、S2和S3通过碱基互补形成”Y”字形刚性双链结构；所述的氧化石墨烯可以采用修饰的Hummer法等方法合成制备。

在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺存在时，本发明的荧光生物探针S1、S2和S3通过碱基互补形成如图1的”Y”字形刚性双链结构，难以吸附于氧化石墨烯表面而发出荧光信号，当环境中存在Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺中的至少一种金属离子时，相应的金属酶链会在该金属离子的作用下，对其底物链进行剪切，形成游离的底物链吸附于氧化石墨烯表面，相应的荧光信号淬灭。

根据本发明的荧光生物检测系统，所述的荧光生物探针S1、S2和S3组成的”Y”字形刚性双链结构可以通过95℃下搅拌5min获得。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针S1、S2和S3组成的5’-末端标记的荧光基团选自FAM、Cy5和ROX。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中氧化石墨烯(GO)可以采用修饰的Hummer方法制备。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针S1、S2和S3为浓度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl缓冲溶液，氧化石墨烯(GO)为浓度60-100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针S1、S2和S3为浓度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl缓冲溶液，氧化石墨烯(GO)为浓度80-100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针S1、S2和S3为浓度50nM的S1、S2和S3Tris-HCl缓冲溶液，氧化石墨烯(GO)为浓度100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的荧光生物检测系统，其中Tris-HCl缓冲溶液为浓度50mmol/L，pH7.5，含50mmol/L MgCl₂的溶液。

第三方面，本发明提供一种同时检测Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺三种金属离子浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)室温下，将待测品、荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液混合均匀后，孵化时间T1，加入氧化石墨烯混合均匀后，孵化时间T2；

(2)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Cu²⁺浓度值，根据荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Mg²⁺浓度值，根据荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Pb²⁺浓度值。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中荧光生物探针S1、S2和S3在使用前加热至95℃反应5min，然后逐渐冷却至室温。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的氧化石墨烯可以采用修饰的Hummer方法制备。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的待测品可以根据需要进行稀释或浓缩操作。优选地，步骤(1)中的待测品可以根据需要进行稀释操作。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为50nmol/L，氧化石墨烯(GO)为浓度60-100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。优选地，步骤(1)中荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为50nmol/L，氧化石墨烯(GO)为浓度80-100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。进一步优选地，步骤(1)中荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液浓度为50nmol/L，氧化石墨烯(GO)为浓度100ug/mL Tris-HCl缓冲溶液。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中Tris-HCl缓冲溶液为50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的孵化时间T1为5-60min。优选地，步骤(1)中的孵化时间T1为5-20min。进一步优选地，步骤(1)中的孵化时间T1为5-10min。

根据本发明的生物测试方法，步骤(1)中的孵化时间T2为15-50min。优选地，步骤(1)中的孵化时间T2为20-30min。进一步优选地，步骤(1)中的孵化时间T2为25min。

根据本发明的生物测试方法，步骤(2)中的检测条件为FAM的激发波长设定为492nm，扫描范围505-600nm，扫描步长为1nm；Cy5的激发波长设定为640nm，扫描范围650-750nm，扫描步长为1nm；ROX的激发波长设定为580nm，扫描范围590-700nm，扫描步长为1nm。

根据本发明的生物测试方法，步骤(2)中的荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线是通过将一系列浓度的Cu²⁺溶液标准品、荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液混合摇匀后，孵化时间T1后，加入氧化石墨烯混合均匀，孵化时间T2，测得荧光发射光谱强度，并以浓度为横坐标，荧光发射光谱强度为纵坐标制备得到，所述Cu²⁺溶液标准品的浓度范围为0.5-100uM。

根据本发明的生物测试方法，步骤(2)中的荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线可以采用和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线相同的方法得到，所述的Mg²⁺溶液标准品的浓度范围为20-2000uM，所述的Pb²⁺溶液标准品的浓度范围为1-500nM。

在一些优选的实施方案中，本发明提供的一种同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种离子浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)室温下，将一系列浓度的Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺溶液标准品、荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液混合均匀，孵化时间T1，加入氧化石墨烯混合均匀后，孵化时间T2；

(2)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，制备荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线、荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线；

(3)室温下，取待测样品，重复步骤(1)；

(4)测定步骤(3)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线、荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Cu²⁺浓度、Mg²⁺浓度和Pb²⁺浓度。

在一些具体的实施方案中，本发明提供的一种同时检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺三种离子浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)配制一系列浓度的Cu²⁺溶液标准品，如0.5uM、5uM、10uM、20uM、50uM和100uM；配制一系列浓度的Mg²⁺溶液标准品，如20uM、100uM、500uM、1000uM、1500uM和2000uM；配制一系列浓度的Pb²⁺溶液标准品，如1nM、20nM、100nM、200nM、300nM和500nM；

(2)室温下，分别将步骤(1)配制的Cu²⁺溶液标准品、Mg²⁺溶液标准品和Pb²⁺溶液标准品、荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液混合均匀，孵化5-20min，加入氧化石墨烯混合均匀后，孵化20-30min，其中，所述的荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50nM，所述的Tris-HCl缓冲溶液为浓度50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂的溶液，所述的氧化石墨烯通过修饰Hummer方法制备，浓度80-100μg/mL；

(3)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，制备荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线、荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线；

(4)室温下，取待测样品，重复步骤(2)；

(5)测定步骤(4)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Cu²⁺浓度标准曲线、荧光强度-Mg²⁺浓度标准曲线和荧光强度-Pb²⁺浓度标准曲线得到待测样品的Cu²⁺浓度、Mg²⁺浓度和Pb²⁺浓度。

本发明提供的荧光生物检测系统，通过设计含有不同金属酶链和金属底物链的三种核酸片段碱基互补组装生成的”Y”字形刚性双链结构，难以吸附于氧化石墨烯表面，发出荧光信号，而在特定金属存在下，金属酶链对其金属底物链进行剪切游离出5’-端标记荧光基团的金属底物链吸附于氧化石墨烯表面，荧光信号猝灭的原理同时测定样品中Cu²⁺浓度、Mg²⁺浓度和Pb²⁺浓度，选择性强，灵敏度高，Cu²⁺的线性范围为0.5-100uM，最低检出限为0.1uM，Mg²⁺的线性范围为20-2000uM，最低检出限为5uM，Pb²⁺的线性范围为1-500nM，最低检出限为0.3nM，且重复性好，检测效率高，方法简单可靠，成本低廉。

术语解释

本发明所述的“pM”是指浓度单位pmol/L，所述的“nM”是指浓度单位nmol/L，所述的“uM”是指浓度单位umol/L。

本发明所述的“金属酶链”是指与某种金属具有高度亲和力、在相应金属存在下能够对与其互补的碱基进行剪切的碱基序列。

本发明所述的“金属底物链”是指与相应的金属酶链呈互补关系、能够被金属酶链剪切的碱基序列。

本发明所述的“rA”和序列表中的“ra”是指腺嘌呤核糖核苷酸，所述的“A”和序列表中的“a”是指腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述的“T”和序列表中的“t”是指胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，所述的“C”和序列表中的“c”是指胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，所述的“G”和序列表中的“g”是指鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。

附图说明

图1是本发明荧光生物检测系统检测Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺的原理示意图。

图2是本发明生物荧光探针S1、S2和S3的碱基序列。

图3是实施例2中Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺的荧光发射光谱。

图4是实施例5荧光生物检测系统的选择性分析结果。

图5是本发明荧光生物检测系统的参数测定结果。

图6a和6b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同浓度Cu²⁺的荧光发射光谱和不同浓度Cu²⁺的荧光强度与Cu²⁺浓度关系的曲线图。

图7a和7b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同浓度Mg²⁺的荧光发射光谱和不同浓度Mg²⁺的荧光强度与Mg²⁺浓度关系的曲线图。

图8a和8b是50nmol/L S1、S2、S3和100μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，Ph7.5，含50mmol/L MgCl₂)中的不同浓度Pb²⁺的荧光发射光谱和不同浓度Pb²⁺的荧光强度与Pb²⁺浓度关系的曲线图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细说明，但并不因此限制本发明。本文中使用的原料、试剂均可以通过商购或本领域常规的方法制备。

实施例1氧化石墨烯(GO)的制备

称取2g石墨粉末溶于50mL浓硫酸中，搅拌2h；20℃条件下缓慢加入10g高锰酸钾，然后转移至35℃水浴中强烈搅拌4h；加入600mL超纯水稀释反应液；逐渐滴加20mL 30％H₂O₂溶液；将反应混合物分别依次用0.1mol/L HCl和超纯水洗涤5次，超声分散1h；以5000rpm的速度离心GO混合物10min，取上清液作为实验备用GO。

实施例2本发明荧光生物检测系统的有效性分析

见图3，组1是分别测定只含有本发明单个核酸片段S1、S2或S3的荧光强度值；组2是测定含有本发明的荧光生物探针的荧光强度值(本发明核酸片段S1、S2和S3的混合物，加热至95℃反应5min，然后逐渐冷却至室温)；组3是组1加入100ug/mL的氧化石墨烯测得的荧光强度值；组4是组2加入100ug/mL的氧化石墨烯测得的荧光强度值；组5是组2仅加入某一种金属后，再加入100ug/mL的氧化石墨烯测得的荧光强度值；组6是组2加入三种金属后，再加入100ug/mL的氧化石墨烯测得的荧光强度值。

由组1与组2对比可以看出，本发明形成”Y”字形刚性双链结构的荧光生物探针的荧光强度未受影响；由组1和组3、组2和组4的对比可以看出，与单个核酸片段相比，本发明的荧光生物探针由于形成”Y”字形刚性双链结构，加入氧化石墨烯后荧光猝灭率显著降低；由组5与组6的对比可以看出，多种金属存在下并不影响本发明荧光生物系统检测Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺的专属性。本发明提供的荧光生物检测系统可以同时地、专属地检测环境中的Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺三种金属离子。

实施例3本发明荧光生物检测系统的选择性分析

分别将目标离子100μMCu²⁺浓度、2000μMMg²⁺浓度和500nM Pb²⁺，干扰离子100μM的Mn²⁺,Ca²⁺,Hg²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Sn²⁺溶液与本发明荧光生物探针S1、S2、S3(均为50nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂)混合均匀，室温下孵化5min，随后加入100μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5，含50mmol/L MgCl2)混合均匀后，孵化25min。用荧光光度计检测荧光发射光谱。

实验结果见图4，该系统对目标离子Cu²⁺,Mg²⁺，Pb²⁺具有良好的荧光信号响应，干扰离子(Mn²⁺,Ca²⁺,Hg²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Sn²⁺)的荧光信号响应不明显，因此，本发明提供的荧光生物检测系统具高度的灵敏性和选择性，可以从复杂的金属离子样品中高度灵敏和选择地检测出Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺及其浓度。

实施例4本发明荧光生物检测系统的参数测定

室温下，将荧光生物探针S1、S2和S3的Tris-HCl缓冲溶液(50nmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂)混合均匀，孵化10min，测定荧光强度值F₀，加入实施例1方法制得的不同浓度的氧化石墨烯混合均匀，孵化25min，测定荧光强度值F，以猝灭效率Q＝(F₀-F)/F₀为纵坐标，以氧化石墨烯浓度为横坐标，测定氧化石墨烯浓度对本发明荧光生物检测系统的影响，结果见图6，其中荧光生物探针S1、S2和S3在使用前均加热至95℃反应5min，然后逐渐冷却至室温，以便形成”Y”字形刚性双链结构。

实验结构表明，氧化石墨烯对三种荧光基团的猝灭效率基本相似，随着氧化石墨烯浓度的升高，本荧光生物检测系统的荧光猝灭效率逐渐增高，并趋于稳定，当氧化石墨烯浓度为60ug/mL时，荧光猝灭效率超过80％，当氧化石墨烯浓度为100ug/mL时，荧光猝灭效率趋近90％。

实施例5Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺浓度的测定

步骤a：分别配制Cu²⁺浓度为0.5uM、5uM、10uM、20uM、50uM和100uM的标准品溶液、Mg²⁺浓度为20uM、100uM、500uM、1000uM、1500uM和2000uM的标准品溶液、Pb²⁺浓度为1nM、20nM、100nM、200nM、300nM和500nM的标准品溶液；

步骤b：分别将不同Cu²⁺浓度、Mg²⁺浓度和Pb²⁺浓度的溶液与本发明荧光生物探针S1、S2、S3(均为50nmol/L)的Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl2)混合均匀，室温下孵化5min，随后加入100μg/mL GO的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5，含50mmol/LMgCl2)混合均匀后，孵化25min。用荧光光度计检测荧光发射光谱，结果见图6a、7a和8a，绘制标准曲线，结果见6b、7b和8b，Cu²⁺浓度在0.5-100uM(R²＝0.994)的范围内，Mg²⁺浓度在20-2000uM(R²＝0.995)的范围内、Pb²⁺浓度在1-500nM(R²＝0.993)的范围内，本发明的生物检测系统具有良好的线性关系，Cu²⁺的最低检出限为0.1uM(3倍空白样品标准偏差)，Mg²⁺的最低检出限为5uM(3倍空白样品标准偏差)，Pb²⁺的最低检出限为0.3nM(3倍空白样品标准偏差)。

步骤c：将待测品用步骤b的生物检测系统检测荧光强度，根据标准曲线测定待测品中的Cu²⁺、Mg²⁺和Pb²⁺浓度。

以上描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆工商大学

<120> 一种同时检测Cu2+、Mg2+和Pb2+三种离子的荧光生物探针及其检测方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctctctra ggacaaaaca tctcttctcc gagccggtcg aaatagtgag t 50

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actcactatra ggaagagatg ggtaagcctg ggcctctttc tttttaagaa agaac 55

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcttctttc taatacggct taccttttgt cagcgatccg gaacggcacc catgtgagag 60

aa 62

Claims

1.一种荧光生物探针，由三种核酸片段S1、S2和S3组成，其中S1、S2和S3的5’端分别标记不同的荧光基团，S1的碱基序列为5’-TTCTCTCTrAGGACAAAACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-3’，S2的碱基序列为5’-ACTCACTATrAGGAAGAGATGGGTAAGCCTGGGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC-3’，S3的碱基序列为5’-AGCTTCTTTCTAATACGGCTTACCTTTTGTCAGCGATCCGGAACGGCACCCATGTGAGAGAA-3’。

2.根据权利要求1所述的荧光生物探针，三种核酸片段S1、S2和S3组成”Y”字形刚性双链结构。

3.根据权利要求1所述的荧光生物探针，所述的荧光基团选自FAM、Cy5和ROX。

4.一种荧光生物检测系统，其包括权利要求1-3任一项所述的荧光生物探针和氧化石墨烯。

5.根据权利要求4的荧光生物检测系统，其中所述的荧光生物探针为浓度50nmol/L的S1、S2和S3Tris-HCl缓冲溶液。

6.根据权利要求4的荧光生物检测系统，其中所述的氧化石墨烯为浓度60-100μg/mL的Tris-HCl缓冲溶液；优选地，所述的氧化石墨烯为浓度80-100μg/mL的Tris-HCl缓冲溶液；进一步优选地，所述的氧化石墨烯为浓度100μg/mL的Tris-HCl缓冲溶液。

7.一种同时检测Cu²⁺、Mg²⁺或Pb²⁺三种金属离子浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：

(3)室温下，取待测样品，重复步骤(1)；

9.根据权利要求7或8的生物检测方法，其中：

步骤(1)中的孵化时间T1为5-60min；优选地，步骤(1)中的孵化时间T1为5-20min；进一步优选地，步骤(1)中的孵化时间T1为5-10min；

步骤(1)中所述的荧光生物探针为浓度50nmol/L的S1、S2和S3Tris-HCl缓冲溶液；

步骤(1)中所述的Tris-HCl缓冲溶液为50mmol/L，pH 7.5，含50mmol/L MgCl₂；

步骤(1)中所述的氧化石墨烯采用修饰的Hummer方法制备；

步骤(1)中所述的氧化石墨烯浓度为60-100ug/mL；优选地，步骤(1)中所述的氧化石墨烯浓度为80-100ug/mL；优选地，步骤(1)中所述的氧化石墨烯浓度为100ug/mL；

步骤(1)中的孵化时间T2为15-50min；优选地，步骤(1)中的孵化时间T2为20-30min；进一步优选地，步骤(1)中的孵化时间T2为25min。

10.根据权利要求7-9任一项所述的生物检测方法，其中步骤(2)中的条件为FAM的激发波长设定为492nm，扫描范围505-600nm，扫描步长为1nm；Cy5的激发波长设定为640nm，扫描范围650-750nm，扫描步长为1nm；ROX的激发波长设定为580nm，扫描范围590-700nm，扫描步长为1nm。