CN105296598A - 基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于8-17？DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。在Pb2+作用下，8-17？DNAzyme可以催化断裂其互补底物链，利用固定在芯片表面的探针捕获断裂后释放到溶液中的带荧光标记的部分底物链，借助于倏逝波激发捕获的底物链，建立荧光信号与Pb2+浓度的关系。本发明的检测方法可在室温(20-30℃)20分钟完成Pb2+的检测，对Pb2+的最低检测限为20nM。本发明的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用水中铅离子(Pb2+)的检测，而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、并能与仪器结合的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器检测重金属离子领域中基于8-17DNAzyme原理的铅离子荧光检测方法及其应用。
背景技术
铅污染具有毒性大、致毒剂量低、易累积、难降解、难治理等特点，因而是目前环境监测和治理的重点。《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)严格限定饮用水中铅(Pb2+)离子浓度不能高于0.01mg/L等。同时GB/T4470-1998、GB/T20380.1-2006、GB/T23362.4-2009等标准就分别规定了使用原子荧光光谱分析法(AFS)、原子吸收分光光度计法(AAS)和电感耦合等离子体质谱分析法(ICP-MS)作为痕量铅离子检测的标准方法。但是上述方法样品前处理方法复杂，仪器设备昂贵，检测费力、费时、成本高，此外样品必须经专业人员进行操作，难以实现快速的现场检测或对突发水污染事件做出快速响应。
现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些重金属离子可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为重金属离子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。脱氧核酶(DNAzyme)由一个碱基环和两条单链侧臂构成，是具有催化功能的单链DNA片段，它是利用体外分子进化技术(SELEX)合成的，具有很高的催化活性和结构识别能力，能将与其互补的DNA链或RNA链连接或切断。
2000年，美国伊利诺伊大学香槟分校的Lu教授等人筛选出对铅离子具有高亲和、特异结合的8-17DNAzyme，并设计出一种“turnon”模式的检测策略(即铅离子浓度与荧光强度成正比)快速检测水体中铅离子的浓度。具体方法为在8-17DNAzyme互补底物链(17DS)3’末端标记上了一个荧光基团，而在8-17DNAzyme的5’末端标记一个淬灭基团，当8-17DNAzyme与17DS杂交后，由于荧光基团与淬灭基团相邻，根据荧光共振能量转移(FRET)效应，将不产生荧光；而在铅离子存在下，水溶液中的8-17DNAzyme可对17DS链上的识别位点(一个RNA腺嘌呤)进行攻击，导致17DS断裂，从而使淬灭基团与荧光基团分离，产生荧光，并且荧光的强度与铅离子的浓度成正比。在该体系下Pb2+的线性检测范围为10nM到4mM，检出限远低于EPA(美国环境保护署)饮用水中铅离子含量标准，此外该体系中Pb2+表现出明显的特异性，较其它二价离子灵敏度高出至少80倍，但该体系需要在4℃下反应，严重限制了其应用。
中国发明专利申请CN102031284A(发明人是赵建龙等)利用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)方法，将3’端修饰-NH2的8-17DNAzyme链固定在芯片表面，并设计开发了“turnoff”模式(即铅离子浓度与荧光强度成反比)的光学检测Pb2+的方法。他们首先使8-17DNAzyme链与标记有荧光基团的底物链杂化，接着引入Pb2+，在8-17DNAzyme作用下底物链断裂，荧光强度逐渐减弱。该方法耗时1小时，检出限可达1nM，线性范围为1nM-10μM，多次重复再生检测对于灵敏度基本无影响。
综上所述，上述研究还存着易产生假信号或者检测时间长的问题，并不能满足实际检测的需要。因此，研制针对铅离子(Pb2+)检测的快速、准确、灵敏的检测方法已成为防治铅离子(Pb2+)污染的迫切需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在室温(20-30℃)下快速、准确、灵敏的检测饮用水中铅离子(Pb2+)的含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种铅离子的检测方法1。
本发明所提供的一种铅离子的检测方法1，利用Pb2+诱导脱氧核酶催化与其互补的底物链发生断裂的原理，在20-30℃使含有Pb2+的待测样品中的Pb2+诱导名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶催化与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸发生断裂，得到名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种铅离子的检测方法2。
本发明所提供的一种铅离子的检测方法2，包括：
1)制备含有17EB-17SF的杂交液；所述17EB-17SF是由名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶和与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸制成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态的所述17SF；
2)在20-30℃，将待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液混合，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF发生断裂，得到含有名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段的反应液，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述连接臂可位于所述17PS的5’端，所述连接臂由6-10个碱基组成的脱氧核苷酸链(如6个胸腺嘧啶组成的脱氧核苷酸链)组成；所述17PS可进行氨基修饰。
上述检测方法1和上述检测方法2中，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF断裂是由于Pb2+满足与所述脱氧核酶的作用条件，可以触发所述17EB对所述17SF的断裂反应，如在所述含有17EB-17SF的杂交液中，在20-30℃条件下Pb2+与所述17EB-17SF作用，导致所述17SF在腺苷酸位点(rA)处被断裂成两部分，得到名称为所述17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段。
上述检测方法2中，所述待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液的体积比为≤1％。
上述检测方法2中，所述含有17EB-17SF的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH7.2-7.4，浓度可为10-50mM的Tris-HAc缓冲液，具体可为pH7.4，浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述17EB-17SF和NaNO3，所述17EB-17SF在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度可为20-50nM，具体可为30nM；NaNO3在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度可为30-300mM，具体可为40mM。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述脱氧核酶为8-17DNAzyme。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光淬灭基团在所述17EB中的位置和所述荧光基团在所述17SF中的位置满足所述17EB与所述17SF能形成所述17EB-17SF，如所述荧光淬灭基团连接在所述17EB的3’末端，所述荧光基团连接在所述17SF的5’末端。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光基团可为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种，具体可为花青素荧光染料Cy3；所述荧光淬灭基团可为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种，具体可为荧光淬灭基团BHQ2；具体的，当所述荧光基团为羧基荧光素FAM时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团Dabcyl；当所述荧光基团为花青素荧光染料Cy3时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1或BHQ2；当所述荧光基团为花青素荧光染料Cy5时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ2；当所述荧光基团为花青素荧光染料Cy5.5时，所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ3。
上述检测方法1和检测方法2中，所述17EB的具体序列如下：5’-ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-B-3’(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)。
上述检测方法1和检测方法2中，所述17SF的具体序列如下：5-F-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTCTGT-3)(其中rA为腺嘌呤RNA；F为荧光基团花青素荧光染料Cy3)。
上述检测方法1和检测方法2中，所述17PS的具体序列如下：5’-NH2-TTTTTTATAGTGAGT-3’。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述铅离子的检测方法为非疾病诊断治疗目的铅离子的检测方法。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述待测样品可为环境样品，如水，所述水可为饮用水。
上述检测方法1和上述检测方法2中，所述荧光强度通过倏逝波检测仪器进行检测，所述倏逝波检测仪器具体可为中国专利ZL200610089497.4的中全光纤倏逝波生物传感器。
上述检测方法1和上述检测方法2在检测环境样品中铅离子含量中的应用也属于本发明保护的范围。
实验证明，本发明的检测方法可在室温(20-30℃)20分钟完成Pb2+的检测，对Pb2+的最低检测限为20nM。本发明的检测方法可在室温能够快速、准确地进行饮用水中铅离子(Pb2+)的检测，而且特异性强，不受其它金属离子的干扰，重复性好。本发明的检测方法具有特异性强、性能稳定、易于再生、检测成本低、并能与仪器结合的优势。
附图说明
图1为基于DNAzyme原理的铅离子的荧光检测方法的原理图。
图2为17PS探针芯片对不同浓度铅离子(Pb2+)的检测结果图，其中，a为不同浓度Pb2+的实际检测图；b为Pb2+检测的标准曲线图；
图3为17PS探针芯片对不同金属离子的选择性检测结果图。
图4为17PS探针芯片对浓度为10μM的铅离子(Pb2+)溶液的重复性检测结果图。
图5为17PS探针芯片对饮用水中不同浓度的铅离子(Pb2+)的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为sigma-aldrich公司的产品,CAS号为919-30-2。
下述实施例中的17EB：(5’-ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-B-3’)(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)为宝生物工程(大连)有限公司的产品。
下述实施例中的17SF：(5’-F-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTCTGT-3’)(其中rA为腺嘌呤RNA，F为花青素荧光染料Cy3)为宝生物工程(大连)有限公司的产品。
下述实施例中的17PS：(5’-NH2-TTTTTTATAGTGAGT-3’)为宝生物工程(大连)有限公司的产品。
全光纤倏逝波生物传感器为本实验室自行开发，中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
光纤为南京春辉科技实业有限公司的产品，产品型号为HCS。
实施例1、不同浓度铅离子(Pb2+)的检测
一、制备17PS探针芯片
1、光纤基片表面羟基活化
将光纤基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，80℃静置1h，取出浸泡后的光纤基片，采用超纯水冲洗3次后用N2吹干，然后120℃静置3h，得到表面羟基活化的光线基片，将表面羟基活化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
硫酸-过氧化氢溶液的制备方法：将质量百分含量为98.3％的浓硫酸和质量百分含量为30％的过氧化氢按照体积比3:1进行混合，得到硫酸-过氧化氢溶液。
2、表面硅烷化
将步骤1得到的表面羟基活化的光线基片浸泡于硅烷化剂溶液中，室温静置120min，取出浸泡后的光纤基片，依次用脱水甲苯和无水乙醇冲洗各3次，然后用N2吹干，180℃烘烤1h，得到表面硅烷化的光纤基片，将表面硅烷化的光纤基片置于干燥器中冷却和保存。
硅烷化剂溶液的制备方法：将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解于脱水甲苯，每2mLAPTES溶于100mL脱水甲苯中，形成体积百分含量为2％的硅烷化剂溶液。
3、表面偶联化
将步骤2得到的表面硅烷化的光纤基片浸泡于戊二醛偶联剂溶液中，室温静置60min，取出浸泡后的光纤基片，依次用高纯水和浓度为50mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)各冲洗3次，然后用N2吹干，得到表面偶联化的光线基片，将表面偶联化的光线基片置于干燥器中冷却和保存。
偶联剂溶液：含2％(体积百分含量)戊二醛的浓度为50mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)。
4、17PS探针的固定
将名称为17PS的探针溶液滴在步骤3得到的表面偶联化的光纤基片的表面，然后放入湿度为55-75％，最佳湿度为65％的密闭环境中室温静置18h，依次用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，然后用浓度为20μM的甘氨酸水溶液进行封闭1h，然后再用0.2％(质量百分含量)的SDS溶液和超纯水各冲洗3次，每次1min，用N2吹干，得到表面固定有名称为17PS的探针的芯片，命名为17PS探针芯片。
名称为17PS的探针溶液的制备方法：将名称为17PS的探针和NaNO3溶于浓度为50mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)中，使名称为17PS的探针的浓度为150nM，NaNO3的浓度为100mM。
名称为17PS的探针：5’-NH2-TTTTTTATAGTGAGT-3’。其中，名称为17PS的探针中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，连接臂的核苷酸序列为TTTTTT，名称为17SFFC的片段的核苷酸序列为ATAGTGAGT。
二、铅离子(Pb2+)的检测
用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
含有17EB-17SF的杂交液的制备方法：
17EB(靶标1)：5’-ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-B-3’(其中B为荧光淬灭基团BHQ2)，
17SF(靶标2)：5-F-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTCTGT-3)(其中rA为腺嘌呤RNA；F为花青素荧光染料Cy3)。
含有17EB-17SF的杂交液的制备：由溶剂和溶质组成，溶剂可为pH7.4，浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液，溶质为17EB-17SF和NaNO3，17EB-17SF在杂交液中的浓度为30nM；NaNO3在杂交液中的浓度为40mM。
检测步骤：
1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
2、将铅离子(Pb2+)溶液用浓度为0.1M硝酸溶液稀释成如下浓度(μM)：0、3.4、6.67、8.34和10.0；分别向1-5号试管中各加入300μL的含有17EB-17SF的杂交液，然后将上述不同浓度的铅离子(Pb2+)溶液依次加入到1-5号含有300μL的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中各浓度铅离子(Pb2+)溶液的加入体积均相同且≤1％的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行反应，分别得到1-5号反应后的溶液。在Pb2+的作用下，17EB能够催化断裂其互补底物17SF，并使名称为17SFF的含有荧光基团的17SF的断裂片段释放到溶液中。
3.分别将1-5号反应后的溶液通入17PS探针芯片中，测定0-900s时间范围内反应后的溶液与17PS探针芯片作用产生的荧光信号，反应后的溶液中以游离状态存在的17SFF能够与17PS探针芯片表面固定的17PS探针中的名称为17SFFC的片段杂交，形成双链，利用全光纤倏逝波生物传感器进行铅离子(Pb2+)检测。在激光引起的倏逝波激发下，结合在17PS探针芯片表面的双链产生荧光信号，并为仪器所检测，将不同时间产生的荧光信号进行收集，考虑到Pb2+与17EB-17SF杂交液中的反应时间，完成单次检测的全过程需时少于20min。
4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图2所示，图2中a为浓度为0、3.4、6.67、8.34和10.0μM的Pb2+的实际检测图，随着铅离子浓度的增加，每个浓度的Pb2+检测的最强荧光信号强度是逐渐增大的。
将浓度为0、3.4、6.67、8.34和10.0μM的Pb2+检测的最强荧光信号强度作为纵坐标，Pb2+浓度值作为横坐标拟合得到趋势线：y＝62.32x+123.58，R2＝0.99。根据最低检测限为仪器信噪比3倍的原则，计算出Pb2+的最低检测限为20nM。
实施例2、不同金属离子的选择性检测
一、制备17PS探针芯片
制备方法同实施例1。
二、17PS探针芯片的应用
用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
含有17EB-17SF的的杂交液的制备方法同实施例1。
检测步骤：
1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
2、分别向1-12号试管中各加入300μL的含有17EB-17SF的杂交液，然后将10μMPb2+溶液，10μMFe2+溶液，10μMMn2+溶液，10μMAl3+溶液，10μMFe3+溶液，10μMAg+溶液，10μMCd2+溶液，10μMCo2+溶液，10μMCu2+溶液，10μMZn2+溶液，10μMMg2+溶液和10μMCa2+溶液依次加入到1-12号含有300μL的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中各金属离子溶液的加入体积均相同且≤1％的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行反应，分别得到1-12号反应后的溶液。其中Pb2+母液为草酸铅溶液，Fe2+母液为硝酸亚铁溶液，Mn2+母液为硝酸锰溶液，Al3+母液为硝酸铝溶液，Fe3+母液为硝酸铁溶液，Ag+母液为硝酸银溶液，Cd2+母液为氯化镉溶液，Co2+母液为氯化钴溶液，Cu2+母液为硝酸铜溶液，Zn2+母液为硝酸铅溶液，Mg2+母液为硝酸镁溶液，Ca2+母液为硝酸钙溶液。
3.将1-12号反应后的溶液分别通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行检测17PS探针芯片对不同金属离子的选择性，收集0-900s时间范围内荧光信号，并进行结果分析，利用最强荧光信号强度计算信号强度比率。信号强度比率(％)＝(待测金属离子的最强荧光信号强度/10μMPb2+的最强荧光信号强度)×100％。
4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图3所示，发现11种金属离子相对于Pb2+的信号强度比率均小于10％，干扰性可以忽略，该探针芯片对于Pb2+检测具有良好的选择性。
实施例3、浓度为10μM的铅离子(Pb2+)溶液的重复性检测
一、制备17PS探针芯片
制备方法同实施例1。
二、17PS探针芯片的应用
用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
含有17EB-17SF的杂交液的制备方法同实施例1。
检测步骤：
1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
2、将浓度为10μM的铅离子(Pb2+)溶液加入到含有300μL的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中浓度为10μM的铅离子(Pb2+)溶液的加入体积≤1％的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行反应，得到反应后的溶液，对照为加入等体积的蒸馏水替代浓度为10μM的铅离子(Pb2+)溶液。
3.将反应后的溶液的通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器进行17PS探针芯片对于铅离子(Pb2+)的检测，收集0-900s时间范围内荧光信号。
4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片，完成第1次检测。
5、重复步骤1-4，共重复14次，完成第2-15次检测。
利用最强荧光信号强度计算信号强度比率。信号强度比率(％)＝(单次信号强度/信号强度的平均值)×100％。
结果如图4所示，17PS探针芯片对于铅离子(Pb2+)检测具有很好的重复性。按上述检测步骤，对于浓度为10μM的Pb2+进行15次检测的实验分析结果表明，数据具有良好的一致性，该探针芯片重复性好。
实施例4、饮用水中铅离子(Pb2+)的检测
一、制备17PS探针芯片
制备方法同实施例1。
二、17PS探针芯片的应用
用于本实施例的全光纤倏逝波生物传感器见中国专利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
含有17EB-17SF的的杂交液的制备方法同实施例1。
含铅离子(Pb2+)饮用水的配制：取丹江口水库水，将其过0.22μm的过滤膜，得到过滤水；在1000mL过滤水加入浓度为1M的HNO3溶液调节pH至1，得到HNO3酸化水样，将浓度为1000mg/L的铅离子(Pb2+)标准溶液(采用浓度为0.1M的硝酸溶液配制的铅离子(Pb2+)标准溶液)加入到HNO3酸化水样中，配置成铅离子(Pb2+)浓度梯度分别为0μM的HNO3酸化水样，1.67μM的HNO3酸化水样，3.34μM的HNO3酸化水样，6.67μM的HNO3酸化水样和10μM的HNO3酸化水样。
检测步骤：
1、将步骤一制备的17PS探针芯片装入全光纤倏逝波生物传感器中。
2、分别向1-5号试管中各加入300μL的含有17EB-17SF的杂交液，将含不同浓度铅离子(Pb2+)的HNO3酸化水样依次加入到1-5号含有300μL的含有17EB-17SF的杂交液的试管中，其中含不同浓度铅离子(Pb2+)的HNO3酸化水样的加入体积均相同且≤1％的含有17EB-17SF的杂交液的体积，室温(20-30℃)静置8min进行反应，分别得到1-5号反应后的溶液。
3、将1-5号反应后的溶液分别通入17PS探针芯片中，利用全光纤倏逝波生物传感器检测含不同浓度铅离子(Pb2+)的HNO3酸化水样中铅离子(Pb2+)的浓度，收集0-900s时间范围内荧光信号，利用最强荧光信号强度进行结果分析。
4、检测完成后分别用饱和尿素溶液、0.2％(质量百分含量)SDS水溶液洗涤使用后的17PS探针芯片以去除靶标，使用高纯水和浓度为10mM的Tris-HAc缓冲液(pH＝7.4)再生芯片。
结果如图5所示，将浓度为0、1.67、3.34、6.67和10.0μM的Pb2+检测的最强荧光信号强度作为纵坐标，Pb2+浓度值作为横坐标拟合得到趋势线：
y＝44.02x+82.21,R2＝0.98，具有很好的线性关系，表明该方法适用于实际水样检测。
Claims (9)
1.一种铅离子的检测方法，其特征在于：所述方法利用Pb2+诱导脱氧核酶催化与其互补的底物链发生断裂的原理，在20-30℃使含有Pb2+的待测样品中的Pb2+诱导名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶催化与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸发生断裂，得到名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
2.一种铅离子的检测方法，其特征在于：所述方法包括：
1)制备含有17EB-17SF的杂交液；所述17EB-17SF是由名称为17EB的荧光淬灭基团标记脱氧核酶和与所述17EB互补的名称为17SF的含有所述17EB识别位点的荧光基团标记的单链核酸制成的双链DNA，所述杂交液中不含游离状态的所述17SF；
2)在20-30℃，将待测样品与所述含有17EB-17SF的杂交液混合，在Pb2+诱导下，所述17EB催化所述17SF发生断裂，得到含有名称为17SFF的含有荧光基团的所述17SF的断裂片段的反应液，将所述17SFF与表面固定了名称为17PS的探针的芯片进行杂交反应，检测反应后芯片的荧光强度，根据所述荧光强度确定所述待测样品中Pb2+的浓度；
所述17PS中的单链DNA由连接臂和名称为17SFFC的片段组成，所述17SFFC与所述17SFF互补，所述连接臂与所述17SFFC和所述17SFF均不互补。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含有17EB-17SF的杂交液由溶剂和溶质组成，所述溶剂为pH7.2-7.4，浓度为10-50mM的Tris-HAc缓冲液；所述溶质为所述17EB-17SF和NaNO3，所述17EB-17SF在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为20-50nM，NaNO3在所述含有17EB-17SF的杂交液中的浓度为30-300mM。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述脱氧核酶为8-17DNAzyme。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述荧光淬灭基团在所述17EB中的位置和所述荧光基团在所述17SF中的位置满足所述17EB与所述17SF能形成所述17EB-17SF。
6.根据权利要求1-5中任一所述方法，其特征在于：所述荧光基团为羧基荧光素FAM、花青素荧光染料Cy3、花青素荧光染料Cy5和花青素荧光染料Cy5.5中任一种；所述荧光淬灭基团为荧光淬灭基团BHQ1，荧光淬灭基团Dabcyl、荧光淬灭基团BHQ2和荧光淬灭基团BHQ3中任一种。
7.根据权利要求1-6中任一所述方法，其特征在于：所述铅离子的检测方法中，所述待测样品为环境样品。
8.根据权利要求1-7中任一所述方法，其特征在于：所述荧光强度通过倏逝波检测仪器进行检测。
9.权利要求1-8中任一所述方法在检测环境样品中铅离子含量中的应用。
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