CN112662667B - 修饰的脱氧核酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种经修饰的脱氧核酶或其衍生物，该脱氧核酶或其衍生物具有更高催化效率和金属离子选择性。还涉及所述脱氧核酶或其衍生物在制备用于检测金属离子的传感器或芯片中的用途，以及在制备基因治疗药物中的用途。

Description

修饰的脱氧核酶及其用途

技术领域

本发明涉及修饰的脱氧核酶及其用途。

背景技术

8-17脱氧核酶是一个从核酸序列库筛选而来的具有催化功能的核酸DNA分子，其结构式如图1中(A)所示[Santoro,S.W.and Joyce,G.F.(19.97)A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94,4262–4266.]，它能催化裂解互补RNA的特定磷酸二酯键，例如切割图1中靶RNA序列中的GA连接。其他类似的脱氧核酶结构如图1中(B)所示，属于8-17脱氧核酶家族。8-17脱氧核酶家族的催化反应都有赖于金属离子的参与，因而是金属离子依赖的脱氧核酶。这类脱氧核酶的结构域有15-16个碱基，分别为T21，三个碱基对组成的茎部结构(stem)，A6G7C8组成的末端环状结构(end loop)和A12C13G14A15组成的大环结构(bulge loop)。8-17脱氧核酶家族成员的区别在于大环结构的不同，因而赋予它们不同的金属离子依赖性和催化活性。例如，被Ca²⁺和Mg²⁺所活化的脱氧核酶Mg5，结构区别在于W＝A,R＝A,和A16)[Peracchi,A.(2000)Preferentialactivation of the 8–17deoxyribozyme by Ca²⁺ ions.J.Biol.Chem.,275,11693–11697.]，Zn²⁺-依赖的脱氧核酶17E，其结构式如图1(C)所示，结构区别在于W＝T,R＝A,和A16.1[Li,J.,Zheng,W.,Kwon,A.H.and Lu,Y.(2000)In vitro selection andcharacterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleavingdeoxyribozyme.Nucleic Acids Res.,28,481–488.]。

这类脱氧核酶的潜在用途包括两大类。一类是基于这些脱氧核酶的催化反应依赖于金属离子，所以发展了基于这些脱氧核酶的生物传感器，测定某些金属离子在特定人细胞内的含量，在环境、食品等物质中的含量，是目前正在大力发展的一类传感器。另一类是基于它们对于互补RNA的裂解，用于致病性RNA的裂解，作为基因治疗的候选药物，致病性RNA包括病毒和细菌的RNA，各种疾病发生发展过程中过表达的RNA(转移RNA，各种小RNA等)。因此，提高这类脱氧核酶的催化能力和对于金属离子的选择性是实现其潜在应用价值的关键所在。

提高这类脱氧核酶的催化能力和金属离子的选择性主要有两个策略，一是继续筛选新的核酸库，并对核酸库进行改造，但因为修饰核苷酸在筛选过程中的循环复制效率低于天然核苷酸，目前所获得的新型脱氧核酶比较少，其催化能力也有限。另一种方法是对已有的脱氧核酶进行化学改造。就8-17脱氧核酶系列而言，文献报道的化学修饰主要是四个天然碱基的替换，结构修饰较少，没有获得更高催化效率的新结构。但基于这些修饰，获得了对于催化结构域的认识。

对于8-17和17E两个脱氧核酶的催化结构域进行了突变修饰，即用天然碱基替换每个碱基，根据其对于脱氧核酶催化活性的影响，表明T2.1，A6G7C8和C13G14是高度保守的碱基，它们的突变或者缺失导致催化活性的完全丧失，只有C8被T的取代带来的损失较小，为5-10倍的损失[Peracchi,A.,Bonaccio,M.and Clerici,M.(2005)A mutationalanalysis of the 8–17 Deoxyribozyme core.J.Mol.Biol.,352,783–794.]。因为催化效率的提高和对于金属离子的选择性都是决定传感器灵敏度和基因治疗药物效价的关键因素，但目前还没有报道更好的修饰方法。

目前，8-17和17E脱氧核酶已经用于金属离子的检测，在脱氧核酶或者靶的末端(3’-端或者5’-端)引入指示剂，如荧光基团，可用于检测细胞、血清中的金属离子，如Pb²⁺，Zn²⁺。人体内丰度最高的两种离子Mg²⁺和Ca²⁺具有重要的生理意义，例如血清、尿、细胞内的这两种离子浓度，它们的浓度变化与多种疾病具有密切的关系，因此发展检测它们各自浓度的方法具有重要的临床意义。基于8-17脱氧核酶的生物传感器为这两种离子的检测提供了一种潜在的方法。但目前的8-17脱氧核酶系列都对Ca²⁺和Mg²⁺有相近的依赖性[Zhou,W.,Zhang,Y.,Ding,J.and Liu,J.(2016)In vitro selection in serum:RNA-cleavingDNAzymes for measuring Ca²⁺ and Mg²⁺.ACS Sens.,1,600-606.]。

8-17脱氧核酶在基因治疗药物研究上的报道很少，主要原因是其催化速率不如10-23脱氧核酶。

因此，要发挥8-17脱氧核酶的巨大应用价值，需要进一步优化其结构，提高催化速率和对于金属离子的选择性。

发明内容

本发明针对8-17脱氧核酶家族进行化学结构优化，针对其催化结构域的所有腺嘌呤碱基进行结构改造，获得了具有更高催化效率和金属离子选择性的脱氧核酶。

因此，在一个方面，本发明涉及一种脱氧核酶或其衍生物，其中所述脱氧核酶的序列为：

其中：N_x和N_y分别为脱氧核酶的底物识别序列或靶RNA识别序列，由x或y个碱基组成，其碱基序列与底物序列或靶RNA序列互补配对，其碱基序列的组成和长度根据底物序列或靶RNA序列确定，例如x和y各自独立地为5～20之间的自然数，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20，所述碱基为腺瞟呤(A)、鸟瞟呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，

所述脱氧核酶序列中的1为1或1’所示的核苷酸残基，4为4或4’所示的核苷酸残基，5为5或5’所示的核苷酸残基，6为6或6’所示的核苷酸残基，7为7或7’所示的核苷酸残基，

在某些实施方案中，本发明所述的脱氧核酶的序列为：

以上序列中，小写字母代表脱氧核酶的识别序列，大写字母代表脱氧核酶的催化结构域组成。

在另一方面，本发明涉及所述的脱氧核酶或其衍生物在制备用于检测金属离子的传感器或芯片中的用途。

在某些实施方案中，本发明所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺或Mn²⁺。

在另一方面，本发明还涉及所述的脱氧核酶或其衍生物在制备基因治疗药物中的用途。

在另一方面，本发明还涉及一种芯片或传感器，所述芯片或传感器中包含：

a)本发明所述的脱氧核酶或其衍生物，或者

b)经指示剂修饰的本发明所述的脱氧核酶或其衍生物，

或者所述芯片或传感器，其由本发明所述的脱氧核酶或其衍生物制备而成。

在某些实施方案中，本发明所述的脱氧核酶或其衍生物可作为一种原材料用于制备所述的芯片或传感器。

在某些实施方案中，本发明所述的指示剂为能够产生检测信号的基团，例如荧光基团、放射性基团、纳米金离子或能够产生电信号的基团。在某些实施方案中，经指示剂修饰的所述脱氧核酶或其衍生物与底物结合后，遇到金属离子，底物发生断裂，指示剂修饰的所述脱氧核酶得到释放，检测信号发生变化。测量信号变化情况，可以对金属离子进行定性或定量。

在另一方面，本发明还涉及一种检测金属离子的方法，包括：

(1)提供待测样品；

(2)使待测样品与本发明所述的芯片或传感器接触，产生检测信号；

(3)测量信号的变化。

在另一方面，本发明还涉及一种组合物，其包含本发明所述的脱氧核酶或其衍生物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明所述的脱氧核酶或其衍生物，或者

其包含经指示剂修饰的本发明所述的脱氧核酶或其衍生物。

本发明所述的载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明所述的赋形剂是指在药物制剂中除主药以外的附加物。其性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；口服液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂，等等。

本发明所述的组合物可按本领域常规方法制备成各种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒剂或注射剂等，经例如口服或非肠道等途径给药。

另外需要指出，本发明所述的脱氧核酶作为基因治疗药物，其使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断等等因素。优选的使用剂量介于0.0001－1000mg/kg体重/天。该日剂量可以视情况一次或分多次给予。

本发明的有益效果

本发明提供的脱氧核酶具有更高的催化效率和金属离子选择性。可以应用于生物传感器或芯片的制备，或作为基因治疗的候选药物。

附图说明

图1为8-17脱氧核酶家族的结构示意图，其中(A)为8-17脱氧核酶的结构示意图，(B)为8-17脱氧核酶的变异体的结构示意图，(C)为17E脱氧核酶的结构示意图，N为靶标RNA的碱基组成，N’为脱氧核酶的识别臂，N’与N为互补关系，W＝A或T,R＝A或G。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，但并不以此来限定本发明的保护范围。下面实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的进行。所用原料未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1脱氧核酶系列的合成

表1的脱氧核酶序列中，1、4、5、6、7所代表的核苷酸残基以脱氧核糖-磷酸骨架链接在脱氧核酶中。为实现对脱氧核酶的修饰，在合成时，1、4、5、6、7所代表的核苷酸残基需以脱氧核苷的形式为出发点，其结构式如1Q、4Q、5Q、6Q、7Q所示，按照核酸DNA固相合成方法时，需以亚磷酰胺单体形式进行合成，亚磷酰胺单体形式的结构如1P、4P、5P、6P、7P所示。结构式中的Boc代表叔丁氧羰酰基，DMT代表4,4'-二甲氧基三苯基甲基。

化合物1Q、4Q、5Q、6Q、7Q及1P、4P、5P、6P、7P可以根据现有技术进行合成，例如化合物1Q和1P可参照文献[Zhu,J.,Li,Z.,Wang,Q.,Liu,Y.and He,J.(2016)The contributionof adenines in the catalytic core of 10-23 DNAzyme improved by the 6-aminogroup modifications.Bioorg.Med.Chem.Lett.,26,4462–4465.]或[杜闪闪，硕士毕业论文：10-23脱氧核酶的催化结构优化与催化机制研究，论文编号2015021302，P24-27，2018年，贵州大学，中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]记载的方法合成；化合物4Q、4P可参照[杜闪闪，硕士毕业论文：10-23脱氧核酶的催化结构优化与催化机制研究，论文编号2015021302，P27-32，2018年，贵州大学，中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]或[柴智龙，硕士毕业论文：嘌呤核苷类似物在10-23脱氧核酶功能优化中的应用研究，论文编号2016021319，P29-40，2019年，贵州大学。中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]记载的方法合成；化合物5Q、5P可参照[柴智龙，硕士毕业论文：嘌呤核苷类似物在10-23脱氧核酶功能优化中的应用研究，论文编号2016021319，P29-40，2019年，贵州大学，中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]记载的方法合成；化合物6Q和6P可参照[李阳，硕士毕业论文：10-23脱氧核酶的结构优化与稳定性研究，论文编号2015021293，P20-25，2018年，贵州大学，中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]记载的方法合成；化合物7Q和7P可参照文献[Lermer,L.,Hobbs,J.and Perrin,D.M.(2002)Incorporation of 8-histaminyldeoxyadenosine[8-(2-(4-imidazolyl)ethylamino)-2’-deoxyriboadenosine]into oligodeoxyribonucleotides by solid phasephosphoramidite coupling.Nucleosides Nucleotides&Nucleic Acids,21,651–664.]或[柴智龙，硕士毕业论文：嘌呤核苷类似物在10-23脱氧核酶功能优化中的应用研究，论文编号2016021319，P29-40，2019年，贵州大学，中国知网：中国优秀硕士学位论文全文数据库]记载的方法合成。

本实施例采用核酸DNA固相合成法合成表1中所示的脱氧核酶，方法如下所述。

(1)根据表1中所示脱氧核酶序列的组成，选择CPG树脂，使用含3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液将核苷单体5’-OH上的DMTr基团脱除掉，使其处于游离状态。

(2)利用四氮唑处理亚磷酰胺单体，使亚磷酰胺单体上一个二异丙胺基团质子化为良好的离去分子，然后用处理过的亚磷酰胺单体与核苷单体上5’-OH缩合反应，非天然核苷的亚磷酰胺单体的反应时间延长到300秒。

(3)为了保证序列合成的准确，将树脂上少量未能参与反应的核苷单体的5’-OH封闭，封闭方法是用乙酸酐和1-甲基咪唑将5’-OH乙酰化。

(4)用碘将反应产物上的亚磷酰胺氧化为磷酸三酯。

按以上步骤循环，以磷酸二酯键连接各个碱基，制成如表1所示的脱氧核酶序列。

(5)利用浓氨水将脱氧核酶序列从树脂上切割下来，继续孵育以脱除碱基和磷酸基团上的保护基，浓缩后用凝胶电泳纯化，脱盐，鉴定。

表1修饰的8-17系列脱氧核酶的质谱鉴定结果

实施例2脱氧核酶系列的催化活性

8-17系列脱氧核酶的序列如表1所示，包括8-17DZ、SEQ12-22。17E系列脱氧核酶的序列如表1所示，包括17E、SEQ23-24。底物采用DNA-RNA-DNA嵌合体的形式用于试验，即5’-d(AGG TGC AGG)-rAU-d(TG GAG AGC A)-3(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号CIRP299)。用5’-[γ-³²P]ATP标记该底物。脱氧核酶与底物的浓度比为100:1，反应体系含50mM Tris-HCl和适当浓度的金属离子，pH值保持在7.0-7.4。所采用的金属离子的浓度如表2－5中所示。

于多个时间点取样，样品用20％(质量百分比浓度)N,N-亚甲基双丙烯酰胺变性凝胶电泳分析，将未分解的底物和产物分开，电泳所采用的电压为500伏，电泳时间为8小时。将底物和产物的放射性曝光在底片上，产生的灰度作为未反应底物和产物的浓度比，根据下述的Hoofstee方程计算出表观反应速率常数。

P＝P_∞-C.exp[-k_obst]

方程中：

P表示在时间点t时的产物百分比浓度(％)；

P_∞表示反应终点时的产物百分比浓度(％)；

C表示反应终点与起始点之间的产物百分比浓度差(％)；

k_obs表示表观反应速率常数(min^-1)。

表2 8-17系列脱氧核酶的表观反应速率常数

脱氧核酶的催化活性数据如表2－5所示，其中k_obs为表观速率常数，数值越大，表示该脱氧核酶的催化能力越好，反应越快，它们在基因治疗药物和生物传感器上的应用价值越大。

结果显示，与8-17脱氧核酶原型8-17DZ相比较，经修饰的脱氧核酶，例如SEQ12、13，具有更好的催化活性，或者活性与原型8-17DZ相当，例如SEQ15、16、18、21-22(参见表2)。与17E脱氧核酶原型相比较，经修饰的脱氧核酶，例如SEQ23-24，其活性与原型17E相当。

表3不同金属离子条件下8-17系列脱氧核酶表观反应速率常数的比较

进一步地，如表3所示，将脱氧核酶SEQ12和SEQ13在Ca²⁺或Mg²⁺的存在下进行催化反应能力的比较，可以看到它们的活性有更大的改善，并且可以看到SEQ12和SEQ13对于Ca²⁺的选择性也有很大的提高，远高于原型8-17脱氧核酶。

表4不同金属离子条件下17E系列脱氧核酶的表观反应速率常数的比较

注：^ak_obs在5mM金属离子浓度测定，

^bk_obs(Ca²⁺)/k_obs(Mg²⁺)在5mM金属离子浓度时的数据比较.

与17E脱氧核酶原型比较，经修饰后，脱氧核酶SEQ23和SEQ24的催化反应能力在Mg²⁺-介导的反应中有所下降，但在Ca²⁺-介导的反应中大大提高(参见表4)。尤其是SEQ23，它对于Ca²⁺的选择性提高到55.3倍，远高于原型17E脱氧核酶。上述结果显示，SEQ23对于Ca^{2 +}的敏感性比原型结构17E脱氧核酶更高，对于发展Ca²⁺-传感器具有重大的应用价值。

表5金属离子浓度对于脱氧核酶的催化速率的影响

注：^a反应很慢k_obs<0.0001，

^b反应太快，本方法不能精确测定其k_obs.

为了进一步比较SEQ23对于Ca²⁺和Mg²⁺的敏感性，在0.625mM到20mM的浓度范围内，评价两种金属离子对脱氧核酶的催化速率的影响，结果见表5。结果显示，SEQ23对于Ca²⁺的敏感性要远高于Mg²⁺，而且浓度越高，差异越大，可见SEQ23对于Ca²⁺的选择性在不同浓度下是始终保持的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 修饰的脱氧核酶及其用途

<130> IDC190258

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 脱氧核酶

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<400> 10

aggatctatc cgagccggtc ganggctcca t 31

Claims (15)

1.脱氧核酶，其特征在于，所述脱氧核酶的序列为：

5’-d(N_xT CCG AGC CGG 4CG A N_y)-3’

5’-d(N_xT CCG AGC CGG ACG 4 N_y)-3’

5’-d(N_xT CCG AGC CGG TCG 1A N_y)-3’或

5’-d(N_xT CCG AGC CGG TCG A1 N_y)-3’

其中，N_x和N_y分别为脱氧核酶的底物识别序列或靶RNA识别序列，由x或y个碱基组成，其碱基序列与底物序列或靶RNA序列互补配对，其碱基序列的组成和长度根据底物序列或靶RNA序列确定，所述碱基为腺瞟呤(A)、鸟瞟呤(G)、胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)，

所述脱氧核酶序列中的1为1或1’所示的核苷酸残基，4为4或4’所示的核苷酸残基，

2.权利要求1所述的脱氧核酶，其中，x和y各自独立地为5～20之间的自然数。

3.权利要求1所述的脱氧核酶，其中，x和y各自独立地为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

4.权利要求1所述的脱氧核酶，其中所述脱氧核酶的序列为：

5’-d(agg atc taT CCG AGC CGG 4CG A ggc tcc at)-3’

5’-d(agg atc taT CCG AGC CGG ACG 4 ggc tcc at)-3’

5’-d(agg atc taT CCG AGC CGG TCG 1A ggc tcc at)-3’或

5’-d(agg atc taT CCG AGC CGG TCG A1 ggc tcc at)-3’。

5.权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶在制备用于检测金属离子的传感器或芯片中的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中所述金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺或Mn²⁺。

7.权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶在制备基因治疗药物中的用途。

8.一种芯片或传感器，所述芯片或传感器中包含：

a)权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶，或者

b)经指示剂修饰的权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶，

或者所述芯片或传感器由权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶制备而成。

9.权利要求8所述的芯片或传感器，其中所述的指示剂为能够产生检测信号的基团。

10.权利要求9所述的芯片或传感器，其中能够产生检测信号的基团为荧光基团、放射性基团、纳米金离子或能够产生电信号的基团。

11.一种非疾病诊断治疗目的的检测金属离子的方法，包括：

(1)提供待测样品；

(2)使待测样品与权利要求8-10中任一项所述的芯片或传感器接触，产生检测信号；

(3)测量信号的变化。

12.一种组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶，以及药学上可接受的辅料或赋形剂。

13.一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶，或者

其包含经指示剂修饰的权利要求1-4中任一项所述的脱氧核酶。

14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述的指示剂为能够产生检测信号的基团。

15.权利要求14所述的试剂盒，其中所述的能够产生检测信号的基团为荧光基团、放射性基团、纳米金离子或能够产生电信号的基团。

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