KR20110053911A - 지노타이핑 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지노타이핑 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 지노타입별로 부여되는 ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스를 이용한 다중지노타이핑 방법에 관한 것이다.
본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여, 파이로시퀀싱을 수행할 경우 유전형마다 독특하면서도 간결한 파이로그램을 수득할 수 있어, 바이러스 유전자, 질병 유전자, 세균유전자 및 개인식별용 유전자들을 간단하면서도 효율적으로 지노타이핑할 수 있으며, 본 발명의 지노타이핑용 프라이머는 분배형식을 사용하는 모든 시퀀싱을 이용한 지노타이핑 방법에 다양하게 응용가능하다.
본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여, 파이로시퀀싱을 수행할 경우 유전형마다 독특하면서도 간결한 파이로그램을 수득할 수 있어, 바이러스 유전자, 질병 유전자, 세균유전자 및 개인식별용 유전자들을 간단하면서도 효율적으로 지노타이핑할 수 있으며, 본 발명의 지노타이핑용 프라이머는 분배형식을 사용하는 모든 시퀀싱을 이용한 지노타이핑 방법에 다양하게 응용가능하다.
Description
본 발명은 지노타이핑 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 지노타입별로 부여되는 ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스를 이용한 다중 지노타이핑 방법에 관한 것이다.
감염성 생물체를 검출하기 위한 방법으로는 전통적인 배양방법에 의한 물리적 화학적 특징을 확인하는 방법에서 부터 시작하여 병원체의 특이적인 유전적 특성을 검출하는 방법으로 발전되어 왔으며, 유전적 특성을 검출하는 방법에는 제한단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 증폭단편 길이 다형성(AFLP) 분석, 펄스장 전기영동, 임의 프라임 중합효소 연쇄반응(AP-PCR), 반복서열-기초 PCR, 리보타이핑(ribotyping) 및 비교 핵산 서열결정법 등이 있다. 이러한 방법들은 대체로 너무 느리고, 비싸며, 재현불가능하고, 숙련된 기술을 요하기 때문에 대부분의 진단 환경에는 사용불가능하다. 상기에서 언급한 방법들은 모두 통상 번거로운 전기영동 단계가 필요하며, 병원체를 배양하여 게놈 DNA를 정제하여야 하며, 한 종류 이상의 검출대상을 함유하는 경우, 검출 결과가 제대로 나오지 않는 경우가 많다. 이러한 제약은 최근에 개발된 고밀도 마이크로어레이에의 법에 의한 검출 방법에서도 마찬가지이다(Salazar et al., Nucleic Acids Res. 24:5056-5057, 1996; Troesch et al., J. Clin. Microbiol. 37:49-55, 1999; Lashkari et al., Proc. Natil. Acad. Sci. U.S.A. 94: 13057-13062, 1997).
한편, 파이로시퀀싱은 전통적인 Sanger 법에 의한 시퀀싱과는 다르게, DNA 합성에 의하여 시퀀싱 하는 방법으로, 뉴클레오타이드가 중합되면서 방출되는 pyrophosphate를 검출하는 방법으로, Polymerization 시 ４개의 deoxynucleotide triphosphates(dNTPs)를 한번에 하나씩 순차적으로 넣어서 반응시킨다. 중합되는 dNTP에 붙어 있는 PPi는 효소반응으로 빛을 발생하고, 발생된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 dNTP의 반응 순서대로 시그널 피크를 나타내고, 그 피크는 각각의 dNTP가 반응한 수에 비례하여 높아지고 낮아지는 패턴을 나타내게 되어, 염기서열을 결정할 수 있게 하는 기술이며, 최근에는 임상시료에서 병원체에 특이적인 서열을 PCR 산물을 파이로시퀀싱을 이용하여 형성되는 파이로그램(pyrogram)으로 확인하여, 병원성균 또는 바이러스를 검출하는 방법이 사용되고 있다(Travasso, CM et al, J. Biosci., 33:73-80, 2008; Gharizadeh, B et al., Molecular and Cellular Probes, 20, 230-238, 2006; Hoffmann, C et al., Nucleic Acid Research, 1-8, 2007).
그러나, 파이로시퀀싱 기법에서는 dNTPs를 넣어주는 순서인 분배순서(dispensation order)에 따라서 시퀀싱이 진행되며, 주형에 분배순서에 없는 서열은 반응이 일어나지 않아 피크가 형성되지 않지만, 동일한 서열이 연속적으로 나오면 방출되는 빛의 양에 따라 피크 높이가 형성되는 특성을 가지고 있다. 이에 여러 종의 병원체가 동일시료 내에 존재할 경우, 염기서열의 구성에 따라 여러 개의 병원체의 염기서열의 피크가 중첩되게 나타나게 되어 파이로그램 판독을 통한 유전형 확인에 어려움이 존재하고, 특히 반복되는 서열의 개수가 증가하면 앞에 위치하는 서열의 피크가 상대적으로 낮아지는 특징이 있어 다중의 병원체가 감염되어 있을 경우 각 병원체의 감염정도에 따라 분별하고자 하는 피크를 확인하기가 어려운 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 파이로시퀀싱을 이용하여 지노타이핑을 실시하는데 있어서, 타이핑하고자 하는 유전형이 독특하면서도 간결한 파이로그램을 가지도록 하고자 예의 노력한 결과, 타이핑 대상의 특이서열과는 독립적으로 존재하면서 ID마크, 사인포스트 및 엔드마크를 가지는 ID 시퀀스를 타이핑 대상의 특이서열과 연결시켜 파이로시퀀싱하면, 유전형마다 독특하면서도 간결한 파이로그램을 얻을 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 타이핑하고자 하는 유전형들이 독특하면서도 간결한 파이로그램을 가지도록 파이로시퀀싱 하는데 유용한 ID 시퀀스를 제공하는데 있다.
본 발명은 다른 목적은 상기 ID시퀀스를 이용한 지노타이핑 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ID시퀀스를 이용한 HPV의 지노타이핑 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ID시퀀스를 이용한 KRAS 유전자 변이의 검출방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 ID시퀀스를 이용한 호흡기 바이러스의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 A(ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스:
여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고; S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하는 단일염기서열인 사인포스트이며; E는 상기 사인포스트(signpost)의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고; 및 n은 1~32의 자연수인 지노타이핑용 ID 시퀀스를 제공한다.
본 발명은 또한, ID-S로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스:
여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고; 및 S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트인 지노타이핑용 ID 시퀀스를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 ID 시퀀스에 지노타이핑용 유전자 특이서열이 연결되어 있는 지노타이핑용 프라이머를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 지노타이핑 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 각각의 HPV 바이러스의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 바이러스 유전자 타입의 특이 서열로 구성되는 지노타이핑용 프라이머를 제작하는 단계: (c) HPV 바이러스를 함유하는 샘플을 상기 지노타이핑용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, HPV의 유전자 타입을 구별하는 단계를 포함하는 HPV의 지노타이핑 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 각각의 KRAS의 유전자 변이종류에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 유전자 변이에 특이적인 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계:(c) KRAS 유전자를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, KRAS 유전자의 변이를 검출하는 단계를 포함하는 KRAS 유전자 변이의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 각 호흡기 바이러스 유전자의 특이 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계: (c) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43로 구성된 군에서 선택되는 호흡기바이러스를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, 호흡기 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 ID 시퀀스를 이용하면, 유전형마다 독특하면서도 간결한 파이로그램을 수득할 수 있어, 바이러스 유전자, 질병 유전자, 세균유전자 및 개인식별용 유전자를 간단하면서도 효율적으로 지노타이핑할 수 있다.
도 1은 분배순서에 따라 파이로시퀀싱이 수행되는 과정 및 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 2는 분석 서열에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 3은 분석 서열에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 4는 사인포스트의 삽입에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 5는 2가지 분석서열이 혼합되어 있을 때의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 6은 분배순서에서 사인포스트의 유무에 따른 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 7은 사인포스트 후방의 서열변화에 따른 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 8은 엔드마크가 없는 경우의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 9는 엔드마크가 있는 경우의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 10은 사인포스트 순서의 변화에 따른 분배순서의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 분배순서에 따른 ID 시퀀스 디자인 방법을 나타낸 것이다.
도 12는 분배순서의 디자인 방법을 나타낸 것이다.
도 13은 분배순서에 따라 ID 시퀀스가 나타내는 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 14는 분배순서를 결정한 후 ID 시퀀스를 디자인하는 방법을 나타낸 것이다.
도 15는 분배순서에 따라 나타나는 ID 시퀀스의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 HPV를 지노타이핑하는 방법을 나타낸 것이다.
도 17은 일반적인 KRAS 변이 검출 시스템을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 변이를 검출하는 방법을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 15종의 HPV를 지노타이핑한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 ID시퀀스를 이용하여 2종이상의 다중 HPV를 지노타이핑한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 다중 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 대장암 조직에서 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용한 호흡기 바이러스 감염 검출방법을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 5종의 호흡기 바이러스의 단일감염 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 5종의 호흡기 바이러스의 다중감염 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 분석 서열에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 3은 분석 서열에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 4는 사인포스트의 삽입에 따른 파이로그램의 피크변화를 나타낸 것이다.
도 5는 2가지 분석서열이 혼합되어 있을 때의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 6은 분배순서에서 사인포스트의 유무에 따른 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 7은 사인포스트 후방의 서열변화에 따른 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 8은 엔드마크가 없는 경우의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 9는 엔드마크가 있는 경우의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 10은 사인포스트 순서의 변화에 따른 분배순서의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 분배순서에 따른 ID 시퀀스 디자인 방법을 나타낸 것이다.
도 12는 분배순서의 디자인 방법을 나타낸 것이다.
도 13은 분배순서에 따라 ID 시퀀스가 나타내는 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 14는 분배순서를 결정한 후 ID 시퀀스를 디자인하는 방법을 나타낸 것이다.
도 15는 분배순서에 따라 나타나는 ID 시퀀스의 파이로그램을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 HPV를 지노타이핑하는 방법을 나타낸 것이다.
도 17은 일반적인 KRAS 변이 검출 시스템을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 변이를 검출하는 방법을 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 15종의 HPV를 지노타이핑한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 ID시퀀스를 이용하여 2종이상의 다중 HPV를 지노타이핑한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 다중 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 대장암 조직에서 KRAS 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용한 호흡기 바이러스 감염 검출방법을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 5종의 호흡기 바이러스의 단일감염 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 5종의 호흡기 바이러스의 다중감염 검출 결과를 나타낸 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 A(ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스 (여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고; S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며; E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고; 및 n은 1~32의 자연수)인 지노타이핑용 ID 시퀀스에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 ID-S로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스 (여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고; 및 S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트인 지노타이핑용 ID 시퀀스에 관한 것이다.
본 발명의 "ID 시퀀스"는 각 유전자가 고유하게 보존하고 있는 특이적 서열이 아니며, 본 발명에 따른 지노타이핑 방법에 있어서, 각 유전자 타입마다 독특하게 부여할 수 있는 인위적으로 제작된 염기서열을 말한다.
본 발명에서 상기 "인접한 ID 마크"는 사인포스트의 전방 또는 후방에 위치한 ID 마크를 의미한다.
본 발명의 ID 시퀀스는 파이로시퀀싱 수행 시에, 파이로그램이 다음에 나오는 서열에 의해 영향 받지 않고 독특한 위치에 피크가 형성되도록 하는 사인포스트(Signpost)와 엔드마크(EndMark)를 이용하여, 정해진 분배순서(dispensation order)에 따라 단일염기서열(one nucleotide)로 구별되도록 하기위하여 사용된다.
이 과정에서 분배순서에 따라 개개의 독특한 피크를 형성하는 단일염기서열을 ID 마크라 하고, ID 마크가 단일피크를 형성하기 위하여 필요한 서열인 사인포스트와 엔드마크를 포함하는 서열을 ID 시퀀스라 하였다. 1개의 사인포스트(Signpost)와 한 개의 엔드마크(EndMark)를 이용해서 ID 마크 다음에 나오는 유전자의 서열에 영향을 받지 않게 되는 ID 마크는 3종류가 될 수 있으며, 따라서, 지노타이핑할 수 있는 개수는 3종류이다. 3종류 이상의 다중 유전형 검사(multiple genotyping)를 수행하기 위해서는 사인포스트와 ID마크를 추가하면 된다.
일반적인 파이로시퀀싱에서는 분배서열에 따라 시퀀싱이 진행되며, 주형에 분배서열(dispensation order: DNA 합성시 뉴클레오티드가 들어가는 순서)에 없는 서열이 있으면, 반응이 일어나지 않아 피크가 형성되지 않지만, 동일한 서열이 연속적 존재하면, 방출되는 빛의 양에 따라 피크의 높이가 형성되는 특성을 가지고 있다 (도 1).
한 개의 염기를 분석서열로 이용하면 파이로그램 상에서 4가지의 서로 다른 피크로 구별할 수 있으리라 생각되나, 실제로는 분석서열 다음에 오는 서열은 A, T, G, C 중 하나이기 때문에, 적어도 한가지의 경우에서는 다중 피크(동일한 서열이 반복해서 올 경우, 하나의 큰 다중피크를 형성함)를 형성할 수밖에 없게 되므로, 결과적으로, 단일 염기로 단일 피크를 구별할 수 있는 방법은 최대 3가지 밖에 존재하지 않는다 (도 2).
또한, 분석 서열이후에 나오는 서열에 의하여 원하지 않는 피크가 형성되게 되며, 분석 서열이후에 반복된 염기가 연속적으로 있을 경우, 중합반응이 한꺼번에 일어나기 때문에 단일 피크가 형성되나, 이 반응에서 발생하는 발광양이 증가하기 때문에, 피크의 높이가 비례적으로 증가하는 특성을 가지며, 이와 같은 반복 서열이 있을 경우 상대적으로 단일염기로 존재하는 피크의 높이는 감소하는 현상이 나타나게 된다 (도 3). 이러한 문제점 때문에, 단일염기를 이용한 다중 지노타이핑에 한계가 존재하며, 이를 해결하기 위하여, 본 발명의 ID 시퀀스에서는 다음에 위치하는 서열에 의하여 분석되는 서열의 피크가 영향을 받지 않도록, "분석서열"을 분리시키고, 다음 추가적인 분석이 가능하도록 하게하는 분리서열을 "사인포스트(signpost)"라 명명하였다 (도 4).
또한 상기 사인포스트 서열에 따라 파이로시퀀싱의 분배순서(dispensation order)의 설정이 달라지게 된다.
2 염기로 구성된 하나의 분석서열에서 1개의 염기서열을 사인포스트로 설정하면, 나머지 1개의 염기서열 자리에 3개의 염기가 각각 위치할 수 있으며(동일한 서열이 올 경우는 피크가 중첩되기 때문에, 사인포스트로 배정된 1개의 염기를 제외한 3개의 염기가 나머지 하나의 염기자리에 위치할 수 있음), 사인포스트 앞에 위치한 염기는 도 4와 같이 분석서열 이후에 나오는 서열에 영향을 받지 않고 피크를 독립적으로 분리가 가능하도록 설정할 수 있다.
상기 분석서열에서 사인포스트에 의해 분리된 단일 염기를 "ID 마크(ID mark)"라 명명하며, 도 4에 나타난 바와 같이 1개의 ID 마크와 1개의 사인포스트를 이용하여 3가지 타입에 대한 다중 지노타이핑이 가능하게 된다. 이때, 분배순서(dispensation order)에서 사인포스트의 위치는 ID 마크의 뒤에 위치하도록 한다 (사인포스트의 앞에 위치한 ID 마크만이 분석서열이후에 나오는 후방서열에 영향을 받지 않기 때문).
본 발명의 일 양태로, 단일염기의 ID마크와 1개의 사인포스트로 이루어진 2염기의 분석서열을 지노타이핑하기 위하여, 도 5에 나타난 바와 같이, 타입 1(분석서열: AC), 타입 2(분석서열:TC) 및 타입 3(분석서열: GC)의 분석서열을 합성하고, 파이로시퀀싱 하여. 타입 1에서는 분배서열에 따라 분배서열 1번에 A의 피크가 나타나고, 분배서열 4에 C의 피크가 나타나게 되고, 타입 2에서는 분배서열 2에 T의 피크가 나타나고, 분배서열 4에 C의 피크가 나타나게 된다. 타입 3에서는 분배서열 3에 G의 피크가 나타나고, 분배서열 4에 C의 피크가 나타나게 된다. 여기서, 분석서열 중 첫 번째 염기의 서열인 A, T, G는 각각 ID 마크이고, 분석서열 중 두 번째 염기 서열인 공통된 C는 사인포스트이다.
상기 3타입의 분석서열을 다중지노타입핑 하기 위하여, 도 5의 (a)에 나타난 바와 같이, 타입 1(분석서열: AC)과 타입 2(분석서열:TC)를 혼합된 샘플을 A→T→G→C의 분배서열(dispensation order)로 파이로시퀀싱한 결과, 분배서열 1에서 A 피크가 나타나고, 분배서열 2에서 T의 피크가 나타나며, 분배서열 3에서는 피크가 나타나지 않고, 분배서열 4에서는 사인포스트인 C의 피크가 나타나게 되며, 이때 사인포스트인 C의 타입1과 타입2 두 가지 타입에서 모두 반응하여 나오므로, A와 T의 피크보다 2배의 크기로 나타나게 된다.
마찬가지로, 도 5의 (b)에서, 타입 1(분석서열: AC)과 타입 3(분석서열:GC)이 혼합된 샘플에서는 분배서열 1에서 A 피크가 나타나고, 분배서열 3에서 G의 피크가 나타나며, 분배서열 2에서는 피크가 나타나지 않고, 분배서열 4에서는 사인포스트인 C의 피크가 나타나게 되며, 이때 사인포스트인 C의 피크는 2배로 두 가지 타입에서 모두 존재하므로, 반응이 2 배로 나타나 피크크기도 2배가 되게 된다.
또한, 도 5의 (c)에서, 타입 2(분석서열: TC)와 타입 3(분석서열:GC)이 혼합된 샘플에서는 분배서열 2에서 T 피크가 나타나고, 분배서열 3에서 G의 피크가 나타나며, 분배서열 1에서는 피크가 나타나지 않고, 분배서열 4에서는 사인포스트인 C의 피크가 나타나게 되며, 이때 사인포스트인 C의 피크는 2배로 두 가지 타입에서 모두 존재하므로, 반응이 2 배로 나타나 피크크기도 2배가 되게 된다.
따라서, 사인포스트에 의하여 ID 마크는 이후 서열과 분리되어 독립적으로 존재할 수 있어 다중 지노타이핑 시에 유용하게 사용될 수 있다.
"ID 마크"와 "사인포스트"로 구성된 분석서열을 이용한 파이로시퀀싱에서 분배서열에 사인포스트의 서열을 삽입하거나 하지 않거나 지노타이핑의 결과에는 차이가 없으나, 사인포스트의 서열을 분배서열에 삽입하지 않은 경우 기계적인 오류를 판단할 수 없는 단점이 있다 (도 6). 따라서, 분배서열에는 사인포스트의 서열을 삽입하여 파이로시퀀싱이 정상적으로 진행되었는지를 판단할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 파이로시퀀싱 시에 다중 지노타이핑 시에 ID 마크의 피크는 사인포스트의 피크보다 클 수가 없으므로, 이 또한 파이로시퀀싱의 오류를 판단하는 기준이 될 수 있다 (도 6).
엔드마크(
endmark
)
사인포스트는 단일 염기 ID 마크와 후방의 서열을 분리시켜 ID 마크 피크가 후방서열의 영향을 받지 않도록 하는 역할을 한다. 그러나, 사인포스트 또한 후방에 오는 서열이 사인포스트와 동일할 경우에 검출되는 발광양이 증가로 인한 피크의 높이가 비례적으로 증가하기 때문에, 이로 인하여, 전방의 ID 마크의 피크 높이가 달라지는 현상이 발생할 수 있다 (도 7). 이러한 현상을 해결하기 위하여, ID 마크와 사인포스트가 다음에 연결되는 서열에 영향을 받지 않게 하기 위하여 사인포스트와는 다른 염기서열을 사인포스트의 후방에 삽입할 수 있으며, 이 때 삽입되는 서열을 "엔드마크"라 명명하고, 상기 엔드마크는 분배서열(dispensation order)에 삽입되지 않는다. 상기 "엔드마크"는 ID마크와 사인포스트가 후방에 연결되는 서열에 의하여 영향을 받지 않게 하고, 일정한 높이의 피크를 만드는 역할을 하게 된다.
즉, 엔드마크가 없는 경우는 도 8에 나타난 바와 같이, 타입 1(분석서열: AC)의 다음에 CA가 오는 경우, A→T→G→C의 분배서열(dispensation order)로 파이로시퀀싱하면, 사인포스트인 C 다음에 중복되는 C 때문에, 분배서열 1자리의 A 피크보다 분배서열 3자리의 C 피크가 커지게 된다. 마찬가지로, 타입 3(분석서열: GC)의 다음에 CC가 오는 경우에는, 사인포스트인 C 다음에 C가 3번 중복되어, 분배서열 3의 G 피크가 과도하게 커진 분배서열 4의 C 피크에 의하여 훨씬 작아지게 된다.
엔드마크가 있는 경우에는 도 9에 나타난 바와 같이, 타입 1(분석서열: AC)의 다음에 CA가 오는 경우, 그 사이에 엔드마크로 T가 삽입되어, A→T→G→C의 분배서열(dispensation order)로 파이로시퀀싱하면, 사인포스트인 C 다음에 T가 끼어들어 C가 중복되지 않으며, 분배서열 1자리의 A 피크와 분배서열 3자리의 C 피크의 높이가 일정하게 된다. 마찬가지로, 타입 3(분석서열: GC)의 다음에 CC가 오는 경우에도, 사인포스트인 C 다음에 엔드마크인 T가 삽입되어, 사인포스트 뒤에 C가중복되지 않아, 분배서열 3의 G 피크와 분배서열 4의 C 피크의 높이가 동일하게 된다.
본 발명에 있어서, 추가할 수 있는 사인포스트의 개수인 N은 2~32인 것이 바람직하며, N이 32인 경우, 65개 종류의 다중지노타이핑이 가능하다.
복수개의 ID 마크와 복수개의 사인포스트를 이용하면 3 타입 이상의 지노타이핑이 가능하다.
이때, 사인포스트 1의 염기서열과 사인포스트 2의 염기서열은 일치하지 않아야 하며, 최후방의 사인포스트의 염기서열과 엔드마크의 염기서열도 일치하지 않아야
한다.
ID 마크, 사인포스트 및 엔드마크로 구성되는 서열을 "ID 시퀀스"로 명명하였으며, 본 발명에서 ID 시퀀스는 ID 마크 및 사인포스트로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 ID 마크, 사인포스트 및 엔드마크로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 ID 시퀀스는 사인포스트가 한개 추가될 때마다 2개의 타입을 추가적으로 구별할 수 있게 된다. 따라서 2N+1(N= 사인포스트 개수)가지를 ID 마크의 위치에 따라 지노타이핑으로 구별할 수 있다.
한 개의 ID 마크와 엔드마크를 제외한 나머지 염기서열들은 사인포스트로 사용되는 염기서열로, ID 시퀀스 내의 ID 마크를 동일한 분배순서로 구별하려면 ID 시퀀스 내에서 사인포스트의 염기서열은 동일한 순서로 놓여야만 한다. 즉 ID 마크의 위치만 사인포스트의 앞이나 사이에 놓이게 되고, 사인포스트의 배열순서는 같아야만 한다. 파이로시퀀싱의 특성상 사인포스트 배열이 다르게 되면 분배순서도 달라지기 때문이다 (도 10).
ID
시퀀스
디자인
사인포스트를 정한 후
ID
시퀀스를
만들 경우
2개의 사인포스트로 구성할 경우, 먼저, T와 G를 각각 사인포스트 1 및 사인포스트 2로 사용한 다면, 사인포스트 1(T)의 앞쪽에 높이는 ID 마커는 A, G 및 C 중 어느 하나 일 수 있고, 사인포스트 1과 사인포스트 2의 중간에 위치하는 ID 마커는 A 또는 C 일 수 있으며, 엔드마커는 A, T 및 C 중 어느 하나 일 수 있다.
따라서, 도 11에 나타난 바와 같이, 상기와 같이 구성될 수 있는 ID 마커와 사인포스트, 엔드마커로 구성되는 ID 시퀀스에서 ID 마크를 1개로 하여 생성시킬 수 있는 경우는 5가지로, 사인포스트 1의 앞에 위치하는 ID 마커를 만드는 3가지 경우(A, G 및 C)와, 사인포스트 1과 사인포스트 2의 사이에 위치하는 ID 마커를 만드는 2가지 경우(A 및 C)가 있다.
이때, 엔드마크는 분배순서에 들어가지 않기 때문에, ID 시퀀스에서 엔드마크가 같거나 서로 달라도 상관이 없다.
분배순서(
dispensation
order
) 디자인
ID 시퀀스를 이용한 지노타이핑에서는 분배순서에 따라, ID 시퀀스에 위치하는 ID 마크가 순차적으로 독립적인 피크를 형성하게 되며, 분배순서는 사인포스트를 경계로 형성될 수 있는 여러 가지 순열에 따라 디자인할 수 있다.
상기 ID 시퀀스에 따라 형성될 수 있는 분배순서 중 하나는 다음과 그림과 같으며, 엔드마크는 분배순서에 들어가지 않는다.
도 12에는 상기 ID 시퀀스에 따라 가능한 12가지의 분배순서를 나타내었으며, 상기 12가지 가능한 분배순서 증 한 가지를 선택하여 사용할 수 있다.
분배순서의 개수는 4 x 6N(N= 사인포스트 개수)가지로 형성될 수 있다. 따라서, 사인포스트가 2개인 경우 144가지의 분배순서를 만들 수 있다.
따라서, 도 13에 나타난 바와 같이, ID 시퀀스는 분배순서에 따라, 고유의 피크를 가지게 된다.
분배순서를
결정후
ID시퀀스
디자인하는 방법
ID 시퀀스는 한개의 ID 마크와 1개 이상의 사인포스트 적어도 1개의 엔드마크로 구성되어 지며, 인접한 염기서열은 서로 달라야 하며, 분배순서 또한 동일한 조건을 가져야 하며, 분배순서를 먼저 결정한 후에 ID 시퀀스를 디자인할 수도 있다.
분배순서에서 사인포스트 1 앞에는 3개의 ID 마커가 놓일 수 있고, 2개의 사인포스트의 사이에는 2개의 ID 마크가 놓이게 되므로, 이 규칙을 이용하면 분배순서를 가지고 다음과 같은 ID 시퀀스를 만들 수 있다.
예를 들면, 9가지 지노타입을 분리하고자 하면, (2N+1)의 공식에 따라 4개의 사인포스트가 필요하며, 도 14에 나타난 바와 같이, 분배순서를 A, T, G, C를 n회 반복하도록 결정한 경우, 사인포스트는 C, G, T, A가 되고, 엔드마크는 T가 되며, 사인포스트의 사이에 위치한 서열이 ID 마크가 되어 ID 시퀀스를 제작할 수 있으며, 분배순서대로 파이로시퀀싱을 수행하면, 도 15에 나타난 바와 같은 결과를 얻을 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 ID 시퀀스에 지노타이핑용 유전자 특이서열이 연결되어 있는 지노타이핑용 프라이머에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 지노타이핑용 유전자 특이서열은 바이러스 유전자, 질병 유전자, 세균유전자 및 개인식별용 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 특이적인 서열인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 프라이머는 파이로시퀀싱을 용이하게 하기 위하여, 5' 말단 쪽에 시퀀싱용 프라이머서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 지노타이핑용 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 지노타이핑 방법에 관한 것이다.
본 발명의 ID시퀀스를 사용한 지노타이핑용 프라이머는 분배형식을 사용하는 모든 시퀀싱을 이용한 지노타이핑 방법에 다양하게 응용가능하며, 바람직하게는 파이로시퀀싱 방법 또는 반도체 시퀀싱 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 파이로시퀀싱 방법은 시퀀싱 과정에서 발생하는 ppi(pyrophosphate)의 분해반응에서 나오는 빛을 검출하는 방법이고, 반도체 시퀀싱(smiconductor sequencing)은 시퀀싱과정에서 발생하는 proton(H + ion)에 의한 전류변화를 chip으로 분석하는 방법이다(Andersona, Erik P. et al., Sens Actuators B Chem .; 129(1): 79, 2008).
본 발명에 있어서, (a) 지노타이핑 대상 유전자에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 상기 디자인된 ID 시퀀스에 지노타이핑용 유전자 특이서열이 연결되어 있는 지노타이핑용 프라이머를 이용하여 지노타이핑 대상 유전자 주형을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 산물을 파이로시퀀싱하여 ID 시퀀스를 시퀀싱 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 각각의 HPV 바이러스의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 바이러스 유전자 타입의 특이 서열로 구성되는 지노타이핑용 프라이머를 제작하는 단계: (c) HPV 바이러스를 함유하는 샘플을 상기 지노타이핑용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, HPV의 유전자 타입을 구별하는 단계를 포함하는 HPV의 지노타이핑 방법을 포함하는 HPV의 지노타이핑 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스 유전자 타입의 특이 서열은 서열번호 1~15로 표시되는 염기서열 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
HPV(human papilloma virus)는 사람의 피부나 점막에 감염되는 가장 일반적인 바이러스 중의 하나이며 현재까지 약 150가지 이상의 타입이 알려져 있으며, 이들 중 30여종이 성기 접촉을 통해서 감염되며, HPV 바이러스에 의한 암 발병률의 85% 정도가 자궁경부암과 관련이 있다. 성기에 감염되는 30여종의 바이러스 중 15 type 이 자궁경부암을 일으키는 고위험 군으로 알려져 있다. 자궁경부암은 우리나라의 경우 여성 암 발병률 6위에 해당하며, 세포진과 사는 감수성과 재현성이 좋지 않아리나암상태를 파악하는데 문제점이 있으며, 잦은과 사로 인한 비용 부담도 크게 작용한다. 현재까지 FDA에 허가 받은 HPV 검사 방법으로는 HybridCaptureII가 있으나, 이 방법은 HPV 감염 여부만 진단할 뿐 어떤 타입의 HPV가 감염되었는지에 대해서는 알 수 없다.
HPV는 유전형 별로 암유발률, 암 타입, 암전이 과정이 다르기 때문에 지노타이핑에 의하여 환자가 감염된 HPV의 유전형을 아는 것이 중요하다. 예로 CIN III+의 경우 HPV type 16이 55%를 차지하고, HPV type 18이 15%를 차지한다고 보고되며, 그 외 30%의 경우도 나머지 고위험군 13 타입 HPV와 관련이 있다고 보고되었다.
HPV을 지노타이핑하는 가장 중요한 이유는 유전형 특이적 HPV 감염을 모니터링 할 수 있다는 것이며, 나이 많은 여성의 경우 감염의 지속 기간이 젊은 여성보다 긴 것이 보통인데, 이는 과거에 오랜 감염 가능성이 많기 때문이다. 얼마만큼의 지속기간이 중요한지는 임상적으로 정하여 지지는 않았지만, 보통 1년 이상 지속되는 경우 위험성이 증가하는 것으로 알려져 있다. HPV 타입16, HPV 타입18을 검사하는 것이 물론 중요하지만, 가장 중요한 것은 발암성 HPV 타입의 지속적인 감염을 검사하는 것이다.
본 발명의 실시예 에서는, ID 시퀀스를 이용하여 15종의 HPV 바이러스를 지노타이핑하였다. HPV 바이러스에서 15종의 바이러스에서 특이서열을 가지는 HPV L1 부위와 9종의 ID 시퀀스 및 시퀀싱용 프라이머 부위를 함유하는 프라이머 (GT-HPV 15type primer = GT-HPV 15타입 프라이머)와 5' 바이오티닐레이티드 GP6 플러스 프라이머(5' biotinylated GP6 plus primer)를 이용하여, 각각 15종의 HPV 바이러스 게놈을 증폭시킨 PCR 산물을 파이로시퀀싱한 결과, 15종의 바이러스에 대한 15종의 ID 시퀀스의 파이로그램(pyrogram)을 얻을 수 있었다 (도 16).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 HPV 타입16에 감염된 CaSki 세포주의 게놈 DNA (genomic DNA)와 HPV 타입18에 감염된 HeLa 세포주의 게놈 DNA를 동량 혼합한 샘플을 GT-HPV 15타입 프라이머와 5' 바이오티닐레이티드 GP6 플러스 프라이머로 증폭시킨 PCR 산물을 파이로시퀀싱한 결과, 중복 피크의 간섭 없이 깨끗한 HPV 타입16 및 HPV 타입18에 해당하는 ID 시퀀스의 파이로그램을 확인할 수 있었다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 KRAS 유전자 돌연변이의 검출방법에 관한 것으로, (a) 각각의 KRAS의 유전자 변이종류에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 유전자 변이에 특이적인 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계:(c) KRAS 유전자를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, KRAS 유전자의 변이를 검출하는 단계를 포함하는 KRAS 유전자 변이의 검출방법에 관한 것이다.
Ras 유전자는 쥐에서 육종을 일으키는 레트로바이러스의 암유발 유전자 (oncogene)로 처음 발견되었으나, 1985년 췌장암 환자의 림프 절에서 K-ras의 존재가 알려진 이래, 다양한 연구가 이루어지고 있다. 이 암유전자 (oncogene)의 돌연변이는 인체의 악성 돌연변이 중에 빈번하게 발견되는 유전자중 하나이다. 이 유전자와 구조와 기능이 유사한 유전자로 H-ras, N-ras 또한 oncogene 으로 알려져 있다. K-ras의 codon12, 13, 61의 돌연변이는 단백질 활성에 영향을 주어 과다 활성을 유발하게 된다.
K-ras 유전자의 돌연변이는 소화기계의 선암(adenocarcinoma)에서 발견되며, 췌장의 선암의 경우, 췌액과 췌 장조직 등에서 90%의 돌연변이를 발견할 수 있으며, 이들 대부분이 codon 12의 변이로 알려졌으며, 대장암에서는 40 ~ 45%에서 발견되는데, 화학치료에 반응이 없는 진행된 결장암에 사용되는 cetuximab 또는 panitumumab과 같은 약물에 대한 반응성의 감소와도 연관된 것으로 알려져 있다. 또한, 5 ~ 30%의 비소세포성 폐암에서 관찰되고, 흡연력이 있는 환자에서 주로 관찰되며, EGFR 돌연변이와는 상호 배타적으로 발견된다.
야생형 KRAS 존재 하에서 codon12 (GGT>GTT), codon13 (GGC>TGC 및 GGC>GCC)의 세 종류의 돌연변이는 일반적인 pyrosequencing 방법으로는 검출한계가 있다. 특히나 codon12 (GGT>GTT) 돌연변이는 발생 빈도가 높기에 검출한계 때문에 배제하기는 어렵다 (도 17).
본 발명의 일 실시예에서는 KRAS 유전자의 codon 12 및 codon 13번의 돌연변이를 검출하는 방법을 개시하였다. 본 발명에서는 codon12 (GGT>GTT), codon13 (GGC>TGC 및 GGC>GCC)의 세 종류의 돌연변이에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머를 고안하고, 이 세 종류의 프라이머 특이적인 염기서열 앞에 고유의 ID 시퀀스를 이용하여 검출할 수 있도록 고안하였으며, 본 발명의 방법에 따르면, 4가지의 포워드 프라이머(forward primer)와 한 종류의 바이오티닐레이티드 리버스 프라이머(biotinylated reverse primer)를 이용하여 한번의 PCR 과정으로 12종류의 KRAS 돌연변이를 검출할 수 있다 (도 18).
본 발명에 있어서, 상기 KRAS 유전자 변이에 특이 서열은 서열번호 34~35로 표시되는 염기서열 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 호흡기 바이러스의 검출방법에 관한 것으로, (a) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수); (b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 각 호흡기 바이러스 유전자의 특이 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계: (c) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43로 구성된 군에서 선택되는 호흡기바이러스를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및 (d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, 호흡기 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 호흡기 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명이 일 실시예에서, 호흡기 바이러스 검출방법은 상기 5종의 호흡기바이러스에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머를 고안하고, 이 세 종류의 프라이머 특이적인 염기서열 앞에 고유의 ID 시퀀스를 이용하여 검출할 수 있도록 고안하였으며, 상기 5종의 GT-호흡기바이러스 5타입 포워드 프라이머와 5'바이오티닐레이티드 리버스 프라이머를 이용하여, cDNA를 합성한 후, GT-RespiVirus ID 프라이머와 5' biotinylated M13 reverse 프라이머를 이용하여 특이적으로 바이러스를 증폭하여 파이로시퀀싱으로 검출하는 방법이다
본 발명에 있어서, 각 호흡기 바이러스 유전자 타입의 특이 서열은 인플루엔자 A 바이러스의 경우는 서열번호 41, 인플루엔자 B 바이러스의 경우는 서열번호 42, RSV B의 경우는 서열번호 43, 리노바이러스의 경우는 서열번호 44 및 코로나바이러스 OC43의 경우는 서열번호 45로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1:
ID
시퀀스를
이용한
HPV
지노타이핑
본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 자궁경부암 원인 바이러스인 고위험군의 HPV(human papilloma virus)의 유전자를 타이핑하였다.
15가지 고위험군 HPV에 대한 ID 시퀀스를 표 1과 같이 디자인하였다.
| ID sequence | HPV 타입 |
| A GCACATG | HPV type 16 |
| T GCACATG | HPV type 58 |
| C GCACATG | HPV type 18 |
| G A CACATG | HPV type 33 |
| G T CACATG | HPV type 52 |
| GC G ACATG | HPV type 35 |
| GC T ACATG | HPV type 45 |
| GCATCATG | HPV type 51 |
| GCAGCATG | HPV type 31 |
| GCACTATG | HPV type 39 |
| GCACGATG | HPV type 56 |
| GCACACTG | HPV type 59 |
| GCACAGTG | HPV type 68 |
| GCACATAG | HPV type 66 |
| GCACATCG | HPV type 82 |
상기 15종의 ID 시퀀스의 3'말단에는 대응하는 각각 대응하는 HPV 타입에 특이적인 염기서열을 연결하고, 5' 말단에는 공통된 시퀀싱용 서열을 연결하여, 단일 시퀀싱 프라이머를 이용하여 15개의 서로 다른 ID 시퀀스를 파이로시퀀싱 할 수 있도록 하여, ID 시퀀스를 포함하는 PCR 프라이머를 제작하였다(표 2).
| GT-HPV 15타입 프라이머 구성 | |||
| 시퀀싱 프라이머 결합부위 | ID 시퀀스 | HPV 타입 특이적인 시퀀스 | |
| HPV 타입16 (서열번호 16) |
TAATACGACTCACTATAGGG | A GCACATG | TGTCATTATGTGCTGCCATATC (서열번호 1) |
| HPV 타입58 (서열번호 17) |
TAATACGACTCACTATAGGG | T GCACATG | ACTGAAGTAACTAAGGAAGG (서열번호 2) |
| HPV 타입18 (서열번호 18) |
TAATACGACTCACTATAGGG | C GCACATG | ACAGTCTCCTGTACCTGGG (서열번호 3) |
| HPV 타입33 (서열번호 19) |
TAATACGACTCACTATAGGG | G A CACATG | TATGCACACAAGTAACTAGTG (서열번호 4) |
| HPV 타입52 (서열번호 20) |
TAATACGACTCACTATAGGG | G T CACATG | TGACTTTATGTGCTGAGG (서열번호 5) |
| HPV 타입35 (서열번호 21) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GC G ACATG | TGTTCTGCTGTGTCTTCTAG (서열번호 6) |
| HPV 타입45 (서열번호 22) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GC T ACATG | CCAAGTACATATGACCCTAC (서열번호 7) |
| HPV 타입51 (서열번호 23) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCATCATG | ACTGCCACTGCTGCGGTTTC (서열번호 8) |
| HPV 타입31 (서열번호 24) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCAGCATG | CAATTGCAAACAGTGATAC (서열번호 9) |
| HPV 타입39 (서열번호 25) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACTATG | AGAGTCTTCCATACCTTCTAC (서열번호 10) |
| HPV 타입56 (서열번호 26) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACGATG | TACTGCTACAGAACAGTTAAG (서열번호 11) |
| HPV 타입59 (서열번호 27) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACACTG | TGTGCTCTACTACTCTCTATTC (서열번호 12) |
| HPV 타입68 (서열번호 28) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACAGTG | ACTACTGAATCAGCTGTACC (서열번호 13) |
| HPV 타입66 (서열번호 29) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACATAG | ACTATTAATGCAGCTAAAAGCAC (서열번호 14) |
| HPV 타입82 (서열번호 30) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GCACATCG | TGTTACTCCATCTGTTGCAC (서열번호 15) |
상기 15종의 HPV 바이러스들은 한국인 여성의 자궁경부 세포진 검체 (충남대학교 병원 산부인과)로부터 지노믹 DNA를 추출한 다음 HPV DNA chip을 이용하여 감염된 유전형을 확인하고, HPV 바이러스의 L1 유전자를 PCR 증폭하여 얻어내었다.
임상시료로부터 HPV의 감염여부를 판단하기 위한 PCR 프라이머로 GP5 플러스 프라이머와 GP6 플러스 프라이머를 이용하였다.
| 포워드 프라이머 (forward primer) | |
| GP5 플러스 프라이머 | 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3' (서열번호 31) |
| 리버스 프라이머(reverse primer) | |
| GP6 플러스 프라이머 | 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3' (서열번호32) |
상기 15종의 HPV 바이러스를 각각 주형으로 하여, 표 2에 나타난 15종의 PCR 프라이머를 동일 비율로 섞어 포워드 프라이머 (GT-HPV 15타입 프라이머)로 사용하였으며, 5' 바이오티닐레이티드 GP6 플러스 프라이머 (바이오니아, 한국)를 리버스 프라이머로 사용하여 다음 조건에서 PCR을 수행하였다:
95℃ 15분 - [95℃ (0.5분), 45℃(0.5분), 72℃(0.5분)]x 45 사이클- 72℃ (10분)-4℃ 유지.
상기 PCR 산물에는 공통적인 시퀀싱 프라이머 결합부위를 포함하고 있다. 본 실시예에서는 일반적으로 많이 사용하는 T7 프라이머 (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3')를 이용하였기에, 이 T7 프라이머를 이용하여 ID 시퀀스의 파이로시퀀싱 수행하고 파이로그램을 분석하여 HPV를 타이핑하였다 (도 19 및 도 20).
분배순서에서 HPV의 타입에 따라 형성되는 ID 마크의 위치를 도 17의 윗 그림에 나타내었으며, 붉은색으로 나타낸 피크는 ID 마크이고, 푸른색으로 나타낸 피크는 사인포스트이다.
그 결과, 15종의 바이러스에 해당하는 특이 ID 마커 부분에만 파이로그램의 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
2: 다중
HPV
지노타이핑
실시예 1에서 제작한 HPV ID 시퀀스를 이용하여, 다중 HPV 감염에 따른 지노타이핑을 확인하였다.
(1)
HPV
4가지 타입 다중 타이핑
4가지 HPV 타입 ( HPV 16, 33, 31, 66) 에 대한 게놈DNA를 주형으로 하여 각각을 GP5 플러스 프라이머와 GP6 플러스 프라이머를 이용해서 PCR로 증폭한 다음, 각 타입에 대한 PCR 산물을 1:1비율로 혼합한 혼합물을 주형으로 하여, GT-HPV 15타입 프라이머와 5' 바이오티닐레이티드 GP6 플러스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 T7 프라이머를 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다.
그 결과, 도 20의 a)에 나타난 바와 같이, 이론적으로 예측한 결과와 동일한 파이로그램을 확인할 수 있었다.
(2)
CaSki
세포주와
HeLa
세포주를 이용한
HPV
다중
지노타이핑
HPV 타입16에 감염된 CaSki 세포주 (ATCC CRL-1550™)의 게놈 DNA와 HPV 타입18에 감염된 HeLa 세포주(ATCC CCL-2™)의 게놈DNA를 동량 혼합(10 ng :10 ng)하여 주형으로 하고 GT-HPV 15타입 15타입 15타와 5' 바이오티닐레이티드 GP6 플러스 프라이머 사용하여, PCR을 수행한 후, 상기 PCR 산물을 T7 시퀀싱 프라이머를 이용하여 ID 시퀀스의 파이로시퀀싱 수행하였다.
그 결과, 도 20의 b)에 나타난 바와 같이, CaSki 세포 1개당 포함된, HPV 타입 16의 카피넘버는 약 600 카피로 알려져 있으며, HeLa 세포 1개당 포함된 HPV 타입 18의 카피넘버는 약 50카피로 알려져 있어, 이론적으로 예측한 결과와 동일한 파이로그램을 확인할 수 있었다.
(3)임상시료 (cervical scraps samples) 대상 HPV 다중 지노타이핑
자궁경부 세포검사 시료 (cervical scraps samples)에서 gDNA를 추출하여 ID sequence 를 이용한 HPV 다중 지노타이핑과 일반 시퀀싱 결과를 비교하여하여 보았을 때 다중 감염시 시퀀싱 결과가 없는 시료를 배제하고 비교해 보았을 때 두 결과가 100% 일치함을 알 수 있었다 (표 4, 표 5).
| 일치 | 대등 | 종합 |
| 68/79 (86.1%) | 11/79 (13.9%) | 79/79 (100%) |
실시예 3: ID 시퀀스를 이용한 KRAS 돌연변이 검출법
본 발명의 ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 유전자의 돌연변이를 확인하기 위하여, KRAS의 3가지 돌연변이인, codon12 (GGT>GTT), codon13 (GGC>TGC 및 GGC>GCC)에 대한 ID 시퀀스를 디자인하였다 (표 6).
| ID sequence | KRAS mutation 타입 | |
| ID1 | GTGC A GT | codon12 (GGT>GTT) |
| ID2 | GTGC T GT | codon13 (GGC>TGC) |
| ID3 | GTGCG A T | codon13 (GGC>GCC) |
또한, 상기 3종의 ID 시퀀스의 시퀀스 말단에는 각각 대응하는 KRAS변이에 특이적인 염기서열을 연결하고, 5' 말단에는 공통된 시퀀싱용 서열을 연결하여, 단일 시퀀싱 프라이머를 이용하여, 3개의 서로 다른 ID 시퀀스를 파이로시퀀싱할 수 있도록 하여, ID 시퀀스를 포함하는 PCR 프라이머를 제작하였다 (표 7).
| GT-KRAS ID 포워드 프라이머 | |||
| 시퀀싱 프라이머 결합부위 | ID 시퀀스 | KRAS변이 특이적인 시퀀스 | |
| Codon12 (GGT>GTT) (서열번호 36) |
AACTTGTGGTAGTTGGAGCT | GTGCAGT | TGGAGCTGT (서열번호 33) |
| Codon13 (GGC>TGC) (서열번호 37) |
AACTTGTGGTAGTTGGAGCT | GTGCTGT | GAGCTGGTT (서열번호 34) |
| Codon13 (GGC>GCC) (서열번호 38) |
AACTTGTGGTAGTTGGAGCT | C GCACATT | AGCTGGTGC (서열번호 35) |
시료로 사용된 ID sequence 에 해당하는 돌연변이에 대한 주형은 유전자합성을 통해서 (bioneer, 한국) 만들었으며, 세포주는 KRAS 정상세포주 Caco2(ATCC HTB-37)와 돌연변이 세포주 A549 (ATCC CCL-185), HCT116(ATCC CCL-247)를 사용하였다.
| 포워드 프라이머 (forward primer) | |
| KRAS-F (서열번호 39) |
5'-NNNGGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3' |
| 리버스 프라이머(reverse primer) | |
| KRAS-R (서열번호 40) |
5'-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3' |
상기 4종의 KRAS 포워드 프라이머와 5'바이오티닐레이티드 리버스 프라이머를 이용하여 다음과 같이 PCR 수행 후 파이로시퀀싱 하였다.
95℃ 5분 - [95℃ (0.5분), 60℃(0.5분), 72℃(0.5분)]x 40 사이클- 72℃ (10분)-4℃ 유지.
KRAS 정상 세포주와 돌연변이(mutant)세포주, ID 시퀀스로 검출할 수 있는 KRAS mutant plasmid 를 주형으로 이용하여, ID 시퀀스를 이용하여 KRAS 돌연변이를 검출하였다 (도 21).
그 결과, 각 돌연변이 주에 해당하는 특이 ID 마커 부분에만 파이로그램의 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
ID 시퀀스 기반 KRAS 변이 검출법으로 다중 돌연변이 검출이 가능한지를, 상기 3가지의 KRAS 돌연변이 DNA를 이용하여 동일 비율로 혼합한 다음, 파이로시퀀싱으로 검출하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 이론적으로 예측 가능한 결과와 동일한 파이로그램을 확인할 수 있었다.
또한, 실제 ID 시퀀스 기반 KRAS 다중 돌연변이 검출법이 실제 임상시료에 적용되는지를 대장암 조직시료 gDNA를 이용하여 테스트 해 보았으며, 12명의 시료에 대해 테스트 결과 3명의 환자에서 돌연변이를 검출할 수 있었으며, 이에 대한 대표적인 파이로그램을 도 23에 나타내었다.
실시예 4: ID 시퀀스를 이용한 호흡기 바이러스 감염 검출
신종인플루엔자 A (H1N1), 계절인플루엔자 A (H1형, H3형), B 바이러스는 유행 시기가 겹치고 감염 증상이 유사하나 치료제인 항바이러스 제에 대해 바이러스 타입별 치료효과가 다르므로 바이러스 타입을 정확하게 구분 검사하여 치료하는 것이 권장된다. 이에 ID 시퀀스를 이용한 호흡기 바이러스 지노타이핑 방법을 개발하였다.
본 실시예에서는 대표적인 호흡기 바이러스인 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43의 감염을 검출하였다. 상기 5종의 호흡기바이러스에 대한 ID 시퀀스를 표 9와 같이 디자인하였다.
| ID sequence | 호흡기 바이러스 종류 |
| CATA | Influenza A virus |
| GATA | Influenza B virus |
| TATA | RSV B |
| ACTA | Rhino virus1 |
| ATCA | Coronavirus OC43 |
상기 5종의 ID 시퀀스의 3' 말단에는 대응하는 호흡기 바이러스에 특이적인 염기서열을 연결하고, 5' 말단에는 공통된 시퀀싱용 서열을 연결하여, 단일 시퀀싱 프라이머를 이용하여, 5 종의 ID 시퀀스를 파이로시퀀싱할 수 있도록 하여, ID 시퀀스를 포함하는 PCR 프라이머를 제작하였다 (표 10).
| GT-호흡기바이러스 5타입 포워드 프라이머 구성 | |||
| 시퀀싱 프라이머 결합부위 | ID시퀀스 | 각 호흡기바이러스에 특이적인 시퀀스 | |
| Influenza A virus (서열번호 46) |
TAATACGACTCACTATAGGG | CATA | ATATACAACAGGATGGGGGCTGTG (서열번호 41) |
| Influenza B virus (서열번호 47) |
TAATACGACTCACTATAGGG | GATA | ATCATCATCCCAGGCGACAAAGATG ((서열번호 42) |
| RSV B (서열번호 48) |
TAATACGACTCACTATAGGG | TATA | TGATATGCCTATAACAAATGACCAGAAA (서열번호 43) |
| Rhino virus1 (서열번호 49) |
TAATACGACTCACTATAGGG | ACTA | GCCAGAAAGTGGACAAGGTGTGAAGAG (서열번호 44) |
| Coronavirus OC43 (서열번호 50) |
TAATACGACTCACTATAGGG | ATCA | GCAGATTTGCCAGCTTATATGACTGTT (서열번호 45) |
본 실시예의 호흡기 바이러스 검출방법은 바이러스 감염 세포에서, 상기 5종의 GT-호흡기바이러스 5타입 포워드 프라이머와 5'바이오티닐레이티드 리버스 프라이머(표 11)를 이용하여, cDNA를 합성한 후, 표 10에서 명시한 GT-RespiVirus ID 프라이머와 5' 바이오티닐레이티드 M13 리버스 프라이머를 이용하여 특이적으로 바이러스를 증폭하여 파이로시퀀싱으로 검출하는 방법이다 (도 24).
| GT - RespiVirus RT R 프라이머 구성 | ||
| M13 R Tagging 시퀀스 | 호흡기 바이러스 타입 특이적인 시퀀스 | |
| Influenza A virus (서열번호 51) |
CAGGAAACAGCTATGACC | ATATACAACAGGATGGGGGCTGTG |
| Influenza B virus (서열번호 52) |
CAGGAAACAGCTATGACC | ATCATCATCCCAGGCGACAAAGATG |
| RSV B (서열번호 53) |
CAGGAAACAGCTATGACC | TGATATGCCTATAACAAATGACCAGAAA |
| Rhino virus1 (서열번호 54) |
CAGGAAACAGCTATGACC | GCCAGAAAGTGGACAAGGTGTGAAGAG |
| Coronavirus OC43 (서열번호 55) |
CAGGAAACAGCTATGACC | GCAGATTTGCCAGCTTATATGACTGTT |
본 실시예에서는 상기 바이러스 유전자에 대해 필요부분을 유전자 합성 (gene synthesis)하고, 상기 합성된 바이러스 유전자를 주형으로 하여 다중 PCR (multiplex PCR) 수행후 파이로시퀀싱으로 검출하였다
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 이론적으로 예측 가능한 결과와 동일한 파이로그램을 확인할 수 있었다.
다중감염에 대한 테스트 또한 바이러스 유전자 주형을 동일 비율로 혼합한 후 다중 PCR (multiplex PCR) 수행후 파이로시퀀싱으로 검출시 정상적으로 작동하는 것을 확인하였다 (도 26).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<220>
<223> primer
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taatacgact cactataggg gtcacatgtg actttatgtg ctgagg 46
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<220>
<223> primer
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<223> primer
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taatacgact cactataggg gcacactgtg tgctctacta ctctctattc 50
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<212> DNA
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taatacgact cactataggg gcacagtgac tactgaatca gctgtacc 48
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<212> DNA
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taatacgact cactataggg gcacatagac tattaatgca gctaaaagca c 51
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<212> DNA
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<223> primer
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tttgttactg tggtagatac tac 23
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taatacgact cactataggg tatatgatat gcctataaca aatgaccaga aa 52
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taatacgact cactataggg actagccaga aagtggacaa ggtgtgaaga g 51
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taatacgact cactataggg atcagcagat ttgccagctt atatgactgt t 51
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<211> 42
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caggaaacag ctatgaccat atacaacagg atgggggctg tg 42
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caggaaacag ctatgaccat catcatccca ggcgacaaag atg 43
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caggaaacag ctatgacctg atatgcctat aacaaatgac cagaaa 46
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caggaaacag ctatgaccgc cagaaagtgg acaaggtgtg aagag 45
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caggaaacag ctatgaccgc agatttgcca gcttatatga ctgtt 45
Claims (13)
- (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스:
여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고;
S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며;
E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고; 및
n은 1~32의 자연수.
- ID-S로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스:
여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고; 및
S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트.
- 제1항 또는 제2항의 ID 시퀀스에 지노타이핑용 유전자 특이서열이 연결되어 있는 지노타이핑용 프라이머.
- 제3항에 있어서, 지노타이핑용 유전자 특이서열은 바이러스 유전자, 질병 유전자, 세균유전자 및 개인식별용 유전자로 구성된 군에서 선택되는 유전자에 특이적인 서열인 것을 특징으로 하는 프라이머.
- 제3항의 지노타이핑용 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 지노타이핑 방법.
- 제5항에 있어서, 지노타이핑은 파이로시퀀싱 법 또는 반도체 시퀀싱을 이용하는 것을 특징으로 하는 지노타이핑 방법.
- 제5항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 지노타이핑 방법:
(a) 지노타이핑 대상 유전자에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수);
(b) 상기 디자인된 ID 시퀀스에 지노타이핑용 유전자 특이서열이 연결되어 있는 지노타이핑용 프라이머를 이용하여 지노타이핑 대상 유전자 주형을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물을 파이로시퀀싱하여 ID 시퀀스를 시퀀싱 하는 단계.
- 다음 단계를 포함하는 HPV의 지노타이핑 방법:
(a) 각각의 HPV 바이러스의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수);
(b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 바이러스 유전자 타입의 특이 서열로 구성되는 지노타이핑용 프라이머를 제작하는 단계:
(c) HPV 바이러스를 함유하는 샘플을 상기 지노타이핑용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및
(d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, HPV의 유전자 타입을 구별하는 단계.
- 제8항에 있어서, 바이러스 유전자 타입의 특이 서열은 서열번호 1~15로 표시되는 염기서열 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는 KRAS 유전자 변이의 검출방법:
(a) 각각의 KRAS의 유전자 변이종류에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수);
(b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 유전자 변이에 특이적인 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계:
(c) KRAS 유전자를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및
(d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, KRAS 유전자의 변이를 검출하는 단계.
- 제10항에 있어서, KRAS 유전자 변이에 특이 서열은 서열번호 34~35로 표시되는 염기서열 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는 호흡기 바이러스의 검출방법:
(a) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43의 유전자 타입에 따라, (ID-S)n-E로 구성되는 지노타이핑용 ID 시퀀스를 디자인하는 단계(여기서, ID는 A, T, C 및 G 중 하나의 단일염기서열인 ID 마크이고, S는 인접한 ID 마크와 연결되고, 상기 인접한 ID 마크의 염기서열과 일치하지 않는 단일염기서열인 사인포스트이며, E는 상기 사인포스트의 단일염기와 일치하지 않는 단일염기서열인 엔드마크이고, 및 n은 1~32의 자연수);
(b) 파이로시퀀싱용 프라이머 서열, ID 시퀀스 및 상기 ID 시퀀스가 부여된 각 호흡기 바이러스 유전자의 특이 서열로 구성되는 검출용 프라이머를 제작하는 단계:
(c) 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, RSV B, 리노바이러스 및 코로나바이러스 OC43로 구성된 군에서 선택되는 호흡기바이러스를 함유하는 샘플을 상기 검출용 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계; 및
(d) 상기 증폭된 PCR 산물로 파이로시퀀싱을 수행하여 ID 시퀀스를 시퀀싱하고, ID 시퀀스에 따라, 호흡기 바이러스를 검출하는 단계.
- 제12항에 있어서, 각 호흡기 바이러스 유전자 타입의 특이 서열은 인플루엔자 A 바이러스의 경우는 서열번호 41, 인플루엔자 B 바이러스의 경우는 서열번호 42, RSV B의 경우는 서열번호 43, 리노바이러스의 경우는 서열번호 44 및 코로나바이러스 OC43의 경우는 서열번호 45로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 방법.
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