CN105593378B - 用于在人ezh2基因中检测突变的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明包括在人EZH2基因中检测癌症相关的突变的试剂和方法。此外，公开了检测突变的方法和治疗方法。

Description

用于在人EZH2基因中检测突变的方法和组合物
发明领域
本发明涉及癌症诊断学和癌症治疗的伴随诊断学。具体而言，本发明涉及突变检测，所述突变检测对于诊断和预后以及预测癌症治疗效果是有用的。
发明背景
EZH2是靶向组蛋白的染色质修饰酶。具体而言，EZH2蛋白为多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚基，其为对组蛋白3（H3）的赖氨酸-27（K27）特异性的组蛋白甲基转移酶。甲基化的H3-K27与基因抑制相关。异常升高的EZH2水平已在多种癌组织中发现且与基因抑制相关，综述于Simon, J.,和Lange, C. (2008) Roles of EZH2 histone methyltransferase in cancer epigenetics, Mut.Res.647:21。还发现特定突变通过改变EZH2蛋白的底物偏好而改变其组蛋白修饰功能。在位置Y646处突变的EZH2(参见Wiggle,T.,等(2011) FEBS Lett.585:3011)在将二甲基化的H3(H3K27me2)甲基化为三甲基化形式(H3K27me3)中有异常活性。在位置A692处突变的EZH2(参见Majer, C.,等(2012) FEBSLett, 586:3348)对二甲基化是有异常活性的；且在位置A682处突变的EZH2(参见McCabe,M.,等(2012), PNAS 109:2989)对所有三个甲基化步骤是有异常活性的。在人癌症中，这些突变已显示促进经组蛋白超甲基化的基因抑制。
已发展了靶向EZH2的疗法。EZH2的选择性小分子抑制剂已显示阻断EZH2（和PRC2）活性并促进体外杀死癌细胞(Knutson, S,等(2012) Nature Chem.Bio.8:890)。该抑制剂对于杀死具有异常活性的突变体EZH2的细胞是独特有效的且不影响具有野生型EZH2的细胞（同上）。因此，伴随诊断测试对于鉴定其肿瘤具有突变体EZH2且将可能从EZH2抑制剂中受益的患者是必需的。EZH2突变的临床检测以足够的灵敏度靶向尽可能多的突变是有必要的。这将保证具有稀有突变的患者不会接到“假阴性”的检测结果从而错过了有可能会保全性命的治疗。同时，测试应是高度特异性的以确保患者不会接受“假阳性”结果且接受昂贵且无效的治疗。
灵敏并且适合多重处理的一种技术是等位基因特异性PCR (AS-PCR)。该技术在存在序列的野生型变体的情况下检测核酸序列中的突变或多态性。在成功的等位基因特异性PCR中，扩增目标核酸的所需变体，而其它变体不被扩增，至少不在可检测到的水平上。在等位基因特异性PCR中，至少一条引物是等位基因特异性的，从而使引物延伸仅在存在序列的特异性变体时进行。在相同的反应混合物中可以存在靶向一个或多个多态位点的一条或多条等位基因特异性引物。设计成功的等位基因特异性引物是不可预知的技术。尽管对于已知序列设计引物是很平常的，却不存在设计出可以区分非常相似的序列的引物的方案。
在诊断测定的背景下，需要精确区分。例如，在EZH2突变检测的背景下，等位基因特异性引物的性能可以决定患者癌症治疗的过程。因此，仍然需要具有最大特异性和灵敏度的能够检测最大数目的EZH2突变的全面检测。
发明概述
在一个实施方案中，本发明为用于检测人EZH2基因中的突变的分离的寡核苷酸，其由选自对应于以下的SEQ ID NO的寡核苷酸的序列组成：EZH2_Y646N_R (SEQ ID NO:1)、Y646H_R (SEQ ID NO:12)、Y646F_R (SEQ ID NO:21)、Y646C_R (SEQ ID NO:41)、A682G_R(SEQ ID NO:59)和A692V_R (SEQ ID NO:73)，例外是包含与人EZH2基因的天然存在的序列的至少一个错配。SEQ ID NOs:1、12、21、41、59和73的每一个包含至少一个TT二联体(duplet)和TTT或CTC三联体。任何所述SEQ ID NO的长度为20-30个核苷酸。在这些实施方案的变化中，错配位于各个寡核苷酸的3'端的最后5个核苷酸内。在这些实施方案的进一步变化中，所述寡核苷酸进一步包含至少一个非天然核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明为检测样品中的人EZH2核酸中的突变的方法，其包括：（a）将样品中的核酸与上述选自对应于SEQ ID NO: 1、12、21、41、59和73的SEQ ID NO的至少一个寡核苷酸接触；（b）将样品在允许寡核苷酸与EZH2核酸内的靶序列杂交的条件下孵育；（c）生成含有EZH2核酸内的靶序列的扩增产物；和（d）检测经扩增的产物的存在，由此检测EZH2核酸中突变的存在。在该实施方案的变化中，样品中的核酸与选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的寡核苷酸接触。
在另一实施方案中，本发明为测定患有恶性肿瘤的患者是否可能对EZH2抑制剂响应的方法，包括：（a）将来自患者的样品中的核酸与选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的至少一个寡核苷酸接触；（b）将样品在允许寡核苷酸与EZH2核酸内的靶序列杂交的条件下孵育；和生成含有EZH2核酸内的靶序列的扩增产物；（c）检测经扩增的产物的存在，由此检测EZH2核酸中突变的存在，其中存在突变表示患者可能对EZH2抑制剂响应。在该实施方案的变化中，所述寡核苷酸对于选自位置Y646、A682和A692处的突变的至少两个是特异性的。在该实施方案的进一步变化中，所述寡核苷酸对于选自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V处的突变的至少两个是特异性的。
在仍另一个实施方案中，本发明是检测人EZH2基因中的突变的试剂盒，所述试剂盒包含选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的至少一个寡核苷酸和任选地至少一种用于PCR的额外试剂。在该实施方案的变化中，试剂盒包含SEQ ID NO:1-51、58-68和72-83中的两个或更多个。在该实施方案的进一步变化中，所述试剂盒包含两个或更多个寡核苷酸，所述寡核苷酸各自对于选自位置Y646、A682和A692处的突变是特异性的。在该实施方案的进一步变化中，所述试剂盒包含两个或更多个寡核苷酸，所述寡核苷酸各自对于选自位置Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V处的突变是特异性的。
在仍另一个实施方案中，本发明是治疗患有癌症的患者的方法，其包括向所述患者施用合适剂量的EZH2抑制剂，其中所述患者的肿瘤携带有用选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的寡核苷酸检测到的EZH2基因中的体细胞突变。
在仍另一实施方案中，本发明是治疗患有癌症的患者的方法，其包括使用选自表2-4中列出的等位基因特异性引物且包含与人EZH2基因的天然存在序列的至少一个错配的至少一个寡核苷酸探测患者样品的EZH2基因中的突变，且如果发现突变，则向所述患者施用一定剂量的EZH2抑制剂。在该实施方案的变化中，突变位于位置Y646、A682和A692。在该实施方案的进一步变化中，突变选自Y646N、Y646H、Y646S、Y646F、Y646C、A682G和A692V。在该实施方案的进一步变化中，所述寡核苷酸选自SEQ ID NO:1-51、58-68和72-83。在该实施方案的进一步变化中，所述EZH2抑制剂选自EI1 EPZ6438 (E7438)、GSK343或GSK126。在该实施方案的进一步变化中，所述癌症是淋巴瘤。
发明详述
定义
为了便于理解本公开内容，提供了本文使用术语的以下定义。
术语“X[n]Y”指在氨基酸序列中[n]位置上氨基酸X替换为氨基酸Y的错义突变。例如，术语“Y646C”指646位酪氨酸替换为半胱氨酸的突变。
术语“等位基因特异性引物”或“AS引物”指这样的引物，所述引物与多于一个目标序列的变体杂交，但能够在仅具有目标序列的变体间区分开，因为仅对于一个变体，引物才可以在合适条件下由核酸聚合酶有效延伸。对于目标序列的其它变体，延伸效率更低或是无效的。
术语“通用引物”指包括等位基因特异性引物的引物对中的第二条引物。通用引物不是等位基因特异性的，即无法在等位基因特异性引物可以区分的目标序列的变体间进行区分。
术语“互补的”或“互补性”参考Watson-Crick碱基对法则涉及的多核苷酸的反向平行链使用。术语“完美互补的”或“100％互补的”指在反向平行链间所有碱基都具有Watson-Crick配对的互补链，即，在多核苷酸双链体中任何两个碱基之间不存在错配。然而，双链体会在甚至缺少完美互补性的反向平行链之间形成。术语“部分互补的”或“不完全互补的”指在少于100％完美的反向平行多核苷酸链间碱基的任何排列（例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对的碱基）。部分互补链间的双链体通常比完美互补链间的双链体是更不稳定的。
术语“样品”指任何包含或假定包含核酸的组合物。这包括了从个体中分离出的组织或流体，例如皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和肿瘤，的样品，以及从个体取出的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋的组织（FFPET）或芯针活检样品和从中分离的核酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述更短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可以包含对应于指定的核苷酸序列的区域的至少6个核苷酸，例如至少约10－12个核苷酸、或至少约15－30个核苷酸。
术语“一级序列”指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰如含氮碱基修饰、糖修饰或其它主链修饰不是一级序列的一部分。标记，如与寡核苷酸缀合的生色团也不是一级序列的一部分。因此，两条寡核苷酸可以具有相同的一级序列但在修饰和标记上有所不同。
术语“引物”指这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸与目标核酸中的序列杂交，并且能够在适合此类合成的条件下作为沿核酸互补链合成的起始点。如本文所用，术语“探针”指与目标核酸中的序列杂交并且通常进行可检测标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，例如使探针无法由核酸聚合酶延伸的3'端修饰和一种或多种生色团。具有相同序列的寡核苷酸可以在一个测定中用作引物而在另一测定中用作探针。
术语“错配”指在核酸双链体中的互补链之间缺乏Watson-Crick碱基配对。例如，当腺嘌呤（而不是鸟嘌呤）在互补链中出现在胞嘧啶对面时，则出现错配。如果称单链核酸（诸如扩增引物）具有错配，则意味着当与其靶序列杂交时，引物具有包含与互补链上对应碱基缺乏Watson-Crick配对的碱基的核苷酸。
如本文所用，术语“目标序列”、“目标核酸”或“目标”指将要扩增、检测或扩增及检测的核酸序列的一部分。
术语“杂交的”和“杂交”指导致形成双链体的两个核酸之间的碱基配对相互作用。不要求两个核酸在其全长上具有100％的互补性以实现杂交和链延伸。
人EZH2基因已被发现在癌症中频繁突变。表1显示目前描述的最常见的突变。
表1. 人EZH2基因中的突变
等位基因特异性PCR已描述于美国专利号 6,627,402。在等位基因特异性PCR中，识别引物具有与目标序列的所需变体互补但与目标序列的不需要的变体会错配的序列。通常，引物中的识别核苷酸，即匹配目标序列的唯一一个变体的核苷酸，是3'端核苷酸。然而，引物的3'端仅是许多特异性决定子中的一个。等位基因特异性PCR中的特异性来自错配引物远远慢于配对引物的延伸速率，最终降低了错配目标的相对扩增效率。降低的延伸动力学以及因此的PCR特异性受许多因素影响，包括酶的性质、反应组分和它们的浓度、延伸温度和错配前后的总体序列背景。这些因素在每一具体引物上的效果无法可靠地定量。由于不具有可靠的定量策略而具有大量的变量，因此等位基因特异性引物的设计是具有常常令人惊讶的结果的试错情况。对于下文描述的EZH2的突变体等位基因，仅部分检测引物提供了合适性能，即，可接受的PCR效能并且在同时突变体和野生型模板间的区分。
提高等位基因特异性引物特异性的一个方法是通过包括除末端错配之外的内部错配核苷酸，参见美国专利公开号2010/0099110。引物中的内部错配核苷酸可以与想要的和不想要的目标序列错配。由于错配使具有想要的和不想要的模板的引物-模板杂化物不稳定，因此一些错配能够阻止两种模板的扩增并且导致PCR的错误。因此，在具体等位基因特异性PCR引物中的内部错配的效果无法预测。
对于引物的成功延伸，引物需要与目标序列具有至少部分互补性。通常，引物3'端的互补性比引物的5'端互补性更为严格(Innis 等编辑PCR Protocols, (1990) AcademicPress, Chapter 1, pp. 9-11)。因此，本发明包含公开于表1－7中的引物以及具有5'端变化的这些引物的变体。
之前已描述了对于PCR扩增而言，通常可以通过使用引物中核苷酸的化学修饰来提高引物特异性。具有环外氨基的共价修饰的核苷酸以及此类核苷酸在PCR中的用途已描述于美国专利号 6,001,611中。由于修饰破坏了具有想要的和不想要的模板的引物-模板杂化物中的Watson-Crick氢键，因此一些修饰能够阻止两种模板的扩增并且导致PCR的错误。因此，在等位基因特异性PCR中的这些共价修饰的效果无法预测。
在一个实施方案中，本发明包含在单一管中同时检测多个EZH2突变的分离的寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明包含用于特异性检测人EZH2基因中位置Y646处的突变的分离的寡核苷酸（表2）。在另一个实施方案中，本发明包含用于特异性检测人EZH2基因中位置A682处的突变的分离的寡核苷酸（表3）。在仍另一个实施方案中，本发明包含用于特异性检测人EZH2基因中位置A692处的突变的分离的寡核苷酸（表4）。这些寡核苷酸引物中的一些包含内部错配，例如，在如表2-4中所示的天然存在的突变体或野生型序列中不存在的核苷酸。一些寡核苷酸引物包含如表中所述的非天然核苷酸。
如通过实验结果（表5-7）所证实的，根据相同原理设计的等位基因特异性引物的性能变化很大。本发明涉及分离的寡核苷酸，其各自对于若干密切相关的序列（即单密码子646处突变的系列）之一是特异性的。如表5-7中所示，引物独特地能够在相同密码子处从相似突变和野生型序列中从区分其靶突变。
作为选项，在聚合酶链反应（PCR）测定中，表2-4中公开的等位基因特异性引物可以与“通用的”即，表2-4中公开的非等位基因特异性第二引物和当合适时与表2-4中还公开的检测探针配对。本领域技术人员将立即认识到可选的通用引物和检测探针可以进行设计并与本发明的等位基因特异性引物组合以通过AS-PCR检测人EZH2基因中位置Y646、A682和A692处的突变。
表2. 用于检测位置Y646处的突变的寡核苷酸
* “MM (错配)位置”表示从3'端至错配的核苷酸的距离。“序列”表示导致错配的核苷酸的改变，例如，“AT”意指T被A替代。
** F – 报道基因, Q – 猝灭剂, P – 磷酸基团。
表3. 用于检测位置A682处的突变的寡核苷酸
* J – 报道基因, E – 报道基因, Q – 猝灭剂, P – 磷酸。
表4. 用于检测位置A692处的突变的寡核苷酸
* F – N6 甲基-dA
** E – 报道基因, Q – 猝灭剂, P – 磷酸。
在另一实施方案中，本发明是使用表2-4中公开的寡核苷酸检测EZH2突变的诊断方法。本方法包括在存在对应的第二条引物（任选地，也选自表2-4中）、核苷三磷酸和核酸聚合酶的情况下，将含有核酸的检测样品与一条或多条选自表2-4用于EZH2突变的等位基因特异性引物接触，从而使一条或多条等位基因特异性引物能够仅在样品中存在EZH2突变时有效延伸；并且通过检测延伸产物是否存在来检测EZH2突变是否存在。
在具体实施方案中，用探针检测延伸产物的存在。在该实施方案的变化中，探针选自表2-4。可以用放射性的、荧光的或生色团标签对探针进行标记。例如，可以通过实时聚合酶链式反应(rt-PCR)检测延伸产物的扩增来检测突变，其中探针与延伸产物的杂交导致探针的酶消化和产生荧光的检测(TaqMan™ probe method, Holland等 (1991)P.N.A.S.USA 88:7276-7280)。也可以通过检测荧光改变来检测rt-PCR中扩增产物的存在，这是由于探针和延伸产物间形成了核酸双链体(美国专利公开号2010/0143901)。或者，可以如Sambrook, J. 和Russell, D.W. (2001), Molecular Cloning, 第三版 CSHLPress, 第5和9章中描述，通过凝胶电泳随后染色或印记和杂交来检测延伸产物和扩增产物的存在。
在仍另一实施方案中，本发明是用于同时检测人EZH2基因中位置Y646、A682和A692处的突变的寡核苷酸的组合。在该实施方案的变化中，所述组合包含来自表2-4中每一个的至少一个等位基因特异性引物和任选地，来自表2-4中每一个的至少一个通用引物和进一步任选地，来自表2-4中每一个的至少一个探针。如例如表5中所证实的，本发明的分离的寡核苷酸独特的适合于在测试试剂盒中组合。表5证实每一寡核苷酸对于其靶突变甚至在紧密相关突变存在于样品中的情况也是特异性的。
在另一实施方案中，本发明是治疗患者的方法，所述患者具有可能包含突变体EZH2基因的细胞的肿瘤。所述方法包括在存在对应的一条或多条第二引物（任选地，也选自表2-4）时，将患者样品与选自表2-4的用于EZH2突变的一条或多条等位基因特异性引物接触，进行等位基因特异性扩增，并且通过检测延伸产物是否存在来检测EZH2突变是否存在，并且如果发现至少一个突变，则向患者施用抑制由突变基因编码的突变体EZH2蛋白的信号转导的化合物。在该实施方案的变化中，所述EZH2抑制剂选自EI1 (Qi, W.,等(2012) PNASUSA 109(52):21360); EPZ6438-E7438 (Knutson, S.K.,等 (2012) Nat Chem Biol.8(11):890; GSK343或GSK126 (McCabe, M.T., 等(2012) Nature 108:108; 或任何其他合适的可获得的或将变成可获得的选择性EZH2抑制剂。
在仍另一实施方案中，本发明是包含检测EZH2基因中突变必需试剂的试剂盒。试剂包括一个或多个选自表2-4中每一个的表的用于EZH2突变等位基因特异性引物，一个或多个对应的第二引物（任选地，也选自表2-4中每一个的表），和任选地，一个或多个探针（任选地，也选自表2-4中每一个的表）。试剂盒还可以包括对扩增性能和检测实验必需的试剂，如核苷三磷酸、核酸聚合酶和对聚合酶功能必需的缓冲液。在某些实施方案中，对探针进行可检测地标记。在这些实施方案中，试剂盒可以包括用于标记和检测标记的试剂。
实施例
示例性反应条件
用于检测引物性能的示例性反应条件如下。PCR混合物包括50 mM Tris-HCl (pH8.0)，75-90 mM氯化钾，160 µM每种dATP、dCTP和dGTP，320 µM dUTP, 0.075-0.2 µM每种选择性和通用引物, 0.05-0.1 µM探针, 靶DNA (100和10,000拷贝的具有突变体的重组质粒，或10,000拷贝的野生型基因组DNA(合并的基因组DNA, Promega, Madison, Wisc., 目录号DD2011), 0.2 U/uL 尿嘧啶-N-转葡糖基酶, 200 nM NTQ21-46A适体, 40 nM DNA聚合酶, 0.1 mM EDTA, 1.25%-2% DMSO, 2.5 mM乙酸镁。使用Roche LightCycler® 480仪器(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)完成扩增和分析。使用以下温度概况：50oC 5分钟；95oC (10秒)至62oC (30秒)两个循环，随后为93oC (10秒)至62oC (30秒)循环55次，1个循环冷却至37 (10秒)，和1个循环冷却至25 (10秒)。在55个循环中的每一个62oC步骤开始时收集荧光数据。任选地，反应包含内源阳性对照模板。
等位基因特异性PCR的成功通过比较用靶序列获得的Ct与用非靶序列获得的Ct（例如相同位置处的不同突变或野生型序列）来测量。
实施例1
在人EZH2基因中检测位置Y646处的突变的引物
表2中显示的引物和探针在上述实验条件下测试。表5显示扩增（如通过Ct测量）。
表5. 引物在人EZH2基因中位置Y646处的性能
* 在这些反应中，模板为突变体DNA的纯样品
** 在这些反应中，模板为靶向的突变和野生型DNA的混合物。
实施例2
在人EZH2基因中检测位置A682处的突变的引物
表3中显示的引物和探针在上述实验条件下测试。表6显示如通过（匹配的（突变体）和错配的（野生型）模板之间）Ct和∆Ct的测量的扩增特异性。
表6. 引物在人EZH2基因中位置A682处的性能
实施例3
在人EZH2基因中检测位置A692处的突变的引物
表4中显示的引物和探针在上述实验条件下测试。表7显示如通过（匹配的（突变体）和错配的（野生型）模板之间）Ct和∆Ct的测量的扩增特异性。
表7. 引物在人EZH2基因中位置A682处的性能
序列表
<110> ROCHE DIAGNOSTICS GMBH
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> 用于在人EZH2基因中检测突变的方法和组合物
<130> 31749 WO-KOE
<150> 61/888,660
<151> 2013-10-09
<160> 85
<170> PatentIn 版本 3.5
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探针"
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引物"
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tagcagtttg gatttaccga atgatttg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
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<212> DNA
<213> 人工序列
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引物"
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引物"
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引物"
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探针"
<400> 85
tttagatttt gtggtggatg caacccgcaa 30

Claims (9)

1.用于检测人EZH2基因中的突变的分离的寡核苷酸，其包含寡核苷酸Y646H_R (SEQID NO: 11)的序列，例外的是其包含与人EZH2基因的天然存在的序列的至少一个错配，其中所述错配位于所述寡核苷酸的3'端的n-2或n-3位置，前提条件是n是所述寡核苷酸的3'端核苷酸，其中所述分离的寡核苷酸选自SEQ ID NO: 15、16和18-20。
2.权利要求1的寡核苷酸，其进一步包含至少一个非天然的寡核苷酸。
3.权利要求1或2的寡核苷酸在制备用于确定患有恶性肿瘤的患者是否可能对EZH2抑制剂响应的方法中的试剂盒的用途。
4.权利要求3的用途，其中所述恶性肿瘤为癌症的指征，其中所述癌症为淋巴瘤。
5.用于检测人EZH2基因中的突变的试剂盒，其包含权利要求1或2的寡核苷酸和用于PCR的至少一种额外的试剂。
6.权利要求5的试剂盒，其进一步包含一种或多种相应的第二引物、一种或多种可能被标记的探针、三磷酸核苷、核酸聚合酶和/或缓冲剂。
7.权利要求1或2的寡核苷酸在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于探测癌症患者样品的EZH2基因中的突变的方法。
8.权利要求7的用途，其中所述样品为得自血细胞、血浆、血清或福尔马林固定石蜡包埋的组织样品的核酸。
9.权利要求7的用途，其中所述癌症为淋巴瘤。
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