CN110195105A - 一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒 - Google Patents

一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒。本发明提供了一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒，将待测样本与样品处理液混合处理后，无需进行DNA提取步骤，在短时间内实现对样本的简易处理，并进一步通过选择性扩增引物与选择性检测探针实现对华法林用药相关基因野生型变异体与突变型变异体的有效区分，从样本处理到获取最终检测结果整个过程在1h内完成，并且保证检测的准确性、特异性和灵敏度。

Description

一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒。
背景技术
华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药物，已被应用于多种疾病的抗凝治疗,如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其是在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。
华法林的量效关系除了受临床环境因素(如年龄，体重，饮食中维生素K的摄取，抗凝适应症，合并用药等)的影响外，基因组的遗传变异很大程度上影响了华法林的抗凝效果。对华法林的药物基因组学研究发现，其代谢相关基因(CYP2C9)和作用靶基因(VKORC1)在华法林的疗效和毒副作用方面起着关键性的作用，其中的基因变异型CYP2C9*3(p.I359L)及VKORC1*2(tagSNP:-1639G>A)已经在多个种族中(包括中国人群)被证实与华法林剂量个体间的差异密切相关，依据这两个基因变异型，并结合临床和环境因素，能使约50％的华法林剂量个体间差异得到合理的解释。除此之外，CYP4F2基因多态性与华法林剂量也存在相关性。CYP4F2为维生素K的单氧酶，其不同基因型的个体对维生素K代谢活性不同：野生型(CC基因型)代谢活性最高，而突变纯合型(TT基因型)肝微粒体代谢活性最低，突变杂合子(CT基因型)介于两者之间，故CYP4F2*3突变会使酶活性下降，从而减少维生素K的代谢，使维生素K浓度升高，为达到相同的抗凝效果，需服用较高剂量的华法林。在白种人、黑种人及黄种人中进行的大多数研究均发现，CYP4F2*3基因突变会造成华法林剂量改变，其中T等位基因与华法林高剂量有关，并且TT型患者华法林剂量每日较CC型患者多1mg。研究还发现，在白种人中，CYP4F2*3的变异可以解释1％-7％华法林剂量个体差异。在中国人中，CYP4F2*3基因多态性可以解释4％华法林剂量。
目前用于检测基因多态性的方法很多，主要有测序法、限制性内切酶酶解片段长度多态性(RFLP)分析法、ARMS(Amplification refractory mutation system，扩增阻滞突变系统)法、TaqMan PCR和基因芯片法等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常见的方法为直接测序法以及ARMS法。
测序法的主要缺点在于：(1)PCR反应前需要对样本进行提取DNA，检测质量与浓度，操作复杂，存在混淆样本的风险。(2)检测多个位点时一个样本需要进行多个反应，检测成本高，对模板量的需求高，操作强度大，并容易造成操作错误和污染。(3)PCR反应后需要对产物进行纯化和测序化学反应等步骤。总体来说就是检测灵敏度低，步骤繁琐，试验周期长，成本高，不利于临床大规模推广。
ARMS-PCR法：ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)又叫等位基因特异PCR，Taqman聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在一定条件下PCR产物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计突变引物、野生引物，2个引物主要是3’末端碱基不同。该方法的主要限制因素是：a)若突变的位点为弱错配碱基序列，ARMS引物不能有效区分目标核酸序列的野生型变异体和突变型变异体，从而使该方法的选择性受到影响，也会因此产生假阴性或假阳性结果。b)ARMS-PCR只含有选择性扩增机制而不具备选择性检测，无法进行基因型特异性检测，因此当选择性扩增出现错误时会导致完全错误的结论，即出现假阴性及假阳性结果。c)ARMS-PCR引物设计必须涵盖多态性位点区域，当这些区域有特殊序列或结构时，扩增(效率、特异性、选择性)会被影响。
因此，需要开发出一种全新的、操作简单、特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、检测速度快和成本低的华法林用药相关基因多态性检测试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒，使得所述方法以及试剂盒产品能够快速简便的检测华法林用药相关基因多态性，并具备较高的特异性和灵敏度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法，包括：
步骤1、待测样品无需提取DNA直接采用样品处理液处理，释放DNA；
步骤2、将处理后的待测样品采用华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物以及特异性选择性探针进行荧光定量PCR扩增和检测；
步骤3、根据荧光定量PCR结果的信号及/或信号值进行基因分型。
作为优选，所述CYP2C19基因多态性的特异性选择性扩增引物为CYP2C19*2型特异性选择性扩增引物、CYP2C19*3型特异性选择性扩增引物和CYP2C19*17型特异性选择性扩增引物中的一种或两种以上；
其中，所述华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物为CYP2C9*3型特异性选择性扩增引物、VKORC1型特异性选择性扩增引物和CYP4F2型特异性选择性扩增引物中的一种或两种以上；
所述CYP2C9*3型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，公共下游引物如SEQ ID NO:3所示；
所述VKORC1型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，公共下游引物如SEQ ID NO:6所示；
所述CYP4F2型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:8所示，公共下游引物如SEQ ID NO:9所示。
在本发明所述特异性选择性扩增引物中的野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物中，均包含以共价相连或直接相连的引物区序列和变异体识别区序列，所述引物区序列在3’端，变异体识别区序列在5’端，所述变异体识别区序列(即野生型扩增上游引物和突变型扩增上游引物的5’端)优选共价连接有核酸双链稳定因子和/或含有不能被核酸酶水解的修饰因子，所述引物区序列能够从目标核酸基因多态性位点前开始扩增，突变型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的正常碱基，野生型扩增引物变异体识别区序列包含目标核酸基因多态性位点处的突变碱基，两种变异体识别区序列均与所述引物区序列扩增延伸产生的序列形成发夹结构，从而影响不同扩增效率，实现检测的特异性。
作为优选，所述核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合，所述修饰因子选自碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。
作为优选，所述华法林用药相关基因多态性的特异性选择性探针为CYP2C9*3型特异性选择性探针、VKORC1型特异性选择性探针和CYP4F2型特异性选择性探针中的一种或两种以上；
其中，所述CYP2C9*3型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:10所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:11所示；
所述VKORC1型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:12所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:13所示；
所述CYP4F2型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:14所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:15所示；
所述各基因型特异性选择性探针的5’端和3’端分别具有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团为FAM或TAMRA或VIC，所述淬灭基团为NFQ(Non-Fluorescent Quencher)-MGB，NFQ本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时所述特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，因此同样的Tm值，MGB探针可以比普通Taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。
当上述华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物以及特异性选择性探针组合使用时能够达到较高的检测特异性、准确性以及灵敏性，效果优于其他特异性引物和探针。
作为优选，本发明所述样品处理液可直接处理待测样品，不需提取DNA即可完成DNA的释放，直接用于后续扩增和检测，方便快捷；所述样品处理液包含处理缓冲液、金属离子络合剂和DNA释放促进剂。其中，所述处理缓冲液为Tris-HCl缓冲液，浓度为10～100mM，pH7.0～10.0；更具体地，所述Tris-HCl的浓度为20mM，pH8.0；所述金属离子络合剂为EDTA，浓度为1～20mM，pH7.5～8.5；更具体地，所述EDTA浓度为2mM，pH8.0；所述DNA释放促进剂为蛋白酶K，浓度为0.01～20mg/ml；更具体地，所述蛋白酶K浓度为2mg/ml。
此外，本发明基于上述检测的方法，还对应提供了一种快速检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒，包括本发明所述方法中的华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物，以及所述方法中的华法林用药相关基因多态性的特异性选择性探针。
作为优选，所述试剂盒还包括荧光定量PCR扩增及检测的反应试剂(如PCR缓冲液、MgCl2、去垢剂、DNA聚合酶和dNTP)、本发明所述方法中的样品处理液，以及基因型对照DNA。
其中，所述基因型对照DNA包括CYP2C9*3野生型DNA和突变型DNA、VKORC1野生型DNA和突变型DNA、CYP4F2野生型DNA和突变型DNA中的一对或两对以上；同时，本发明所述试剂盒还包括内参，其中内参序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；内参正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；内参反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
采用本发明所述方法和试剂盒，可根据需要同时检测华法林用药相关基因，如CYP2C9*3型、VKORC1型和CYP4F2型中的一种或两种以上。
本发明步骤3中，根据荧光定量PCR结果的信号及/或信号值进行基因分型可参考表1(只有在内参基因有扩增时检测结果可信，表中数值仅为参考，具体数值会因反应体系、样品来源、机器种类等差异而有差异)：
表1检测结果判定
根据本发明实施例所记载的实验效果，本发明具备下述积极效果：
1、检测速度快：本发明提供的方法将样品与样品处理液混合处理后，无需对样品进行DNA提取，省去了繁琐又费时的DNA提取步骤，在不长于7min即可完成样品的快速处理，并直接对所述样品和样品处理液的混合液进行选择性扩增及基因型特异性选择性检测，从样本处理到获取最终检测数据整个过程在1h内完成(当采用ABI7500Fast定量PCR仪器时)。
2、能准确检测基因多态性：采用特异性选择性扩增引物选择性扩增目的核酸序列变异体，而非目的核酸序列变异体无法扩增，在扩增的同时通过特异性选择性探针检测扩增产物，检测灵敏度高、特异性强，从而确保了基因分型的准确性，优于ARMS方法。
3、结合本发明所提供的华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物以及特异性选择性探针，两者组合使用时能够达到较高的检测特异性、准确性以及灵敏性，效果优于其他的特异性引物和探针。
由以上技术方案可知，本发明提供了一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒，将待测样本与样品处理液混合处理后，无需进行DNA提取步骤，在短时间内实现对样本的简易处理，并进一步通过选择性扩增引物与选择性检测探针实现对华法林用药相关基因野生型变异体与突变型变异体的有效区分，从样本处理到获取最终检测结果整个过程在1h内完成，并且保证检测的准确性、特异性和灵敏度。
附图说明
图1为血液样本经快速处理后内参模板的扩增结果；
图2为一组血液样本CYP2C9*3野生纯合型样本的检测结果；
图3为一组血液样本CYP2C9*3杂合型样本的检测结果；
图4为一组血液样本VKORC1突变纯合型样本的检测结果；
图5为一组血液样本VKORC1杂合型样本的检测结果；
图6为一组血液样本CYP4F2野生纯合型样本的检测结果；
图7为一组血液样本CYP4F2杂合型样的检测结果；
图8为一组血液样本CYP4F2突变纯合型样本的检测结果；
图9为多组血液样本经快速处理后的模板的扩增结果；
图10为使用本发明所述方法对VKORC1野生型质粒的检测结果；
图11为使用本发明所述方法对VKORC1突变型质粒的检测结果；
图12为使用ARMS方法对VKORC1野生型质粒的检测结果；
图13为使用ARMS方法对VKORC1突变型质粒的检测结果；
图14为使用本发明所述特异性引物、特异性探针组合对CYP4F2*3突变型质粒的检测结果；
图15为使用其它特异性引物、特异性探针组合对CYP4F2*3突变型质粒的检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试剂盒和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，所述华法林用药相关基因为对华法林代谢相关基因CYP2C9(具体为CYP2C9*3型)、作用靶基因VKORC1以及CYP4F2基因。
以下就本发明所提供的一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒做进一步说明。
实施例1：血液样本的处理
在这个实施例中，对5组血液进行40倍稀释后进行快速处理。其中处理液为20mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA，2mg/ml蛋白酶K，将2ul血液与78ul该处理液混合，并充分混匀后经56℃保温5min，98℃保温2min，粗制样本即处理完成。
实施例2：唾液试子样本的处理
在这个实施例中，使用专用唾液试子刮取口腔内粘膜细胞，用剪刀剪取部分试子或者将整个试子进行浸泡，其中处理液为20mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA，2mg/ml蛋白酶K，所需体积浸泡以处理液全部覆盖试子为宜，并剧烈震荡1min后，粗制样本即处理完成。
实施例3：血液样本的快速检测
在这个实施例中，通过使用本发明所述的实施例1中的方法对血液进行快速处理并检测内参基因的扩增。
内参序列为：
5’-CGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGGTGAGAGGCTGGGATGCCAAGGCTGGGGGTTCATAAATGCAGACAGCAGTTCCGATGGC-3’
正向引物：5’-CGGACTGAAGGAGCTGCC-3’
反向引物：5’-GCCATCGGAACTGCTGTCTG-3’
检测探针：5’-Cy5-CCCCAGCCTTGGCATCCCA-BHQ2-3’
PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，检测探针200nM和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。其中1个单位是指在72℃30分钟掺入10nmoldNTPs所需要的酶量。
使用ABI 7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，2min；40循环(95℃，3s；60℃，25s，单循环)。
实验结果见图1，实验的结果通过在618nM-660nM的荧光变化来体现的。图1中可见血液经快速处理后有充足的模板量用于检测且检测方法可行。
实施例4：使用本发明所提供的试剂盒实现对CYP2C9*3、VKORC1、CYP4F2基因的三重选择性扩增与检测
在这个实施例中，分别选择多组血液样本，经实施例1所描述的方法进行快速处理，然后使用本发明所提供的试剂盒，对CYP2C9*3、VKORC1、CYP4F2基因的三重选择性扩增与检测。突变型与野生型分两个独立管进行检测。
CYP2C9*3野生型序列为：
5’-GTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACA(下划线处为多态性位点)TTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGTAAGTTTGTTTCTC-3’
CYP2C9*3突变型序列为：
5’-GTGTGATTGGCAGAAACCGGAGCCCCTGCATGCAAGACAGGAGCCACATGCCCTACACAGATGCTGTGGTGCACGAGGTCCAGAGATACC(下划线处为多态性位点)TTGACCTTCTCCCCACCAGCCTGCCCCATGCAGTGACCTGTGACATTAAATTCAGAAACTATCTCATTCCCAAGGTAAGTTTGTTTCTC-3’
CYP2C9*3野生型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-AAGGTATCT(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)GCTGTGGTGCACGAGGTCC(引物区)-3’
CYP2C9*3突变型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-AATGTATCT(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)GCTGTGGTGCACGAGGTCC(引物区)-3’
CYP2C9*3公共下游引物为：5’-GCAGGCTGGTGGGGAGAAG-3’
CYP2C9*3野生型检测探针序列为：
5’-(TAMRA)-CAAT(多态性位点)GTATCTCTGGACCT-(MGB)-3’
CYP2C9*3突变型检测探针序列为：
5’-(TAMRA)-CAAG(多态性位点)GTATCTCTGGACC-(MGB)-3’
VKORC1野生型序列为：
5’-GCCAGGCTTGTCTTAAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCACCC(下划线处为多态性位点)GGCCAATGGTTGTTTTTCAGGTCTTCTCTTGCTTGACTTCCCAGAGGGATCCCTTACTGTTGCACCTACCCTTCTGGGAACTCTCTTCCT-3’
VKORC1突变型序列为：
5’-GCCAGGCTTGTCTTAAACTCCTGACCTCAAGTGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGATTATAGGCGTGAGCCACCGCACCT(下划线处为多态性位点)GGCCAATGGTTGTTTTTCAGGTCTTCTCTTGCTTGACTTCCCAGAGGGATCCCTTACTGTTGCACCTACCCTTCTGGGAACTCTCTTCCT-3’
VKORC1野生型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-CCTGGCCAA(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)GCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACC(引物区)-3’
VKORC1突变型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-CCCGGCCAA(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)GCAAGAGAAGACCTGAAAAACAACC(引物区)-3’
VKORC1公共下游引物为：5’-TAGGATTATAGGCGTGAGCCACC-3’
VKORC1野生型检测探针序列为：
5’-(FAM)-ACCC(多态性位点)GGCCAATGG-(MGB)-3’
VKORC1突变型检测探针序列为：
5’-(FAM)-ACCT(多态性位点)GGCCAATGG-(MGB)-3’
CYP4F2野生型序列为：
5’-TACTCCTGATCAAAACCCTGCCCCCTCCTCTAGGAGCCTTGGAATGGACAAAAACAGAGAGAGGGGCCCCGCACCTCAGGGTCCGGCCACAC(下划线处为多态性位点)AGCTGGGTTGTGATGGGTTCCGAAAACACTGATGAGGCAGATAATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGCAGTCAGGAGAAGGCCTCC-3’
CYP4F2突变型序列为：
5’-TACTCCTGATCAAAACCCTGCCCCCTCCTCTAGGAGCCTTGGAATGGACAAAAACAGAGAGAGGGGCCCCGCACCTCAGGGTCCGGCCACAT(下划线处为多态性位点)AGCTGGGTTGTGATGGGTTCCGAAAACACTGATGAGGCAGATAATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGCAGTCAGGAGAAGGCCTCC-3’
CYP4F2野生型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-ACATAGCTGG(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)AGTGTTTTCGGAACCCATCACA(引物区)-3’
CYP4F2突变型选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-ACACAGCTGG(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)AGTGTTTTCGGAACCCATCACA(引物区)-3’
CYP4F2公共下游引物为：5’-GGGCCCCGCACCTCAGG-3’
CYP4F2野生型检测探针序列为：
5’-(VIC)-ACAC(多态性位点)AGCTGGGTTGT-(MGB)-3’
CYP4F2突变型检测探针序列为：
5’-(VIC)-ACAT(多态性位点)AGCTGGGTTGTGA-(MGB)-3’
PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，CYP2C9*3，VKORC1，CYP4F2及内参的四种正向引物、反向引物各200nM，四种检测探针各200nM和2个单位的热启动Taq DNA聚合酶。其中2个单位是指在72℃30分钟掺入10nmoldNTPs所需要的酶量。
使用ABI 7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，2min；40循环(95℃，3s；60℃，25s，单循环)；
实验结果见图2至图9，CYP2C9*3实验的结果通过TAMRA的荧光变化来体现的，VKORC1实验的结果通过FAM的荧光变化来体现的，CYP4F2实验的结果通过VIC的荧光变化来体现的，内参实验的结果通过在Cy5的荧光变化来体现的。
图2中可见该组血液样本CYP2C9*3为野生纯合型样本，仅野生型检测孔存在扩增，突变型检测孔无扩增。
图3中可见该组血液样本CYP2C9*3为杂合型样本，野生型检测孔与突变型检测孔均存在扩增。
图4中可见该组血液样本VKORC1为突变纯合型样本，仅突变型检测孔存在扩增，野生型检测孔无扩增。
图5中可见该组血液样本VKORC1为杂合型样本，野生型检测孔与突变型检测孔均存在扩增。
图6中可见该组血液样本CYP4F2为野生纯合型样本，仅野生型检测孔存在扩增，突变型检测孔无扩增。
图7中可见该组血液样本CYP4F2为杂合型样本，野生型检测孔与突变型检测孔均存在扩增。
图8中可见该组血液样本CYP4F2为突变纯合型样本，仅突变型检测孔存在扩增，野生型检测孔无扩增。
图9中可见几组血液样本经快速处理后均含有足量模板，可满足后续的相关基因检测。
实施例5：使用本发明所述的方法与ARMS方法对VKORC1基因的检测对比
在这个实施例中，分别选择含有VKORC1突变及野生序列的质粒1000copy，检测本发明所述的方法与ARMS方法，用于对VKORC1的检测。突变型与野生型分两个独立管进行检测。
野生型序列为：同实施例4
突变型序列为：同实施例4
野生型正向ARMS引物序列为：
TCAGGGTCCGGCCACAC(多态性位点)
突变型正向ARMS引物序列为：
CTCAGGGTCCGGCCACAT(多态性位点)
公共ARMS下游引物为：CCTTGGAGAGACAGACAGTTGTGTG
公共ARMS检测探针序列为：5’-(FAM)-CTCCCTTCTCTCCCAC-(MGB)-3’
本专利所述方法需要的引物探针同实施例4
PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，检测探针200nM和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。其中1个单位是指在72℃30分钟掺入10nmol dNTPs所需要的酶量。
使用罗氏lightCycler480荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，2min；40循环(95℃，3s；60℃，25s，单循环)。
本发明实验结果见图10和11，实验的结果通过在VIC的荧光变化来体现的。
ARMS实验结果见图12和13，实验的结果通过在FAM的荧光变化来体现的。
图10中可见该引物探针组合可有效扩增野生型质粒，而突变型质粒无扩增，图11可见该引物探针组合可有效扩增突变型质粒，而野生型质粒无扩增，该发明所采用的引物探针组合会显著区分两种类型的质粒。
图12，图13中可见ARMS引物探针组合会同时扩增野生型质粒及突变型质粒，选择性扩增效果远差于本发明所描述的方法。同时本发明所描述的方法在检测扩增效率上要优于ARMS-PCR法，本发明所述方法的扩增曲线明显较理想。
实施例6：使用本发明所述的方法所设计的两组引物探针组合对CYP4F2*3基因进行检测对比
在这个实施例中，分别选择含有CYP4F2*3突变及野生序列的质粒1000copy，将两组引物探针组合，一组是本发明所述的检测CYP4F2*3的引物探针组合，另一组是根据本发明所述方法设计的检测CYP4F2*3的其它引物探针组合，分别用于CYP4F2*3基因的检测。仅使用突变型引物探针组合检测突变型与野生型，并分两个独立管进行检测。
野生型序列为：同实施例4
突变型序列为：同实施例4
本专利所述方法需要的引物探针同实施例4
CYP4F2*3突变型参比选择性上游引物序列为：
5’-(MGB)-ACACAGCTG(变异体识别区，下划线碱基为多态性位点)AGTGTTTTCGGAACCCATCACA(引物区)-3’
CYP4F2*3参比公共下游引物为：5’-CGCACCTCAGGGTCCGG-3’
CYP4F2*3突变型参比检测探针序列为：
5’-VIC-ACAT(多态性位点)AGCTGGGTTGTGA-MGB-3’
PCR反应体系为25μl，每个反应体系中含有2％甘油，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，正向引物、反向引物各200nM，检测探针200nM和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。其中1个单位是指在72℃30分钟掺入10nmol dNTPs所需要的酶量。
使用ABI 7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR反应和后续的数据分析。PCR热循环条件为95℃，2min；40循环(95℃，3s；60℃，25s，单循环)。
本发明实验结果见图14，实验的结果通过VIC的荧光变化来体现的。
参比实验结果见图15，实验的结果通过VIC的荧光变化来体现的。
图14可见本发明提供的引物探针组合可有效扩增突变型质粒，而野生型质粒基本无扩增，因此本发明所采用的引物探针组合会显著区分两种类型的质粒。
图15中可见参比引物探针组合会同时扩增野生型质粒及突变型质粒，区分效果显著差于本发明所采用的引物探针组合，但区分能力仍优于ARMS法所示的图12。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州新海生物科技股份有限公司
<120> 一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒
<130> MP1717248
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggtatctg ctgtggtgca cgaggtcc 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatgtatctg ctgtggtgca cgaggtcc 28
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaggctggt ggggagaag 19
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctggccaag caagagaaga cctgaaaaac aacc 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccggccaag caagagaaga cctgaaaaac aacc 34
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taggattata ggcgtgagcc acc 23
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acatagctgg agtgttttcg gaacccatca ca 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acacagctgg agtgttttcg gaacccatca ca 32
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggccccgca cctcagg 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caatgtatct ctggacct 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaggtatct ctggacc 17
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acccggccaa tgg 13
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acctggccaa tgg 13
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acacagctgg gttgt 15
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acatagctgg gttgtga 17
<210> 16
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggactgaag gagctgccca tgagaaattt acagggtgag aggctgggat gccaaggctg 60
ggggttcata aatgcagaca gcagttccga tggc 94
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cggactgaag gagctgcc 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccatcggaa ctgctgtctg 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccccagcctt ggcatccca 19

Claims (10)

1.一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法，其特征在于，包括：
步骤1、待测样品无需提取DNA直接采用样品处理液处理，释放DNA；
步骤2、将处理后的待测样品采用华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物以及特异性选择性探针进行荧光定量PCR扩增和检测；
步骤3、根据荧光定量PCR结果的信号及/或信号值进行基因分型。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物为CYP2C9*3型特异性选择性扩增引物、VKORC1型特异性选择性扩增引物和CYP4F2型特异性选择性扩增引物中的一种或两种以上；
其中，所述CYP2C9*3型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，公共下游引物如SEQ ID NO:3所示；
所述VKORC1型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，公共下游引物如SEQ ID NO:6所示；
所述CYP4F2型特异性选择性扩增引物包括野生型扩增上游引物、突变型扩增上游引物和公共下游引物，野生型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:7所示，突变型扩增上游引物序列如SEQ ID NO:8所示，公共下游引物如SEQ ID NO:9所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述野生型扩增上游引物和突变型扩增上游引物的5’端均共价连接有核酸双链稳定因子和/或含有不能被核酸酶水解的修饰因子。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述核酸双链稳定因子包括锁核酸、肽核酸或DNA小沟结合物/类似物中的一种或一种以上的组合，所述修饰因子选自碱基类似物、核酸骨架、脱氧核糖类似物、肽核酸或硫代磷酸酯。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述华法林用药相关基因多态性的特异性选择性探针为CYP2C9*3型特异性选择性探针、VKORC1型特异性选择性探针和CYP4F2型特异性选择性探针中的一种或两种以上；
其中，所述CYP2C9*3型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:10所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:11所示；
所述VKORC1型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:12所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:13所示；
所述CYP4F2型特异性选择性探针包括野生型检测探针和突变型检测探针，野生型检测探针序列如SEQ ID NO:14所示、突变型检测探针序列如SEQ ID NO:15所示；
所述各基因型特异性选择性探针的5’端和3’端分别具有荧光基团和淬灭基团，所述淬灭基团为NFQ-MGB。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述样品处理液包含处理缓冲液、金属离子络合剂和DNA释放促进剂。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述处理缓冲液为Tris-HCl缓冲液，所述金属离子络合剂为EDTA，所述DNA释放促进剂为蛋白酶K。
8.一种快速检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2-4任意一项所述方法中的华法林用药相关基因多态性的特异性选择性扩增引物，以及权利要求5所述方法中的华法林用药相关基因多态性的特异性选择性探针。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR扩增及检测的反应试剂、权利要求6-7任意一项所述方法中的样品处理液，以及基因型对照DNA。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述基因型对照DNA包括CYP2C9*3野生型DNA和突变型DNA、VKORC1野生型DNA和突变型DNA、CYP4F2野生型DNA和突变型DNA中的一对或两对以上。
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