CN109355377A - 华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用，涉及基因多态性的检测。检测试剂盒设有盒体、隔板、盒盖、WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶、WP阴性对照瓶、扩增试剂和对照试剂。制备扩增试剂；制备对照试剂，所述对照试剂包括MP标准对照和MP阴性对照；将扩增试剂和对照试剂设在盒体内，即得华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒。华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒在检测华法林个体化用药相关基因多态性位点的基因型中应用。简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短。

Description

华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及基因多态性的检测，尤其是涉及华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
华法林是一种香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K及其2，3-环氧物(即维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。华法林是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药，在临床使用近60年，主要用于预防和治疗静脉血栓、心肌梗塞、缺血性休克、肺栓塞等多种血栓性疾病和心脏人工瓣膜置换术、人工血管移植术等。由于华法林治疗窗较窄(剂量不足有血栓风险，过量服用可出现致命性出血)、个体间剂量差异大(达到适宜抗凝效果的个体间剂量差异可达10～20倍)、受药物或食物影响较大，使得它位居严重不良反应药物的前10名。
研究表明，华法林的剂量需求受两方面因素影响：一是非遗传因素，主要包括年龄、性别、身高、体重、疾病状态、合并用药等；二是遗传因素，主要包括与华法林药代动力学和药效学相关的蛋白或酶的基因多态性，影响蛋白的表达或酶的活性，从而增加或降低华法林的疗效，是不同个体间的用量产生差异。近年来国内外多项研究显示，遗传因素是造成个体间华法林维持剂量差异的主要原因之一[1,2]，这些遗传因素包括CYP2C9、VKORC1、CYP4F2等约30个基因上的基因多态性位点。
华法林在体内代谢的关键酶为肝脏细胞色素氧化酶P450超家族的第二亚家族的CYP2C9蛋白，该酶将华法林代谢为无活性成分。人CYP2C9基因具有遗传多态性，其中中国人群常见的多态性包括CYP2C9*3(rs1057910)[3,4]、CYP2C9C-65(rs9332127)[5]等基因多态性位点，这些位点突变后，基因编码酶的活性较野生型降低，导致患者对华法林的代谢及清除能力降低，临床表现出对华法林敏感，需要减少给药剂量以减少不良反应的发生。
华法林主要通过作用于维生素K还原酶复合物(VKORC)，抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子，从而发挥抗凝作用。研究表明，编码VKORC蛋白的VKORC1基因多态性也会导致VKORC酶活性改变，从而影响华法林的抗凝效果。其中，VKORC1基因-1639位点的A/G基因多态性位点(rs9923231)可导致基因启动子活性差异，与野生型AA基因型相比，GG和AG基因型启动子活性高，凝血因子生成较多，患者临床表现为华法林抵抗[6]。
CYP4F2是CYP超家族成员之一，主要存在于肝脏和肾脏，为维生素K的单氧酶，近年来研究发现，CYP4F2基因c.1297C>T(rs2108622)多态性能够影响约1％～2％的华法林个体差异代谢[7]，TT患者需要提高华法林剂量，方能达到相同的抗凝效果。
综上所述，CYP2C9*3、CYP2C9C-65、VKORC1-1639G>A和CYP4F2c.1297C>T基因多态性是影响中国人群华法林个体剂量差异的主要因素。在用药前进行这些基因多态性检测，结合患者身高、体重等临床信息，有助于为患者作出合理的华法林剂量，缩短调整时间，降低严重不良反应的发生率。目前检测上述华法林个体化剂量相关多态性的方法交多，包括限制性内切酶片段多态性分析(RFLP)[8]、基因芯片[9]、等位基因特异性PCR[10]、焦磷酸测序[11]、Sanger测序[12]等等，但这些方法存在然而这些技术均存在缺点，例如耗时、操作繁琐、需要昂贵的仪器、检测成本高或对技术人员要求高、需要PCR后处理、易造成PCR产物污染等，大多数方法并不适合用于临床，尤其不适合在包括我国在内的广大发展中国家和地区的临床推广和使用。
熔解曲线(Dissociation Curve)是指随温度升高反映DNA的双螺旋结构解链的曲线。总的DNA双螺旋结构解链一半的温度称为熔解温度，即熔点(Tm)，熔点是双链DNA固有的属性，不同序列的双链DNA，Tm值不同，这与双链DNA的长度、碱基组成相关。在实时PCR(Real-time PCR)技术推出来之后，熔解曲线技术常用来分析基于荧光染料的实时PCR扩增的特异性，根据PCR产物的Tm值的大小判定产物是目标产物还是非特异扩增产物。随着生物技术的发展，仪器设备分辨率的改进，目前基于荧光染料的熔解曲线技术已经发展成的高分辨熔解曲线(High Resolution Melting Curve)技术，该技术可以识别单个碱基的突变，中国专利CN 102605076B将该技术用于CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A的快速基因分型[13]，但由于该技术本身的局限性，一个PCR反应只能同时检测一个位点，且对DNA样本质量要求和技术人员的操作要求非常高，不适合在临床实验室推广应用。
参考文献：
1.Kessler P.[Pharmacogenetics of warfarin][J].Vnitr Lek,2006,52Suppl1:31-34.
2.Gu Q,Kong Y,Schneede J,et al.VKORC1-1639G>A,CYP2C9,EPHX1691A>Ggenotype,body weight,and age are important predictors for warfarinmaintenance doses in patients with mechanical heart valve prostheses insouthwest China[J].Eur J Clin Pharmacol,2010,66(12):1217-1227.
3.Li J,Wang S,Barone J,et al.Warfarin pharmacogenomics[J].P T,2009,34(8):422-427.
4.Zhong SL,Liu Y,Yu XY,et al.The influence of genetic polymorphismsand interacting drugs on initial response to warfarin in Chinese patientswith heart valve replacement[J].Eur J Clin Pharmacol,2011,67(6):581-590.
5.Chern HD,Ueng TH,Fu YP,et al.CYP2C9polymorphism and warfarinsensitivity in Taiwan Chinese[J].Clin Chim Acta,2006,367(1-2):108-113.
6.Yang L,Ge W,Yu F,et al.Impact of VKORC1gene polymorphism oninterindividual and interethnic warfarin dosage requirement--a systematicreview and meta analysis[J].Thromb Res,2010,125(4):e159-166.
7.Stec DE,Roman RJ,Flasch A,et al.Functional polymorphismin humanCYP4F2decreases 20-HETE production[J].Physiol Genomics,2007,30(1):74-81.
8.中国发明专利，公布号：CN 106350599 A.
9.中国发明专利，授权号：CN 105018583 B.
10.中国发明专利，公布号：CN 04711344 A.
11.中国发明专利，授权号：CN 103820553 B.
12.中国发明专利，授权号：CN 102329885 B.
13.中国发明专利，授权号：CN 102605076 B.
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、检测成本高、易污染及通量较低等缺点，提供一种简便快捷、灵敏度高、可靠性强、成本较低的基于荧光PCR熔解曲线技术的华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用。
所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒设有盒体、隔板、盒盖、WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶、WP阴性对照瓶、扩增试剂和对照试剂；所述隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶和WP阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；所述扩增试剂设有WP PCR混合液和WP酶混合液，所述WP PCR混合液装在WP PCR混合液瓶内，WP酶混合液装在WP酶混合液瓶内；所述对照试剂包括WP标准对照和WP阴性对照，所述WP标准对照装在WP标准对照瓶内，WP阴性对照装在WP阴性对照瓶内。
所述WP PCR混合液可包括1.25×PCR缓冲液、3.75mM MgCl2、0.25mM dATP、0.25mMdCTP、0.25mM dGTP、0.25mM dTTP、0.25mM dUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μM VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述WP酶混合液可包括5U/μLTaq DNA聚合酶和0.1U/μL UNG酶。所述PCR缓冲液可采用SSP PCR缓冲液或其它类型的PCR缓冲液。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4和CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4的长度均为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5′-ATCCCCAAAGGTGCTCACAG-3′(SEQ ID NO.1)。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：5′-CCTTGGAATGGACAAAAACAG-3′(SEQ ID NO.2)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-AGAGGGAAATATCACAGACGCCAG-3′(SEQ ID NO.3)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5′-GTGATCCACCCACCTC-3′(SEQ ID NO.4)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3为上游引物，其碱基序列为：5′-GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG-3′(SEQ ID NO.5)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3为下游引物，其碱基序列为：5′-AGGATGAAAGTGGGATCACAGG-3′(SEQ ID NO.6)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4为上游引物，其碱基序列为：5′-GATTGGCAGAAACCGGAG-3′(SEQ ID NO.7)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4为下游引物，其碱基序列为：5′-CTTACCTTGGGAATGAGATAGT-3′(SEQ ID NO.8)。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均可为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，所述靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均可为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
所述荧光基团可为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CALFlour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CALFlour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar 705等中的一种。
所述淬灭基团可为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA等中的一种。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4的长度均可为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1的碱基序列可为：5′-HEX-CAGGGCTGTGTGGCCGGACCCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.9)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2的碱基序列可为：5′-FAM-ACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGT-BHQ1-3′(SEQ ID NO.10)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3的碱基序列可为：5′-CY5-CCACTGTATTTGTTAAgAGATAATAGTAGTGG-BHQ2-3′(SEQ ID NO.11)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4的碱基序列可为：5′-ROX-CAGGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCTGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.12)。
所述WP标准对照可为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述WP阴性对照不含目的基因片段，WP阴性对照可为无菌水或Tris-HCl缓冲液等。
所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)制备扩增试剂；
在步骤1)中，所述制备扩增试剂的具体方法可为：所述扩增试剂包括WP PCR混合液和WP酶混合液；所述WP PCR混合液包括1.25×SSP PCR缓冲液、3.75mM MgCl2、0.25mMdATP、0.25mM dCTP、0.25mM dGTP、0.25mM dTTP、0.25mM dUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μM VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3、0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述MP酶混合液包括5U/μLTaq DNA聚合酶和0.1U/μL UNG酶；所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括MP标准对照和MP阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒。
所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒可在检测华法林个体化用药相关基因多态性位点的基因型中应用，所述应用的具体操作步骤如下：
1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
(1)试剂准备——配液区
①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为：取n×19.8μLMP PCR Mix(n根据反应管数确定)和n×0.2μLMP酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心(如3000rpm离心5s)。PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18℃以下贮存。
②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。
③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18℃以下冰箱储存直至样本提取完。
(2)样品的加样——模板间
①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5μL相应的待检DNA样本、MP标准对照和MP阴性对照，并立即盖严管盖。
②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
(3)PCR扩增和熔解曲线分析——扩增区
①PCR扩增程序可为：
第一步：50℃2min，95℃10min；
第二步：95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
第三步：95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
②熔解曲线分析程序可为：
95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号。
③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。
2)结果判读，具体方法如下：
根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm值的情况进行判断待检样本的华法林个体化用药相关基因多态性位点的基因型。这其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差。数据分析按以下步骤进行：
1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的Tm值；
2)读取待检测样本在各检测通道熔解峰的Tm值；
3)将待检测在各检测通道的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各通道的ΔTm值，参照表1，判断待检含有的等位基因及基因型。
表1
注：“-”表示无。
本发明的有益效果是：
1.简便快速、单反应可检测多个位点、耗时短：本发明在单个PCR体系中即可完成多种华法林个体化用药相关基因多态性位点的检测，PCR扩增结束后只需一次荧光PCR熔解曲线分析就可获得各基因多态性位点的基因型，整个操作在2～3h即可完成，操作步骤少、耗时短；
2.均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
3.检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
4.检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的个数及熔点变化来判定样本的各基因多态性位点的基因型，其中熔点由仪器自动判读，结果客观，不易出错，故检测特异性高。
5.所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒可应用于临床上华法林个体化用药相关基因多态性检测和基因分型，从而指导华法林的个体化用药剂量。
附图说明
图1为本发明的基本原理和检测样本的流程图。
图2为本发明所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒实施例结构组成示意图。
图3为本发明检测实施例1样本的FAM荧光通道的熔解曲线结果图。
图4为本发明检测实施例1样本的HEX荧光通道的熔解曲线结果图。
图5为本发明检测实施例1样本的ROX荧光通道的熔解曲线结果图。
图6为本发明检测实施例1样本的CY5荧光通道的熔解曲线结果图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明的基本原理(参见图1)是针对每个待检测的基因多态性位点均设计一对引物和一条覆盖基因多态性位点的自淬灭荧光探针，将各位点的引物和探针均加入PCR反应管后，进行不对称PCR扩增，PCR扩增后产生大量可与相应荧光探针互补的单链产物，随后进行低温到高温的熔解曲线分析，在熔解曲线分析阶段，低温时各荧光探针与对应的PCR单链产物结合，形成异源双链，随着温度的升高，异源双链慢慢解链，其中荧光变化最快时的温度，即是异源双链的熔解温度，即熔点(Tm值)。由于荧光探针与匹配程度不同靶形成的异源双链的稳定性不同，故其Tm值亦有所不同，荧光探针与完全互补的靶形成的异源双链的熔点最高，与有一个或两个碱基错配的靶形成的异源双链的熔点较低，其熔点与错配碱基的类型、位置均有关系。
参见图2，本发明所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒实施例设有盒体1、隔板2、盒盖3、MP PCR混合液瓶4、MP酶混合液瓶5、MP标准对照瓶6和MP阴性对照瓶7，隔板2设在盒体1内，盒盖3设在盒体1上，MP PCR混合液瓶4、MP酶混合液瓶5、MP标准对照瓶6和MP阴性对照瓶7分别插入隔板2上的瓶孔内。
MP PCR混合液瓶4内装有MP PCR混合液，MP酶混合液瓶5内装有MP酶混合液，MP标准对照瓶6内装有MP标准对照，MP阴性对照瓶7内装有MP阴性对照。
所述扩增试剂包括MP PCR混合液和MP酶混合液；所述MP PCR混合液包括1.25×SSP PCR缓冲液、3.75mM MgCl2、0.25mM dATP、0.25mM dCTP、0.25mM dGTP、0.25mM dTTP、0.25mM dUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μM VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述MP酶混合液包括5U/μLTaq DNA聚合酶和0.1U/μL UNG酶。
所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5′-ATCCCCAAAGGTGCTCACAG-3′(SEQ ID NO.1)。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：5′-CCTTGGAATGGACAAAAACAG-3′(SEQ ID NO.2)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-AGAGGGAAATATCACAGACGCCAG-3′(SEQ ID NO.3)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5′-GTGATCCACCCACCTC-3′(SEQ ID NO.4)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的扩增引物F3为上游引物，其碱基序列为：5′-GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG-3′(SEQ ID NO.5)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的扩增引物R3为下游引物，其碱基序列为：5′-AGGATGAAAGTGGGATCACAGG-3′(SEQ ID NO.6)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的扩增引物F4为上游引物，其碱基序列为：5′-GATTGGCAGAAACCGGAG-3′(SEQ ID NO.7)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的扩增引物R4为下游引物，其碱基序列为：5′-CTTACCTTGGGAATGAGATAGT-3′(SEQ ID NO.8)。
所述荧光探针是那些与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但是不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标等。
所述荧光探针为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
所述荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CALFlour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CALFlour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar 705等中的一种。
所述淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA等中的一种。
荧光探针的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％。
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1的碱基序列为：5′-HEX-CAGGGCTGTGTGGCCGGACCCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.9)。
所述VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2的碱基序列为：5′-FAM-ACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGT-BHQ1-3′(SEQ ID NO.10)。
所述CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3的碱基序列为：5′-CY5-CCACTGTATTTGTTAAgAGATAATAGTAGTGG-BHQ2-3′(SEQ ID NO.11)。
所述CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4的碱基序列为：5′-ROX-CAGGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCTGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.12)。
所述对照试剂包括MP标准对照和MP阴性对照。
所述MP标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA。
所述MP阴性对照不含目的基因片段，优选为无菌水或Tris-Hcl缓冲液。
所述PCR缓冲液可以是SSP PCR缓冲液，也可以是其它类型的PCR缓冲液。
以下给出具体实施例：
用本发明的制备的试剂盒检测病例样品的华法林个体化用药相关基因的多态性位点，考察试剂盒检测样本的特异性和准确性。
按图1所描述的样本检测流程，利用本发明对14份已知个体化用药相关基因的多态性基位点的基因型的病例样本[外周血，经Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生物科技有限公司)进行基因组DNA的提取，已测序验证相关基因的多态性位点的基因型]进行检测，同时设置一份标准对照和阴性对照，包括以下步骤：
1)分别以各待检测样本、标准对照为模板，配制PCR反应液：25μL PCR反应液中包括：5μL DNA模板(阴性对照为水)，1×SSP PCR缓冲液、3.0mM MgCl2、1U Taq DNA聚合酶、0.02UUNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP各0.25mM，0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.6μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1，0.06μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.6μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2，1μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.1μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3，0.06μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.6μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4，0.2μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.22μMVKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.12μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3、0.2μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4。
2)将上述装有PCR反应液的PCR反应管置于荧光PCR仪器(Bio-Rad CFX 96)上(进行PCR扩增和熔解曲线分析，具体反应程序为：
(1)50℃2min，95℃10min；
(2)95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
(3)95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
(4)95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号。
3)结果分析：阴性对照在各通道均无熔解峰，标准对照及各待测样本在各通道的熔解曲线分析结果见图3(FAM通道)、图4(HEX通道)、图5(ROX通道)和图6(CY5通道)，由荧光PCR仪自带的熔解曲线分析软件读取标准对照及各待测样本在各通道的Tm值(各样本在各荧光通道的Tm值结果见表2)，再将样本的各检测通道的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各通道的ΔTm值，根据结果判读表(表1)，获得各样本的基因型(各
表2
样本华法林个体化用药相关基因的多态性位点基因型检测结果见表3)。
表3
本实施例得到的14份样本的华法林个体化用药相关基因的多态性位点基因型均与样本的测序获得的基因型一致，准确性及特异性均为100％。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccccaaag gtgctcacag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttggaatg gacaaaaaca g 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagggaaat atcacagacg ccag 24
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgatccacc cacctc 16
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgttaagg gaatttgtag g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggatgaaag tgggatcaca gg 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gattggcaga aaccggag 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttaccttgg gaatgagata gt 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagggctgtg tggccggacc ctg 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acctgaaaaa caaccattgg ccaggt 26
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccactgtatt tgttaagaga taatagtagt gg 32
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagggtccag agataccttg accttctccc tga 33

Claims (10)

1.华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于设有盒体、隔板、盒盖、WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶、WP阴性对照瓶、扩增试剂和对照试剂；所述隔板设在盒体内，盒盖设在盒体上，WP PCR混合液瓶、WP酶混合液瓶、WP标准对照瓶和WP阴性对照瓶分别插入隔板上的瓶孔内；所述扩增试剂设有WP PCR混合液和WP酶混合液，所述WP PCR混合液装在WP PCR混合液瓶内，WP酶混合液装在WP酶混合液瓶内；所述对照试剂包括WP标准对照和WP阴性对照，所述WP标准对照装在WP标准对照瓶内，WP阴性对照装在WP阴性对照瓶内。
2.如权利要求1所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述WP PCR混合液包括1.25×PCR缓冲液、3.75mM MgCl2、0.25mM dATP、0.25mMdCTP、0.25mMdGTP、0.25mM dTTP、0.25mM dUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μM VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述WP酶混合液包括5U/μLTaq DNA聚合酶和0.1U/μL UNG酶；所述PCR缓冲液可采用SSP PCR缓冲液或其它类型的PCR缓冲液。
3.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4和CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4的长度均为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃。
4.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1为上游引物，其碱基序列为：5′-ATCCCCAAAGGTGCTCACAG-3′(SEQ ID NO.1)；
所述CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1为下游引物，其碱基序列为：5′-CCTTGGAATGGACAAAAACAG-3′(SEQ ID NO.2)；
所述VKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2为上游引物，其碱基序列为：5′-AGAGGGAAATATCACAGACGCCAG-3′(SEQ ID NO.3)；
所述VKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2为下游引物，其碱基序列为：5′-GTGATCCACCCACCTC-3′(SEQ ID NO.4)；
所述CYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3为上游引物，其碱基序列为：5′-GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG-3′(SEQ ID NO.5)；
所述CYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3为下游引物，其碱基序列为：5′-AGGATGAAAGTGGGATCACAGG-3′(SEQ ID NO.6)；
所述CYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4为上游引物，其碱基序列为：5′-GATTGGCAGAAACCGGAG-3′(SEQ ID NO.7)；
所述CYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4为下游引物，其碱基序列为：5′-CTTACCTTGGGAATGAGATAGT-3′(SEQ ID NO.8)。
5.如权利要求2所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均为与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，所述靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针包括但不限于自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标；
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4均为5′末端和3′末端分别标记荧光基团和淬灭基团的自淬灭探针。
6.如权利要求5所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述荧光基团为ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5、Quasar 705中的一种；
所述淬灭基团为DABCYL、BHQ系列、ECLIPSE、TAMRA中的一种；
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3和CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4的长度均为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～80℃，GC含量40％～70％；
所述CYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1的碱基序列为：5′-HEX-CAGGGCTGTGTGGCCGGACCCTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.9)；
所述VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2的碱基序列为：5′-FAM-ACCTGAAAAACAACCATTGGCCAGGT-BHQ1-3′(SEQ ID NO.10)；
所述CYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3的碱基序列为：5′-CY5-CCACTGTATTTGTTAAgAGATAATAGTAGTGG-BHQ2-3′(SEQ ID NO.11)；
所述CYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4的碱基序列为：5′-ROX-CAGGGTCCAGAGATACCTTGACCTTCTCCCTGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.12)。
7.如权利要求1所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒，其特征在于所述WP标准对照为正常人基因组DNA，即为野生型人基因组DNA；
所述WP阴性对照不含目的基因片段，WP阴性对照为无菌水或Tris-HCl缓冲液。
8.如权利要求1～7所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备扩增试剂；
2)制备对照试剂，所述对照试剂包括MP标准对照和MP阴性对照；
3)将步骤1)制备的扩增试剂和步骤2)制备的对照试剂设在盒体内，即得华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒。
9.如权利要求8所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备扩增试剂的具体方法为：所述扩增试剂包括WP PCR混合液和WP酶混合液；所述WP PCR混合液包括1.25×SSP PCR缓冲液、3.75mM MgCl2、0.25mM dATP、0.25mM dCTP、0.25mM dGTP、0.25mM dTTP、0.25mM dUTP、0.06μMCYP4F2基因rs2108622位点的上游扩增引物F1、0.75μM CYP4F2基因rs2108622位点的下游扩增引物R1、0.075μMVKORC1基因rs9923231位点的上游扩增引物F2、0.75μMVKORC1基因rs9923231位点的下游扩增引物R2、1.25μMCYP2C9基因rs9332127位点的上游扩增引物F3、0.125μMCYP2C9基因rs9332127位点的下游扩增引物R3、0.075μMCYP2C9基因rs1057910位点的上游扩增引物F4、0.75μMCYP2C9基因rs1057910位点的下游扩增引物R4、0.25μMCYP4F2基因rs2108622位点的荧光探针P1、0.275μM VKORC1基因rs9923231位点的荧光探针P2、0.15μMCYP2C9基因rs9332127位点的荧光探针P3、0.25μMCYP2C9基因rs1057910位点的荧光探针P4；所述MP酶混合液包括5U/μLTaq DNA聚合酶和0.1U/μL UNG酶；所述扩增引物的长度为15～40bp的寡核苷酸链，Tm为50～75℃。
10.如权利要求1～7所述华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒在检测华法林个体化用药相关基因多态性位点的基因型中应用，所述应用的具体操作步骤为：
1)PCR扩增和熔解曲线分析，具体方法如下：
(1)试剂准备——配液区
①首先将扩增试剂从冰箱取出并平衡至室温，PCR反应液配液标准为：取n×19.8μLMPPCR Mix和n×0.2μLMP酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，然后瞬时离心，PCR反应液应即配即用，隔夜使用需-18℃以下贮存；其中，n根据反应管数确定；所述离心的条件为3000rpm离心5s；
②PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管；
③将配制好的PCR反应管转移至提取间，贮存于-18℃以下冰箱储存直至样本提取完；
(2)样品的加样——模板间
①用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入5μL相应的待检DNA样本、MP标准对照和MP阴性对照，并立即盖严管盖；
②将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区；
(3)PCR扩增和熔解曲线分析——扩增区
①PCR扩增程序为：
第一步：50℃2min，95℃10min；
第二步：95℃15s→65～56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65～56℃15s每个循环下降1℃；
第三步：95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环；
②熔解曲线分析程序为：
95℃1min→35℃3min→40～85℃，其中40～85℃以0.5℃/5s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集探针所对应通道FAM、HEX、ROX、CY5的荧光信号；
③程序运行完毕，将PCR薄壁反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理；
2)结果判读，具体方法如下：
根据荧光PCR熔解曲线分析结果中，待检测样本与标准对照在各通道熔解峰的Tm值的情况进行判断待检样本的华法林个体化用药相关基因多态性位点的基因型；这其中涉及待测样本和标准对照熔点值的读取，标准对照作为校正，用来减少仪器和操作而引起的熔点误差；数据分析按以下步骤进行：
1)读取标准对照在各检测通道的熔解峰的Tm值；
2)读取待检测样本在各检测通道熔解峰的Tm值；
3)将待检测在各检测通道的Tm值减去标准对照在各检测通道对应的Tm值，得到各通道的ΔTm值，参照表1，判断待检含有的等位基因及基因型；
表1
注：“-”表示无。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195105A (zh) * 2019-07-16 2019-09-03 苏州新海生物科技股份有限公司 一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒
CN111593104A (zh) * 2019-02-20 2020-08-28 葛猛 检测CYP4F2基因rs2108622位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101545005A (zh) * 2008-03-27 2009-09-30 李文正纳米研究院 利用单核苷酸多态性分析辅助确定中国汉族患者华发林使用剂量的方法和生物芯片
CN102534001A (zh) * 2012-01-06 2012-07-04 尹彤 适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒
CN104120080A (zh) * 2014-08-01 2014-10-29 厦门大学 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
CN104561302A (zh) * 2014-12-31 2015-04-29 中国医学科学院阜外心血管病医院 Cyp4f2基因多态性的检测方法以及该方法的核酸探针和试剂盒
CN107904302A (zh) * 2017-11-29 2018-04-13 昆明理工大学 一组同时检测抗凝药物相关基因多态性的引物及应用
CN108570498A (zh) * 2018-05-25 2018-09-25 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用
CN108642152A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 深圳鼎新融合科技有限公司 基因分型检测的试剂盒及方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101545005A (zh) * 2008-03-27 2009-09-30 李文正纳米研究院 利用单核苷酸多态性分析辅助确定中国汉族患者华发林使用剂量的方法和生物芯片
CN102534001A (zh) * 2012-01-06 2012-07-04 尹彤 适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒
CN104120080A (zh) * 2014-08-01 2014-10-29 厦门大学 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
CN104561302A (zh) * 2014-12-31 2015-04-29 中国医学科学院阜外心血管病医院 Cyp4f2基因多态性的检测方法以及该方法的核酸探针和试剂盒
CN107904302A (zh) * 2017-11-29 2018-04-13 昆明理工大学 一组同时检测抗凝药物相关基因多态性的引物及应用
CN108642152A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 深圳鼎新融合科技有限公司 基因分型检测的试剂盒及方法
CN108570498A (zh) * 2018-05-25 2018-09-25 山东维真生物科技有限公司 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAY P. S. LAM等: "The pharmacogenetics of the response to warfarin in Chinese", 《BRITISH JOURNAL OF CLINICAL》 *
MENG WEI等: "A new algorithm to predict warfarin dose from polymorphisms of CYP4F2, CYP2C9 and VKORC1 and clinical variables: Derivation in Han Chinese patients with non valvular atrial fibrillation", 《THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593104A (zh) * 2019-02-20 2020-08-28 葛猛 检测CYP4F2基因rs2108622位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒
CN110195105A (zh) * 2019-07-16 2019-09-03 苏州新海生物科技股份有限公司 一种快速检测华法林用药相关基因多态性的方法和试剂盒

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