CN107083445A

CN107083445A - 一种多重荧光pcr法检测cyp2c19基因多态性的试剂盒

Info

Publication number: CN107083445A
Application number: CN201710471031.9A
Authority: CN
Inventors: 童超; 陈智林; 魏莎莎; 高幼冷
Original assignee: Jiaxing Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Jiaxing Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2017-08-22

Abstract

本发明提供一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，本试剂盒能对抗凝全血、石蜡组织切片、组织样本中的CYP2C19基因多态性进行检测，判断其CYP2C19*2（681G>A）型野生及突变纯合或杂合状态、以及CYP2C19*3（636G>A）型野生及突变纯合或杂合状态。本发明所述试剂盒能够在短时间内得到准确的结果，适用于临床上个体化用药的指导。

Description

一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒

技术领域

本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。

背景技术

肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450(cytochromeP450 )是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，从而产生血药浓度的个体差异。CYP2C19酶广泛分布于肝、肾、脑、皮肤、肺、胃肠道及胎盘等组织器官，主要在肝脏。其参与多种外源性物质代谢如：药物、酒精、抗氧化剂、有机溶剂、染料、环境污染物质等。从理论上讲，所有的药物代谢酶都具有遗传多态性。绝大多数药物代谢酶的多态性是一种单基因多态性，是由于同一基因位点上具有多个等位基因引起的。遗传学的改变使CYP450酶表现出遗传多态性，并且具有明显个体、种族或地域差异。

等位基因编码的代谢酶具有不同的代谢能力：正常野生型表现为快代谢型(EM)；绝大多数突变型等位基因，因碱基的突变、插入或缺失而造成酶代谢能力降低，表现为慢代谢型(PM)，这对治疗的个体反应和药物毒副作用都产生重要影响。

CYP2C19至少存在14种突变基因和18种等位基因突变。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1，CYP2C19等位基因主要是*1，*2，*3……*17。而CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上。*2，*3等位基因编码的酶无活性，CYP2C19*2 等位基因变异的外显子5第681位处的碱基发生变异(G/A)形成了一个异常剪接点，使得转录时在外显子5的始端丢失了40个碱基对(643-682bp)，从而在翻译时丢失了215-227位氨基酸，使215位氨基酸开头的阅读框架发生移动，因此在215位氨基酸下游第20个氨基酸处提前产生1个终止密码，使蛋白合成过早被终止，结果使这一截短的含234个氨基酸的蛋白质丧失了催化活性。由此导致的慢代谢在中国人中的发生率约为30%。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。通过该酶代谢的药物（如质子泵抑制剂，抗惊厥药等）随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。

CYP2C19基因多态性对酸相关性疾病及幽门螺杆菌感染的治疗疗效、慢性肝病及肝移植患者的药物选择、抗癫痫药物及抗抑郁药物剂量的调整以及肿瘤高危性的判断、免疫抑制剂不良反应的大小等均有影响。基因型与代谢速度相关性见下表：

目前，临床上用于检测CYP2C19基因多态性的方法主要有PCR-测序法，PCR凝胶电泳法，PCR-基因芯片法，实时荧光PCR法。（1）PCR-测序法：此方法为在PCR结束后将PCR产物进行测序，从测序结果判断基因型，测序法操作复杂、检测周期长、成本较高。（2）PCR凝胶电泳法：此方法为在PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果判断基因型别，此方法特异性不高，容易产生假阳性结果。（3）PCR-基因芯片法：此方法将PCR产物与基因芯片进行杂交反应，从而判断基因型别，此方法操作复杂，且需要在PCR结束后对PCR产物进行一系列操作，容易造成样本之间的交叉污染。（4）实时荧光PCR法：实时荧光PCR法只需一步扩增，无需后续操作就能得到基因分型结果，灵敏度高、特异性好，操作简单且易于实现自动化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明能对抗凝全血、石蜡组织切片、组织样本中的CYP2C19基因多态性进行检测，判断其CYP2C19*2（681G>A）型野生及突变纯合或杂合状态、以及CYP2C19*3（636G>A）型野生及突变纯合或杂合状态。本发明所述试剂盒能够在短时间内得到准确的结果，适用于临床上个体化用药的指导。

试剂盒共包含5个组分：CYP2C19*2反应缓冲液，CYP2C19*3反应缓冲液，酶混合液，阳性对照，阴性对照，

CYP2C19*2反应缓冲液包含CYP2C19*2引物及CYP2C19*2探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl₂、KCl；

CYP2C19*3反应缓冲液包含CYP2C19*3引物及CYP2C19*3探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl₂、KCl；

酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；

阳性对照包含CYP2C19*2野生型质粒、CYP2C19*2突变型质粒、CYP2C19*3野生型质粒、CYP2C19*3突变型质粒、内控质粒及TE水；

阴性对照包含TE水。

引物探针序列：

质粒序列为：

质粒制备方法：

委托厦门纽克泰生物技术有限公司合成上述质粒序列，然后通过TA克隆的方法，将该序列连接至PGEM-T载体上，转化到JM109大肠杆菌中进行培养，然后提取质粒并稀释至5.0×10⁸copies/mL备用。

试剂组分配方：

CYP2C19*2反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾）80mmol/L，MgCl₂（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3wt.%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，CYP2C19*2上游引物333nmol/L，CYP2C19*2下游引物333nmol/L，CYP2C19*2野生型探针和突变型探针各100nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。

CYP2C19*3反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾） 80mmol/L，MgCl₂（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，CYP2C19*3上游引物333nmol/L，CYP2C19*3下游引物333nmol/L，CYP2C19*3野生型探针和突变型探针各100nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。

酶混合液配方：热启动Taq酶2U/µL，UNG酶0.1U/µL。PCR扩增条件为：38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，58℃ 45秒（采集荧光），40循环。

本发明的优点在于：

本发明具有以下优势：1、灵敏度达到0.5ng/µL；2、实时荧光PCR法检测，只需一次扩增即可得到结果，免去后续测序或杂交检测步骤；3、能够准确区分纯合型及杂合型；4、在反应中加入内控，能够实时监控反应成功与否。

有益效果：1、减少实验步骤、缩短检测时间，提高检测效率；2、采用多重实时荧光PCR法检测，降低检测成本；3、降低患者经济负担。

附图说明

图1 CYP2C19*1*1检测结果图。

图2 CYP2C19*2*2检测结果图。

图3 CYP2C19*3*3检测结果图。

图4 CYP2C19*1*2检测结果图。

图5 CYP2C19*1*3检测结果图。

图6 CYP2C19*2*3检测结果图。

具体实施方式

实施例1

1、试剂配制

（1）CYP2C19*2反应缓冲液的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma^®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma^® Base 720μL，100mmol/L的MgCl₂ 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的CYP2C19*2上游引物33.3µL，100μmol/L的CYP2C19*2下游引物33.3µL，100μmol/L的CYP2C19*2野生型探针和突变型探针各10μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（2）CYP2C19*3反应缓冲液的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma^®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma^® Base 720μL，100mmol/L的MgCl₂ 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的CYP2C19*3上游引物33.3µL，100μmol/L的CYP2C19*3下游引物33.3µL，100μmol/L的CYP2C19*3野生型探针和突变型探针各10μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（3）酶混合液的配制

取10mL容量瓶，分别加入5000U/mL的热启动Taq酶4mL，5000U/mL的UNG酶0.2mL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（4）阴性对照的配制

取10mL容量瓶，加入TE水定容至10mL，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（5）阳性对照的配制（浓度为5.0×10³copies/mL）

取10mL容量瓶，分别加入5.0×10⁵copies/mL的CYP2C19*2野生型质粒、CYP2C19*2突变型质粒、CYP2C19*3野生型质粒、CYP2C19*3突变型质粒和内控质粒（质粒委托厦门纽克泰生物技术有限公司合成）各100µL。用TE水定容至100mL，混匀后，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

2、核酸提取

采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间。

3、加样上机

（1）反应混合物配制

取出CYP2C19*2反应缓冲液、CYP2C19*3反应缓冲液、酶混合液室温放置，使其充分溶解，配制反应混合物（每测试配置体系：29.5µL反应液+0.5µL 酶混合液），按照需要计算好试剂用量，充分混合均匀后，3000-5000g离心5秒。

（2）加样

取28μL的上述PCR反应液分装至PCR反应管、八连条或96孔PCR反应板的n个上样孔中，分别加入样本DNA、CYP2C19阳性对照或CYP2C19阴性对照各2μL。将管盖或封膜密封后，轻轻混匀并短暂离心，置入荧光PCR扩增仪内。

（3）上机检测

（1）循环条件设置

（2）检测模式：

4、结果判断

（1）阴性对照FAM通道、HEX通道的Cp/Ct应＞36或无读值，ROX通道的Cp/Ct应Cp/Ct＞33或无读值；阳性对照FAM通道、HEX通道的Cp/Ct 应≦36，ROX通道的Cp/Ct 应≦33；

（2）样本测试结果应以下表判断：

实施例2

1、试剂特异性验证

（1）实验样本

采取6份特异性样本对试剂的特异性进行验证，分别为2份为生理盐水样本、2份为大肠杆菌、2份为小牛血清样本。

（2）实验过程

采用本方法所述试剂分别检测以上6份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。

（3）实验结果

6份特异性样本检测结果皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：

特异性检测结果

2、试剂精密性验证

（1）实验样本

采取1份CYP2C19*1*2样本、1份CYP2C19*1*3样本对试剂的精密性进行验证。

（2）实验过程

用本方法所述试剂重复检测以上样本20次，分析检测结果，验证试剂的精密性。

（3）实验结果

本试剂盒检测精密性样本的批内变异系数（CV值）＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：

精密性检测结果

3、试剂最低检测限验证

（1）实验样本

将1份CYP2C19*1*2样本及1份CYP2C19*1*3样本提取DNA后，分别稀释为0.5ng/µL，作为最低检测限样本。

（2）实验过程

本方法所述试剂分别重复检测以上最低检测限样本20次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。

（3）实验结果

检测两种质粒最低检测限样本均为阳性，试剂的最低检测限为0.5ng/µL。具体结果见下表：

实施例3：检测100例临床样本的结果

1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。

2、于南京军区福州总院获得100例临床胃黏膜石蜡切片样本，采用嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司石蜡组织核酸提取试剂（磁珠法）提取100例临床样本的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA样本的纯度，100例样本OD260/OD280皆在1.6~2.0之间。

3、按照实施例1所示的步骤，进行DNA加样并上荧光定量PCR仪进行检测，本次使用的仪器为Bio-rad CFX96。

4、采用测序法检测上述100例样本。

5、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：

检测结果见附图1~6。

图1为CYP2C19*1*1样本检测结果图，其中*2野生、*3野生为阳性，其他为阴性；图2为CYP2C19*2*2样本检测结果图，其中*2突变、*3野生为阳性，其他为阴性；图3为CYP2C19*3*3样本检测结果图，其中*2野生、*3突变为阳性，其他为阴性；图4为CYP2C19*1*2样本检测结果图，其中*2野生、*2突变、*3野生为阳性，其他为阴性；图5为CYP2C19*1*3样本检测结果图，其中*2野生、*3野生、*3突变为阳性，其他为阴性；图6为CYP2C19*2*3样本检测结果图，其中*2野生、*2突变、*3野生、*3突变、内控为阳性，其他为阴性；

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司

<120> 一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒

<130> 16

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcaataatt ttcccactat ca 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccatcgatt cttggtgttc 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccgggaacc cataac 16

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaggaacc cataaca 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctccctgca atgtgatct 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttggattt cccagaaaaa 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctggatccag gtaaggc 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgaatccag gtaaggcc 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caacgtgtca gtggtggac 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcaaaggtg gaggagtggg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gccgtctaga aaaacctgcc 20

<210> 12

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgcaataatt ttcccactat cattgattat ttcccgggaa cccataacaa attacttaaa 60

aaccttgctt ttatggaaag tgatattttg gagaaagtaa aag 103

<210> 13

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgcaataatt ttcccactat cattgattat ttcccaggaa cccataacaa attacttaaa 60

aaccttgctt ttatggaaag tgatattttg gagaaagtaa aag 103

<210> 14

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctccctgca atgtgatctg ctccattatt ttccagaaac gtttcgatta taaagatcag 60

caatttctta acttgatgga aaaattgaat gaaaagatca ggattgtaag caccccctgg 120

atgcaggtaa ggccaagttt tttgcttcct gagaaaccac ttacagtctt tttttctggg 180

aaatccaaaa 190

<210> 15

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctccctgca atgtgatctg ctccattatt ttccagaaac gtttcgatta taaagatcag 60

caatttctta acttgatgga aaaattgaat gaaaagatca ggattgtaag caccccctga 120

atgcaggtaa ggccaagttt tttgcttcct gagaaaccac ttacagtctt tttttctggg 180

aaatccaaaa 190

<210> 16

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caacgtgtca gtggtggacc tgacctgccg tctagaaaaa cctgccaaat atgatgacat 60

caagaaggtg gtgaagcagg cgtcggaggg ccccctcaag ggcatcctgg gctacactga 120

gcaccaggtg gtctcctctg acttcaacag cgacacccac tcctccacct ttgac 175

Claims

1.一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下：

CYP2C19*3反应缓冲液包含CYP2C19*3引物及CYP2C19*3探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl₂、KCl。

2.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下：

酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；

阳性对照包含质粒及TE水；

阴性对照包含TE水。

3.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述CYP2C19*2引物为：F：tgcaataattttcccactatca、R：tccatcgattcttggtgttc，CYP2C19*2探针为：*2野生FAM-cccgggaacccataac-BHQ1，*2突变HEX- cccaggaacccataaca-BHQ1；

内控引物为：F：caacgtgtcagtggtggac、R：gtcaaaggtggaggagtggg，内控探针为：ROX-gccgtctagaaaaacctgcc-BHQ2。

4.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于：所述的CYP2C19*3特异性引物为：F：gctccctgcaatgtgatct、R：ttttggatttcccagaaaaa，CYP2C19*3探针为：*3野生FAM- ctggatccaggtaaggc-BHQ1，*3突变HEX- ctgaatccaggtaaggcc-BHQ1；

5.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测CYP2C19基因多态性的试剂盒，其特征在于：PCR扩增条件为：38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，58℃ 45秒（采集荧光），40循环。