CN107893114A - 用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对。所述引物对包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针。本发明涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液、PCRbuffer、dNTP、无核酸酶水及HS Taq酶。本发明还涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法。本发明提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测快速、准确性高、特异性好、灵敏性好、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

Description

用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、 试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

CYP3A家族是人体内介导最多数量药物代谢的药物代谢酶，在体内占CYP450总量的70％，占肝内CYP450的30％，参与60％以上常用药物在体内的代谢转化。目前，在人体内己发现4种CYP3A～基因，即CYP3A4、CYF3A5、CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4 是临床上最重要的P450酶之一，参与代谢38个类别的150多种药物的氧化代谢，约占全部药物的50％，是许多药物因相互作用发生不良反应的根源。

CYP3A4在肝脏中含量及其酶活性存在明显的个体差异，肝微粒体中可相差40倍，在体内则有5倍的个体间差异，遗传因素是造成这种差异的主要原因，即编码CYP3A4酶的基因存在多态性。多数 CYP3A4的单核苷酸多态性可以影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。编码CYP3A4 蛋白的基因位于染色体7q21.3-22.1，编码区域包含13个外显子和12 个内含子，主要调控其转录及表达的结构区位于5端，长约27kb， CYP3A4基因多态性具体详见CYP等位基因数据库 (http://www.cypalleles.ki.se)。迄今为止，CYP3A4有40个等位基因及单体型已经确定，不同种族间CYP3A4SNPs的发生频率不同，如CYP3A4*3和*17仅在白种人中发现，CYP3A4*15只在黑种人中发现，而CYP3A4*16仅存在于日本人和墨西哥人中，在已发现的 SNPs中，CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中国人中已确定，它们的发生频率分别为1.5％，0.98％，0.5％，2％和2％，突变频率较低。 2004年日本人通过大规模测序方法，在内含子10上发现了 CYP3A4*1G(20230G>A)。CYP3A4*1G是目前已发现的中国人所有的CYP3A4单核苷酸多态性中发生频率最高的一个位点，约为 20-30％。2006年，Du J等在60名健康中国人发现CYP3A4*1G等位基因频率为37％，后来又筛查了264名侗族、488名汉族和230名畲族人群，发现CYP3A4*1G等位基因频率分别为29％、22.1％和31.2％。

临床发现应用相同剂量芬太尼后其镇痛效果及不良反应存在明显的个体差异，研究认为静脉注射芬太尼后体内药动学个体差异导致血药浓度的个体差异是产生这种现象的重要原因。研究表明，芬太尼类药物在肝脏内主要通过CYP3A4酶代谢。其基因多态性对酶活性的影响可导致此类药物在体内的代谢及术后药物需求量的改变。 Zhang等人的研究中在194例拟行上腹部手术的妇科患者中进行 CYP3A4*1G突变基因分型，采用芬太尼术后自控镇痛，同时进行测定CYP3A4酶活性，研究发现，CYP3A4*1G突变与芬太尼术后静脉镇痛效应有关，可降低术后芬太尼消耗量。张豪勇等人研究中发现在健康成年女性中，静脉应用芬太尼后CYP3A4*1G/*1G组终末消除半衰期tl/2β较突变杂合子组和野生纯合子组长，AUC0～∞也较突变杂合子组和野生纯合子组高。因此，进行CYP3A4*1G基因分型检测，可以为临床芬太尼类镇痛药的个体化用药提供参考。

由于每个人的遗传因素不同，同一种药物，对于不同的个体其疗效和副作用就会存在着明显的个体差异，因此临床上在对病人进行药物治疗时需首先进行相关药物代谢酶和受体基因型的检测，然后选择合适的药物进行治疗，它可以根据病人的基因信息为其提供“定制医疗”服务，使治疗更加具体而精准。

目前常采用的基因多态性检测技术主要包括测序法和荧光法。测序法存在操作繁琐、耗时长、灵敏度低等缺点，限制了其在临床实验室的快速准确筛查。因此，我们根据目前临床芬太尼类药物治疗的现状，选择了与常用芬太尼类药物的药代动力学过程和药效学过程密切相关的CYP3A4*1G基因多态性，开发一种具有完善质控，检测快速、准确的用于CYP3A4*1G基因多态性检测的试剂盒。此外，本发明采用TAQMAN等位基因技术与荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。

发明内容

为了解决传统临床经验医疗方式诊断及芬太尼类药物用药时易出现临床用药不良反应且没有合适的试剂盒产品的技术问题，本发明提供一种操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及其方法。

本发明提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对，包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针，如下：

CYP3A4*1G正向引物：

5'-AGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTC-3'(SEQ ID NO.1)；

CYP3A4*1G反向引物：

5'-CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT-3'(SEQ ID NO.2)；

CYP3A4*1G突变型探针：

5'FAM-CATGTATCATCCACTCAC-MGB 3'(SEQ ID NO.3)；

CYP3A4*1G野生型探针：

5'VIC-ATGTACCATCCACTCAC-MGB 3'(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的 PCR反应液，所述PCR反应液为CYP3A4*1G PCR反应液，其包括：

CYP3A4*1G正向引物、CYP3A4*1G反向引物、CYP3A4*1G突变型探针及CYP3A4*1G野生型探针；

上述PCR反应液还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶及无核酸酶水。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCR buffer，0.2μM的各特异性引物及探针、0.25mM的dNTP、1U的HS Taq酶。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；

所述阳性对照品一为CYP3A4*1G基因位点野生型质粒；

所述阳性对照品二为CYP3A4*1G基因位点野生型与突变型按 1：1数量比杂合的质粒；

所述阳性对照品三为CYP3A4*1G基因位点突变型质粒。

在本发明提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。

本发明还提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；

步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；

步骤三：进行PCR扩增反应：95℃变性5min；40cycles，95℃ 15sec，60℃30sec，采集荧光；

步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，得到用于芬太尼类药物个体化用药相关基因的基因型。

相较于现有技术，本发明提供的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的特点，实现对用于芬太尼类药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床芬太尼类药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。

附图说明

图1为临床样本CYP3A4*1G野生型的PCR扩增曲线图；

图2为临床样本CYP3A4*1G杂合型的PCR扩增曲线图；

图3为临床样本CYP3A4*1G突变型的PCR扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

针对人基因组中CYP3A4*1G基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Primer Premier 3.0及Methyl Primer Express v1.0软件，分别设计特异性引物及MGB标记的探针。

特异性引物及探针序列，如下表所示：

二、对照品选择

阳性对照品一为CYP3A4*1G基因位点野生型质粒；

阳性对照品二为CYP3A4*1G基因位点野生型与突变型按1：1 数量比杂合的质粒；

阳性对照品三为CYP3A4*1G基因位点突变型质粒；

空白对照品为无核酸酶水。

三、PCR反应液组成

包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液为CYP3A4*1G PCR反应液，其包括：

CYP3A4*1G正向引物、CYP3A4*1G反向引物、CYP3A4*1G突变型探针及CYP3A4*1G野生型探针；

上述PCR反应液还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶及无核酸酶水；

其中，所述10×PCR buffer、dNTP、HS Taq酶及无核酸酶水均购自大连宝生物(宝生物(大连)工程有限公司)；所述无核酸酶水为 (Nuclease-Free Water)用DEPC(Diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水；HS Taq酶(TaKaRa TaqHot Start Version)是针对普通Taq DNA聚合酶灵敏度高，易产生非特异性条带的情况，专门研制的高特异性嗜热DNA聚合酶产品。

所述PCR反应液成分的终浓度为：

1×PCR buffer

0.2μM的各特异性引物及探针

1U的HS Taq酶

0.25mM(mmol/L)的dNTP

无核酸酶水适量(将体系补充至18.5ul)。

实施例2：利用上述试剂盒进行用于芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法

一、生物样本

本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。为2017年3-9 月期间在湘雅医学检验所检测的500例剩余人群抗凝血。

二、取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板：

DNA提取试剂盒为自主研发的提取试剂盒《核酸提取或纯化试剂》进行提取(备案号：湘长械备20150166)。

1)取无菌的1.5mL EP管，加入250uL全血。

2)加750ul细胞裂解液，颠倒混匀5-6次，室温静置10min。

3)12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀。

4)依次加入20uL蛋白酶K、250uL裂解液ABL，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次。

5)取出，加入250uL无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s。

6)将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中；10,000rpm离心1min。

7)弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500uL洗液I，10,000rpm，1min离心。

8)弃收集管中废液，加入700uL洗液II，10,000rpm，1min，离心。弃废液。(洗液II使用前需加入无水乙醇至80％)

9)重复步骤8一次。

10)弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm， 2min。

11)将吸附柱插入到新的EP管中；加入30-100uL DNA溶解液 (65℃预热可提高DNA获得率)，室温静置5min。

12)10,000rpm，1min，离心；弃吸附柱，EP管内液体即为DNA 溶液。2-8℃保存，若需长期保存请置于-20℃或更低温度。

三、提供所述试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀：

从试剂盒中取出所需数量PCR反应液8连管(每检测位点的 PCR管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。

PCR反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖。

从待检样本DNA(或对照品)中取1.5μL加至PCR反应液中。

振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。

四、进行PCR扩增反应：95℃变性5min；40cycles，95℃ 15sec， 60℃ 30sec，采集荧光。

使用的PCR仪器为ABI 7500或杭州博日FQD-96A荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测系统，反应体系为20ul；

PCR反应条件如下表所示：

五、PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，得到用于芬太尼类药物个体化用药相关基因的基因型。

结果有效性判定，如下表所示：

空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)。

PCR结果判定，如下表所示：

六、本发明的试剂盒检测结果在指导芬太尼类药物用药中的应用

根据荧光定量PCR中的结果判定得出CYP3A4*1G位点的基因型。基因型与芬太尼类药物个体化用药关系对应表如下所示：

基因型与芬太尼类药物关系对应：

基于本发明的临床样本各基因位点检测结果，参见图1-图3，其中图1为临床样本CYP3A4*1G野生型的PCR扩增曲线图；图2为临床样本CYP3A4*1G杂合型的PCR扩增曲线图；图3为临床样本 CYP3A4*1G突变型的PCR扩增曲线图。

本发明提供的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的特点，实现对用于芬太尼类药物个体化用药相关基因多态性的快速及准确测定，以降低临床芬太尼类药物常见用药的不良反应，降低医疗成本，节约社会资源。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 韩林志

<120> 用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法

<130> 2017

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggaggcatt tttgctaagg tttc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggaggaaa ttgatgcagt ttt 23

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgtatcat ccactcac 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtaccatc cactcac 17

Claims (6)

1.一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对，其特征在于，包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针，如下：

CYP3A4*1G正向引物：

5'-AGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTC-3'；

CYP3A4*1G反向引物：

5'-CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT-3'；

CYP3A4*1G突变型探针：

5'FAM-CATGTATCATCCACTCAC-MGB 3'；

CYP3A4*1G野生型探针：

5'VIC-ATGTACCATCCACTCAC-MGB 3'。

2.一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液为CYP3A4*1G PCR反应液，其包括：

CYP3A4*1G正向引物、CYP3A4*1G反向引物、CYP3A4*1G突变型探针及CYP3A4*1G野生型探针；

上述PCR反应液还包括PCR buffer，dNTP、HS Taq酶及无核酸酶水。

3.根据权利要求2所述的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCR buffer，0.2μM的各特异性引物及探针、0.25mM的dNTP、1U的HS Taq酶。

4.根据权利要求2-3中任一所述的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；

所述阳性对照品一为CYP3A4*1G基因位点野生型质粒；

所述阳性对照品二为CYP3A4*1G基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；

所述阳性对照品三为CYP3A4*1G基因位点突变型质粒。

5.根据权利要求4所述的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。

6.一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；

步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；

步骤三：进行PCR扩增反应：95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec；

步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，得到用于芬太尼类药物个体化用药相关基因的基因型。