CN110157798B - 一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒 - Google Patents
一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒,属于分子生物学和医学技术领域,包括检测基因位点多态性的引物、检测基因位点多态性的野生型探针和检测基因位点多态性的突变性探针。采用本发明提供的一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,能够检测用药基因位点的多态性,对基因位点进行基因分型,进而指导糖尿病个体用药。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和医学技术领域,尤其涉及一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病,高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损,或两者兼有引起。糖尿病患者由于长期处于高血糖状态下,因此会导致各种组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。随着人们生活水平的提高,越来越多的现代病显现出来,其中以糖尿病为首,目前已经成为了一种大众常见的疾病。引起糖尿病的因素有很多种,简单总结一下大概分为以下几种:遗传因素、肥胖因素、活动不足、饮食结构、精神神经因素、病毒感染等。其中遗传因素为最主要的一种。
通过药物治疗控制血糖是目前和今后相当长时间内减少糖尿病并发症发生的主要手段。然而,治疗糖尿病的药物在临床上出现的个体反应差异十分普遍(包括毒性和治疗效应存在很大的差异),其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶、药物转运体蛋白基因和药物作用靶点(如受体)发生了遗传变异。因此,药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象,药物反应的个体差异呼唤着药物治疗的个体化。如(1)CYP2C9*3基因多态性因单一氨基酸的替换而降低酶代谢底物活性,从而降低CYP2C9对磺脲类降糖药的代谢作用,引起磺脲类降糖药的血药浓度升高,降糖作用增加,同时也增加了患者发生低血糖的危险性。(2)SLCO1B1(rs4149056)的基因多态性,可影响药物进入肝细胞的速率,阻碍药物代谢。该突变纯合子个体体内瑞格列奈血浆AUC较521T/C杂合子和521T/T野生型纯合子分别高出107%和188%。(3)ABCC8(4108T>G)影响A型药物格列齐特的受体敏感性,从而增强降血糖疗效,增加低血糖风险。
“糖尿病个体化药物治疗基因检测”是通过提取人体血液中的DNA,检测口服降糖药相关代谢酶、转运体、药物作用靶点基因多态性,以此分析病人对药物的敏感性。糖尿病药物基因的检测可以让医生了解患者对不同降糖药物的疗效反应,以及可能发生的不良反应事件,从而使医生能够做到结合患者的个体情况,因人而异、量体裁衣的个性化治疗。但是现有技术中并未有关于指导糖尿病个体化用药基因多态性的引物探针的报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒,采用本发明提供的引物探针组合能够判断出个体中用药基因位点的多态性,根据基因位点的分型,指导糖尿病个体化用药。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,包括检测基因位点多态性的引物、检测基因位点多态性的野生型探针和检测基因位点多态性的突变性探针;
检测CYP2C9*3多态性的引物具有SEQ ID No.1~2所示的序列,检测CYP2C9*3多态性的野生型探针具有SEQ IDNo.25所示的序列,检测CYP2C9*3多态性的突变型探针具有SEQID No.26所示的序列;
检测CYP2C8*3多态性的引物具有SEQ ID No.3~4所示的序列,检测CYP2C8*3多态性的野生型探针具有SEQ IDNo.27所示的序列,检测CYP2C8*3多态性的突变型探针具有SEQID No.28所示的序列;
检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.5~6所示的序列,检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.29所示的序列,检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.30所示的序列;
检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.7~8所示的序列,检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.31所示的序列,检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.32所示的序列;
检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.9~10所示的序列,检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.33所示的序列,检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.34所示的序列;
检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物具有SEQ ID No.11~12所示的序列,检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.35所示的序列,检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.36所示的序列;
检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物具有SEQ ID No.13~14所示的序列,检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.37所示的序列,检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.38所示的序列;
检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物具有SEQ ID No.15~16所示的序列,检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针具有SEQ ID No.39所示的序列,检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针具有SEQ ID No.40所示的序列;
检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物具有SEQ ID No.17~18所示的序列,检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.41所示的序列,检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.42所示的序列;
检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物具有SEQ ID No.19~20所示的序列,检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.43所示的序列,检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.44所示的序列;
检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物具有SEQ ID No.21~22所示的序列,检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针具有SEQ ID No.45所示的序列,检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针具有SEQ ID No.46所示的序列;
检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物具有SEQ ID No.23~24所示的序列,检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针具有SEQ ID No.47所示的序列,检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针具有SEQ ID No.48所示的序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备指导糖尿病个体化用药的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒,包括:CYP2C9*3反应液、CYP2C8*3反应液、KCNJ11反应液、PPARG反应液、ABCC8反应液、SLCO1B1388反应液、SLCO1B1521反应液、KCNQ1反应液、SLC22A1反应液、SLC22A2反应液、SLC47A1反应液和SLC47A2反应液;
所述CYP2C9*3反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的引物、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的突变型探针;
CYP2C8*3反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的引物、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的突变型探针;
KCNJ11反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针;
PPARG反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针;
ABCC8反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针;
SLCO1B1388反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针;
SLCO1B1521反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针;
KCNQ1反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针;
SLC22A1反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针;
SLC22A2反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针;
SLC47A1反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针;
SLC47A2反应液包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针。
优选的,所述CYP2C9*3反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测CYP2C9*3多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测CYP2C9*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
CYP2C8*3反应液中,10×PCRbuffer的浓度为1×PCRbuffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测CYP2C8*3多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测CYP2C8*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,所述KCNJ11反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
所述PPARG反应液中,10×PCRbuffer的浓度为1×PCRbuffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,所述ABCC8反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
所述SLCO1B1388反应液中,10×PCRbuffer的浓度为1×PCRbuffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,所述SLCO1B1521反应液中,10×PCRbuffer的浓度为1×PCRbuffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
所述KCNQ1反应液中,10×PCRbuffer的浓度为1×PCRbuffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,所述SLC22A1反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
所述SLC22A2反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,所述SLC47A1反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM;
所述SLC47A2反应液中,10×PCR buffer的浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3uM。
优选的,还包括三种TNB阳性对照,分别为上述12个基因位点105拷贝/ml野生型质粒等比混合物,上述12个基因位点105拷贝/ml野生型和突变型质粒等比混合物,上述12个基因位点105拷贝/ml突变型质粒等比混合物。本发明提供了一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,包括检测基因位点多态性的引物、检测基因位点多态性的野生型探针和检测基因位点多态性的突变性探针。采用本发明提供的引物探针组合能够判断出个体中用药基因位点的多态性,根据基因位点的分型,指导糖尿病个体化用药。
本发明的有益效果:
采用本发明提供的一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,能够检测CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11基因的67A/G位点、PPARG基因的34C/G位点、ABCC8基因的第4108T/G位点、SLCO1B1基因的388G/A位点、SLCO1B1基因的521T/C位点、KCNQ1基因的rs2237892、SLC22A1基因的1022C/T位点、SLC22A2基因的808G/T位点、SLC47A1基因的rs2289669和SLC47A2基因的rs12943590的多态性,对上述基因位点进行基因分型,进而指导糖尿病个体用药。
附图说明
图1为CYP2C9*3的基因分型结果,从左至右依次为CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3和CYP2C9*3/*3;
图2为CYP2C8*3的基因分型结果,从左至右依次为CYP2C8*1/*1、CYP2C8*1/*3和CYP2C8*3/*3;
图3为KCNJ11分型结果,从左至右依次为KCNJ11(67G/G)、KCNJ11(67A/G)和KCNJ11(67A/A);
图4为PPARG分型结果,从左至右依次为PPARG(34C/C)、PPARG(34C/G)和PPARG(34G/G);
图5为ABCC8分型结果,从左至右依次为ABCC8(4108T/T)、ABCC8(4108T/G)和ABCC8(4108G/G);
图6为SLCO1B1分型结果,从左至右依次为SLCO1B1(388G/G)、SLCO1B1(388G/A)和SLCO1B1(388A/A);
图7为SLCO1B1分型结果,从左至右依次为SLCO1B1(521T/T)、SLCO1B1(521T/C)和SLCO1B1(521C/C);
图8为KCNQ1(rs2237892)分型结果,从左至右依次为KCNQ1(rs2237892)(C/C)、KCNQ1(rs2237892)(C/T)和KCNQ1(rs2237892)(C/T);
图9为SLC22A1分型结果,从左至右依次为SLC22A1(1022C/C)、SLC22A1(1022C/T)和SLC22A1(1022T/T);
图10为SLC22A2分型结果,从左至右依次为SLC22A2(808G/G)、SLC22A2(808G/T)和SLC22A2(808T/T);
图11为SLC47A1rs2289669分型结果,从左至右依次为SLC47A1rs2289669(G/G)、SLC47A1rs2289669(G/A)和SLC47A1rs2289669(A/A);
图12为SLC47A2rs12943590分型结果,从左至右依次为SLC47A2rs12943590(C/C)、SLC47A2rs12943590(C/T)和SLC47A2rs12943590(C/T)。
具体实施方式
本发明提供了一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,包括检测基因位点多态性的引物、检测基因位点多态性的野生型探针和检测基因位点多态性的突变性探针。
在本发明中,所述检测基因位点多态性的引物、检测基因位点多态性的野生型探针和检测基因位点多态性的突变性探针是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列,使用Primer Premier3.0设计。在本发明中,所述检测基因位点多态性的野生型探针5`端添加FAM标记,检测基因位点多态性的突变性探针5`端添加VIC标记,3`端均添加MGB标记。
在本发明中,检测CYP2C9*3多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物的序列如SEQ ID No.1所示,具体为:
CCCTGCATGCAAGACAGGA;
所述反向引物的序列如SEQ ID No.2所示,具体为:
GCAGGCTGGTGGGGAGAA;
所述检测CYP2C9*3多态性的野生型探针具有SEQ ID No.25所示的序列,具体为:
TCCAGAGATACATTGAC;
所述检测CYP2C9*3多态性的突变型探针具有SEQ ID No.26所示的序列,具体为:
TCCAGAGATACCTTGAC。
在本发明中,所述检测CYP2C9*3多态性的引物、野生型探针和突变性探针对CYP2C9*3进行分型,分型结果为CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3和CYP2C9*3/*3。在本发明中,所述CYP2C9*1/*1为野生型,所述CYP2C9*1/*3为杂合突变型,所述CYP2C9*3/*3为突变型。在本发明中,所述CYP2C9*1/*3和CYP2C9*3/*3的突变者的血药浓度高,疗效较好,突变患者低血糖风险也升高。
在本发明中,检测CYP2C8*3多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.3所示的序列,具体为:
CTAGAAAGTGGCCAGGGTCAAAG;
所述反向引物具有SEQ ID No.4所示的序列,具体为:
CATAATGGCATTACTGACTTCCGT;
检测CYP2C8*3多态性的野生型探针具有SEQ ID No.27所示的序列,具体为:
AAATTCTTTGTCATCATGT;
检测CYP2C8*3多态性的突变型探针具有SEQ ID No.28所示的序列,具体为:
AGGAAATTCTCTGTCATCAT。
在本发明中,所述检测CYP2C8*3多态性的引物、野生型探针和突变性探针对CYP2C8*3进行分型,分型结果为CYP2C8*1/*1、CYP2C8*1/*3和CYP2C8*3/*3。在本发明中,所述CYP2C8*1/*1为野生型,CYP2C8*1/*3为杂合突变,CYP2C8*3/*3为突变型。在本发明中,所述CYP2C8*1/*3和CYP2C8*3/*3的突变者的药物血浓度高,疗效较高;突变患者低血糖风险也升高。
在本发明中,检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.5所示的序列,具体为:
CTGACACGCCTGGCAGAG;
反向引物具有SEQ ID No.6所示的序列,具体为:
GCAGTTGCCTTTCTTGGACAC;
检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.29所示的序列,具体为:
CTGCCGAGCCCAGGT;
检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.30所示的序列,具体为:
CTGCCAAGCCCAGGTA。
在本发明中,所述检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物、野生型探针和突变性探针对KCNJ11基因的67A/G位点进行分型,结果为KCNJ11(67G/G)、KCNJ11(67A/G)和KCNJ11(67A/A)。在本发明中,KCNJ11(67G/G)为纯合野生,KCNJ11(67A/G)为杂合突变,KCNJ11(67A/A)为纯合突变。在本发明中,KCNJ11基因的67A/G位点为KCNJ11(67A/G)。在本发明中,所述KCNJ11(67A/G)和KCNJ11(67A/A)的突变者对磺脲类药物敏感。
在本发明中,检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.7所示的序列,具体为:
GTTATGGGTGAAACTCTGGGAGAT;
所述反向引物具有SEQ ID No.8所示的序列,具体为:
GCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATC;
检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.31所示的序列,具体为:
CTCCTATTGACCCAGAAA;
检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.32所示的序列,具体为:
CTCCTATTGACGCAGAA。
在本发明中,所述检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物、野生型探针和突变性探针对PPARG基因的34C/G位点进行分型,结果为PPARG(34C/C)、PPARG(34C/G)和PPARG(34G/G)。在本发明中,所述PPARG(34C/C)为纯合野生,PPARG(34C/G)为杂合突变,PPARG(34G/G)为纯合突变。在本发明中,所述PPARG基因的34C/G位点为PPARG(34C>G)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变患者受体敏感性增加,降糖效果增加,突变患者水肿风险升高。
在本发明中,检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.9所示的序列,具体为:
AAGCCGGTGCTGAAGCAC;
所述反向引物SEQ ID No.10所示的序列,具体为:
CGCCTGTCCTGCAGCATT;
所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.33所示的序列,具体为:
TCAATGCCCTCATCTCCCCTGG;
所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.34所示的序列,具体为:
TCAATGCCCTCATCGCCCCT。
在本发明中,所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物、野生型探针和突变性探针对ABCC8基因的第4108T/G位点进行分型,分型结果为ABCC8(4108T/T)、ABCC8(4108T/G)和ABCC8(4108G/G)。在本发明中,所述ABCC8(4108T/T)为纯合野生,ABCC8(4108T/G)为杂合突变,ABCC8(4108G/G)为纯合突变。在本发明中,所述ABCC8基因的第4108T/G位点为ABCC8(4108T>G)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者对磺脲类药物敏感。
在本发明中,检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.11所示的序列,具体为:
CAGTGATGTTCTTACAGTTACAGGTATTCT;
所述反向序列具有SEQ ID No.12所示的序列,具体为:
CCCACTATCTCAGGTGATGCTCT;
所述检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.35所示的序列,具体为:
CTAATATCGATTCATCAGAA;
所述检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.36所示的序列,具体为:
CTAATATCAATTCATCAGAAAA。
在本发明中,检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物、野生型探针和突变性探针对SLCO1B1基因的388G/A位点进行分型,分型结果为SLCO1B1(388G/G)、SLCO1B1(388G/A)和SLCO1B1(388A/A)。在本发明中,所述SLCO1B1(388G/G)为纯合野生,SLCO1B1(388G/A)为杂合突变,SLCO1B1(388A/A)为纯合突变。在本发明中,所述SLCO1B1基因的388G/A位点为SLCO1B1(388G>A)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变患者的药物转运能力降低、药物清除减慢,降糖效应增强。
在本发明中,检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.13所示的序列,具体为:
CCAATGGTACTATGGGAGTCTCC;
所述反向引物具有SEQ ID No.14所示的序列,具体为:
TGTTTAAAGGAATCTGGGTCATACAT;
所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.37所示的序列,具体为:
CATGAACACATATATCCA;
所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.38所示的序列,具体为:
CATGAACGCATATATCCA。
在本发明中,所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物、野生型探针和突变型探针对SLCO1B1基因的521T/C位点进行分型,分型结果为SLCO1B1(521T/T)、SLCO1B1(521T/C)和SLCO1B1(521C/C)。在本发明中,所述SLCO1B1(521T/T)为纯合野生,SLCO1B1(521T/C)为杂合突变,SLCO1B1(521C/C)为纯合突变。在本发明中,所述SLCO1B1基因的521T/C位点为SLCO1B1(521T>C)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者的药物转运能力降低,药物消除减慢,降糖效应增强。
在本发明中,检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.15所示的序列,具体为:
ATGAGCCAGATGATGGGAGC;
所述反向引物具有SEQ ID No.16所示的序列,具体为:
TGTAAGGCATCTGGTGGAGAG;
所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针具有SEQ ID No.39所示的序列,具体为:
CTTTGCCACCCGGG;
所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针具有SEQ ID No.40所示的序列,具体为:
CTTTGCCACCTGGGG。
在本发明中,所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物、野生型探针和突变型探针对KCNQ1基因的rs2237892进行分型,分型结果为KCNQ1rs2237892(C/C)、KCNQ1rs2237892(C/T)和KCNQ1rs2237892(C/T)。在本发明中,所述KCNQ1rs2237892(C/C)为纯合野生,KCNQ1rs2237892(C/T)为杂合突变,KCNQ1rs2237892(C/T)为纯合突变。在本发明中,检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的检测意义为:与亚洲人群常见易感基因,与胰岛素抵抗指数相关,突变型治疗达标率具有明显差异。
在本发明中,检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ ID No.17所示的序列,具体为:
GCTGCGTGGAGCCAGC;
所述反向引物具有SEQ ID No.18所示的序列,具体为:
CGCCTGGTAATAACAGAACAACCT;
所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.41所示的序列,具体为:
CCCACCGCTTGTACT;
所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.42所示的序列,具体为:
TCCCACCACTTGTACT。
在本发明中,所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物、野生型探针和突变型探针对SLC22A1基因的1022C/T位点进行分型,分型结果为:SLC22A1(1022C/C)、SLC22A1(1022C/T)和SLC22A1(1022T/T)。在本发明中,所述SLC22A1(1022C/C)为纯合野生,SLC22A1(1022C/T)为杂合突变,SLC22A1(1022T/T)为纯合突变。在本发明中,所述SLC22A1基因的1022C/T位点为SLC22A1(1022C>T)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者的药物转运入肝功能降低,降糖效应减弱。
在本发明中,检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ IDNo.19所示的序列,具体为:
TGGCTTACGCACTTCCTCACT;
所述反向引物具有SEQ ID No.20所示的序列,具体为:
CAAATGGACTTACCAGTAATAGAGCAA;
所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.43所示的序列,具体为:
CAGTTCACAGTTGCT;
所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.44所示的序列,具体为:
AGTTCACAGTTTCTC。
在本发明中,所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物、野生型探针和突变型探针对SLC22A2基因的808G/T位点进行分型,分型结果为SLC22A2(808G/G)、SLC22A2(808G/T)和SLC22A2(808T/T)。在本发明中,所述SLC22A2(808G/G)为纯合野生,SLC22A2(808G/T)为杂合突变,SLC22A2(808T/T)为纯合突变。在本发明中,所述SLC22A2基因的808G/T位点为SLC22A2(808G>T)。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者的药物转运入肾功能降低,药物经肾清除减慢,降糖效应增强。
在本发明中,检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ IDNo.21所示的序列,具体为:
ACTGATTTGCAACATCCCCTTT;
所述反向引物具有SEQ ID No.22所示的序列,具体为:
CAAAGCCCAGTTTGTGCTAAGC;
所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针具有SEQ ID No.45所示的序列,具体为:
AACTTCCACGCTACTG;
所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针具有SEQ ID No.46所示的序列,具体为:
AACTCCCACGCTACT。
在本发明中,所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物、野生型探针和突变型探针对SLC47A1基因的rs2289669位点进行分型,分型结果为SLC47A1rs2289669(G/G)、SLC47A1rs2289669(G/A)和SLC47A1rs2289669(A/A)。在本发明中,所述SLC47A1rs2289669(G/G)为纯合野生,SLC47A1rs2289669(G/A)为杂合突变,SLC47A1rs2289669(A/A)为纯合突变。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者的药物转运入肝功能降低,降糖效果减弱。
在本发明中,检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物具有SEQ IDNo.23所示的序列,具体为:
CTCATCCCACAAGTTGCCAT;
所述反向引物具有SEQ ID No.24所示的序列,具体为:
CTCATCCCACAAGTTGCCATG;
所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针具有SEQ ID No.47所示的序列,具体为:
AGCCCCTCCTCCTGC;
所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针具有SEQ ID No.48所示的序列,具体为:
AGCTCCTCCTCCTGC。
在本发明中,所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物、野生型探针和突变型探针对SLC47A2基因的rs12943590进行分型,分型结果为SLC47A2rs12943590(C/C)、SLC47A2rs12943590(C/T)和SLC47A2rs12943590(C/T)。在本发明中,所述SLC47A2rs12943590(C/C)为纯合野生,SLC47A2rs12943590(C/T)为杂合突变,SLC47A2rs12943590(C/T)为纯合突变。在本发明中,所述杂合突变和纯合突变的突变者药物转运入肾功能降低,药物经肾清除减慢,降糖效应增强。
本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备指导糖尿病个体化用药的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒,包括:CYP2C9*3反应液、CYP2C8*3反应液、KCNJ11反应液、PPARG反应液、ABCC8反应液、SLCO1B1388反应液、SLCO1B1521反应液、KCNQ1反应液、SLC22A1反应液、SLC22A2反应液、SLC47A1反应液和SLC47A2反应液。
在本发明中,所述CYP2C9*3反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的引物、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测CYP2C9*3多态性的突变型探针。在本发明中,所述CYP2C9*3反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测CYP2C9*3多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测CYP2C9*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述CYP2C8*3反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的引物、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测CYP2C8*3多态性的突变型探针。在本发明中,所述CYP2C8*3反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测CYP2C8*3多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测CYP2C8*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述KCNJ11反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述KCNJ11反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述PPARG反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述PPARG反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述ABCC8反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述所述ABCC8反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLCO1B1388反应液优选包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLCO1B1388反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLCO1B1521反应液优选包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLCO1B1521反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,KCNQ1反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针。在本发明中,所述KCNQ1反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLC22A1反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLC22A1反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLC22A2反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLC22A2反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCR buffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLC47A1反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLC47A1反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
在本发明中,所述SLC47A2反应液优选包括无核酸酶水、10×PCRbuffer、dNTP、HS-Taq酶、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针、上述技术方案所述的检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针。在本发明中,所述SLC47A2反应液中,10×PCRbuffer的浓度优选为1×PCRbuffer、dNTP的浓度优选为0.2~0.3mM、HS-Taq酶优选1U、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物的浓度分别优选为0.1~0.3uM、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别优选为0.1~0.3uM。
本发明对上述试剂的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。本发明对上述反应液在试剂盒中的放置的量没有特殊限定,采用常规试剂盒放置试剂的量即可。
在本发明中,所述试剂盒的使用方法优选包括:提取样本DNA,将所述样本DNA与上述技术方案所述的反应液混合后进行实时荧光PCR扩增,根据荧光扩增曲线进行结果判读。
在本发明中,所述样本优选为人全血。本发明对所述提取样本DNA的方法没有特殊限定,采用常规即可。
在本发明中,所述实时荧光PCR扩增的体系为:反应液18.5ul,样本DNA1.5ul。在本发明中,所述实时荧光PCR扩增的程序为95℃5min;95℃15s,60℃30s(采集荧光),40个循环。
在本发明中,所述结果判读见表1。
表1结果判读
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种用于CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、ABCC8(4108T/G)、SLCO1B1(521T/C、388G/A)、KCNQ1(rs2237892)、SLC22A1(1022C/T)、SLC22A2(808G/T)、SLC47A1rs2289669、SLC47A2rs12943590基因多态性检测的特异性引物设计。
本发明的CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、ABCC8(4108T/G)、SLCO1B1(521T/C、388G/A)、KCNQ1(rs2237892)、SLC22A1(1022C/T)、SLC22A2(808G/T)、SLC47A1rs2289669、SLC47A2rs12943590基因多态性的PCR引物探针(见表2),是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列,使用PrimerPremier3.0设计,引物和MGB探针由上海INVITROGEN有限公司合成。
表2引物探针序列
实施例2
一种用于CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、ABCC8(4108T/G)、SLCO1B1(521T/C、388G/A)、KCNQ1(rs2237892)、SLC22A1(1022C/T)、SLC22A2(808G/T)、SLC47A1rs2289669、SLC47A2rs12943590基因突变检测的试剂盒,包括CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、ABCC8(4108T/G)、SLCO1B1(521T/C、388G/A)、KCNQ1(rs2237892)、SLC22A1(1022C/T)、SLC22A2(808G/T)、SLC47A1rs2289669和SLC47A2rs1294359012种PCR反应液。
CYP2C9PCR反应液包含序列SEQ ID No.1、2、25和26;
CYP2C8*3PCR反应液包含序列SEQ ID No.3、4、27和28;
KCNJ11(67A/G)PCR反应液包含序列SEQ ID No.5、6、29和30;
PPARG(34C/G)PCR反应液包含序列SEQ ID No.7、8、31和32;
ABCC8(4108T/G)PCR反应液包含序列SEQ ID No.9、10、33和34;
SLCO1B1(521T/C)PCR反应液包含序列SEQ ID No.11、12、35和36;
SLCO1B1(388G/A)PCR反应液包含序列SEQ ID No.13、14、37和38;
KCNQ1(rs2237892)PCR反应液包含序列SEQ ID No.15、16、39和40;
SLC22A1(1022C/T)PCR反应液包含序列SEQ ID No.17、18、41和42;
SLC22A2(808G/T)PCR反应液包含序列SEQ ID No.19、20、43和44;
SLC47A1rs2289669PCR反应液包含序列SEQ ID No.21、22、45和46;
SLC47A2rs12943590PCR反应液包含序列SEQ ID No.23、24、47和48。
试剂盒反应液中引物、探针浓度分别为0.2uM。
试剂盒中反应液还含有:PCR Buffer(1×)、dNTPS(0.25mM)、HS-Taq酶(1U)、无核酸酶水(将体系补充至18.5μL)。
试剂盒中还含有:三种阳性对照(TNB阳性对照1、TNB阳性对照2、TNB阳性对照3)和空白对照,阳性对照1分别为上述12个基因位点的105拷贝/ml野生型质粒等比混合物,阳性对照2为上述12个基因位点105拷贝/ml杂合型质粒混合物,阳性对照3为上述12个基因位点105拷贝/ml突变型质粒等比混合物。
实施例3
实施例2提供的试剂盒检测人全血
本发明采用的无核酸酶水为自产(常规自产方法)、10×PCRbuffer、dNTP购自大连宝生物;DNA提取试剂盒为自主研发的提取试剂盒《DNA提取或纯化试剂盒》进行提取(百伯基因)。本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。
方法:
一、生物样本:
为2016年6-12月期间在湘雅医学检验所检测的500例剩余人群抗凝血。
二、DNA提取:
取无菌的1.5mLEP管,加入250μL全血。
加750μL细胞裂解液,颠倒混匀5-6次,室温静置10min。
12000rpm离心1.5min;倒掉上部废液,收集管底沉淀。
依次加入20μL蛋白酶K、250μL裂解液ABL,涡旋振荡10s,65℃水浴15min,期间振荡混匀2-3次。
取出,加入250μL无水乙醇,涡旋振荡10s,短暂离心5s。
将吸附柱插入收集管中,将上一步所得混合液转移至吸附柱中。10,000rpm离心1min。
弃收集管中废液,将吸附柱重新放入收集管;加入500μL洗液I,10,000rpm,1min离心。
弃收集管中废液,加入700μL洗液II,10,000rpm,1min,离心。弃废液。(洗液II使用前需加入无水乙醇至80%)
重复步骤8一次。
弃流出液,将吸附柱插回收集管,空转离心,13,000rpm,2min。
将吸附柱插入到新的EP管中。加入30-100μLDNA溶解液(65℃预热可提高DNA获得率),室温静置5min。
10,000rpm,1min,离心。弃吸附柱,EP管内液体即为DNA溶液。2-8℃保存,若需长期保存请置于-20℃或更低温度。
三、加样:
从试剂盒中取出所需数量PCR反应液(每检测位点的PCR管数=样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。PCR反应液室温融解后,瞬时离心,揭开管盖。从待检样本DNA(或对照品)中取1.5uL加至PCR反应液中。振荡混匀后,瞬时离心10s,将其移至扩增区。
四、PCR流程
1、使用的PCR仪器为ABI 7500或杭州博日FQD-96A荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测系统,反应体系为20μL;
2、PCR反应条件如下表3所示:
表3PCR反应程序
五、结果判定
空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)
表4结果判读
实施例4
实施例2提供的试剂盒检测结果指导糖尿病用药
根据荧光定量PCR中的结果判定(表4)得出CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、ABCC8(4108T/G)、SLCO1B1(521T/C、388G/A)、KCNQ1(rs2237892)、SLC22A1(1022C/T)、SLC22A2(808G/T)、SLC47A1rs2289669、SLC47A2rs1294359012个位点的基因型。基因型与糖尿病用药关系对应表见表5。此表格仅供参考,实际药物选择请结合临床。
表5基因型与糖尿病用药关系对应
注:药物在体内的过程非常复杂,影响药物疗效和毒副反应的因素很多,医生必须根据患者的病理生理特征、合并用药、临床表现、本检测结果,结合自己的专业判断确定用药方案。不能将本检测结果作为用药的唯一依据
由以上实施例可以得出,采用本发明提供的一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合,能够检测CYP2C9*3、CYP2C8*3、KCNJ11基因的67A/G位点、PPARG基因的34C/G位点、ABCC8基因的第4108T/G位点4108T/G位点、SLCO1B1基因的388G/A位点、SLCO1B1基因的521T/C位点、KCNQ1基因的rs2237892、SLC22A1基因的1022C/T位点、SLC22A2基因的808G/T位点、SLC47A1基因的rs2289669和SLC47A2基因的rs12943590的多态性,对上述基因位点进行基因分型,进而指导糖尿病个体用药。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 一种指导糖尿病个体化用药基因位点多态性的引物探针组合及其应用和试剂盒
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctgcatgc aagacagga 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaggctggt ggggagaa 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctagaaagtg gccagggtca aag 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cataatggca ttactgactt ccgt 24
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgacacgcc tggcagag 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagttgcct ttcttggaca c 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttatgggtg aaactctggg agat 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagacagtg tatcagtgaa ggaatc 26
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagccggtgc tgaagcac 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcctgtcct gcagcatt 18
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagtgatgtt cttacagtta caggtattct 30
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccactatct caggtgatgc tct 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaatggtac tatgggagtc tcc 23
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtttaaagg aatctgggtc atacat 26
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgagccaga tgatgggagc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtaaggcat ctggtggaga g 21
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctgcgtgga gccagc 16
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcctggtaa taacagaaca acct 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tggcttacgc acttcctcac t 21
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caaatggact taccagtaat agagcaa 27
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actgatttgc aacatcccct tt 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caaagcccag tttgtgctaa gc 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctcatcccac aagttgccat 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctcatcccac aagttgccat g 21
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tccagagata cattgac 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tccagagata ccttgac 17
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaattctttg tcatcatgt 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aggaaattct ctgtcatcat 20
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctgccgagcc caggt 15
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctgccaagcc caggta 16
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctcctattga cccagaaa 18
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ctcctattga cgcagaa 17
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcaatgccct catctcccct gg 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcaatgccct catcgcccct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctaatatcga ttcatcagaa 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctaatatcaa ttcatcagaa aa 22
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
catgaacaca tatatcca 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
catgaacgca tatatcca 18
<210> 39
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ctttgccacc cggg 14
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctttgccacc tgggg 15
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cccaccgctt gtact 15
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcccaccact tgtact 16
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cagttcacag ttgct 15
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agttcacagt ttctc 15
<210> 45
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aacttccacg ctactg 16
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aactcccacg ctact 15
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
agcccctcct cctgc 15
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
agctcctcct cctgc 15
Claims (2)
1.一种指导糖尿病个体化用药的试剂盒,其特征在于,包括:CYP2C9*3反应液、CYP2C8*3反应液、KCNJ11反应液、PPARG反应液、ABCC8反应液、SLCO1B1 388反应液、SLCO1B1 521反应液、KCNQ1反应液、SLC22A1反应液、SLC22A2反应液、SLC47A1反应液和SLC47A2反应液;
CYP2C9*3反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测CYP2C9*3多态性的引物、检测CYP2C9*3多态性的野生型探针、检测CYP2C9*3多态性的突变型探针;
CYP2C8*3反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测CYP2C8*3多态性的引物、检测CYP2C8*3多态性的野生型探针、检测CYP2C8*3多态性的突变型探针;
KCNJ11反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针;
PPARG反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针;
ABCC8反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针;
SLCO1B1 388反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针;
SLCO1B1 521反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针;
KCNQ1反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针;
SLC22A1反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针;
SLC22A2反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针;
SLC47A1反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针;
SLC47A2反应液包括无核酸酶水、10×PCR buffer、dNTP、HS-Taq酶、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针;
所述检测CYP2C9*3多态性的引物具有SEQ ID No .1~2所示的序列,所述检测CYP2C9*3多态性的野生型探针具有SEQ ID No.25所示的序列,所述检测CYP2C9*3多态性的突变型探针具有SEQ IDNo.26所示的序列;
所述检测CYP2C8*3多态性的引物具有SEQ ID No.3~4所示的序列,所述检测CYP2C8*3多态性的野生型探针具有SEQ ID No.27所示的序列,所述检测CYP2C8*3多态性的突变型探针具有SEQ IDNo.28所示的序列;
所述检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.5~6所示的序列,所述检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.29所示的序列,所述检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.30所示的序列;
所述检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.7~8所示的序列,所述检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.31所示的序列,所述检测PPARG基因的34C/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.32所示的序列;
所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物具有SEQ ID No.9~10所示的序列,所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.33所示的序列,所述检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.34所示的序列;
所述检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物具有SEQ ID No.11~12所示的序列,所述检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.35所示的序列,所述检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.36所示的序列;
所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物具有SEQ ID No.13~14所示的序列,所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.37所示的序列,所述检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.38所示的序列;
所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物具有SEQ ID No.15~16所示的序列,所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针具有SEQ ID No.39所示的序列,所述检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的突变型探针具有SEQ ID No.40所示的序列;
所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物具有SEQ ID No.17~18所示的序列,所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.41所示的序列,所述检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.42所示的序列;
所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物具有SEQ ID No.19~20所示的序列,所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针具有SEQ ID No.43所示的序列,所述检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的突变型探针具有SEQ ID No.44所示的序列;
所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物具有SEQ ID No.21~22所示的序列,所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针具有SEQ ID No.45所示的序列,所述检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的突变型探针具有SEQ ID No.46所示的序列;
所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物具有SEQ ID No.23~24所示的序列,所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针具有SEQ ID No.47所示的序列,所述检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的突变型探针具有SEQ ID No.48所示的序列;
所述CYP2C9*3反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测CYP2C9*3多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测CYP2C9*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
CYP2C8*3反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测CYP2C8*3多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测CYP2C8*3多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述KCNJ11反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测KCNJ11基因的67A/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述PPARG反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测PPARG基因的34C/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述ABCC8反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测ABCC8基因的第4108T/G位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLCO1B1 388反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测SLCO1B1基因的388G/A位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLCO1B1 521反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测SLCO1B1基因的521T/C位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述KCNQ1反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测KCNQ1基因的rs2237892多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLC22A1反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3uM、检测SLC22A1基因的1022C/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLC22A2反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测SLC22A2基因的808G/T位点多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLC47A1反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测SLC47A1基因的rs2289669多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM;
所述SLC47A2反应液中,10×PCR buffer的工作浓度为1×PCR buffer、dNTP的浓度为0.2~0.3mM、HS-Taq酶1U、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的引物的浓度分别为0.1~0.3μM、检测SLC47A2基因的rs12943590多态性的野生型探针和突变型探针的浓度分别为0.1~0.3μM。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括三种TNB阳性对照,分别为上述12个基因位点105拷贝野生型质粒等比混合物,上述12个基因位点105拷贝野生型和突变型质粒等比混合物,上述12个基因位点105拷贝突变型质粒等比混合物。
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