CN110157799A - 用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法 - Google Patents

用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法，属于分子生物学和医学技术领域。本发明所述引物探针组包括包括：CYP2C9*3基因检测用引物探针、KCNJ11基因检测用引物探针、PPARG基因检测用引物探针、SLC47A1 rs2289669基因检测用引物探针和SLC47A2 rs12943590基因检测用引物探针。本发明所述引物探针组能够实现基因多态性的快速、准确、灵敏及特异性好的检测，能从基因层面指导糖尿病的个体化用药。

Description

用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针 组、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学技术领域，具体涉及用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病患者由于长期处于高血糖状态下，因此会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。随着人们生活水平的提高，越来越多的现代病显现出来，其中以糖尿病为首，目前已经成为了一种大众常见的疾病。引起糖尿病的因素有很多种，简单总结一下大概分为以下几种：遗传因素、肥胖因素、活动不足、饮食结构、精神神经因素、病毒感染等。其中遗传因素为最主要的一种。
通过药物治疗控制血糖是目前和今后相当长时间内减少糖尿病并发症发生的主要手段。然而，治疗糖尿病的药物在临床上出现的个体反应差异十分普遍(包括毒性和治疗效应存在很大的差异)，其主要原因也是由于与药物相关的药物代谢酶、药物转运体蛋白基因和药物作用靶点(如受体)发生了遗传变异。因此，药物疗效和不良反应的个体差异是目前药物治疗过程中的普遍现象，药物反应的个体差异呼唤着药物治疗的个体化。
发明内容
本发明的目的在于提供用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法。本发明所述引物探针组能够实现基因多态性的快速、准确、灵敏及特异性好的检测，能从基因层面指导糖尿病的个体化用药。
本发明提供了用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组，包括：
CYP2C9*3基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.1所示的CYP2C9*3正向引物、如SEQID NO.2所示的CYP2C9*3反向引物、在SEQ ID NO.11所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3野生型探针和在SEQ ID NO.12所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3突变型探针；
KCNJ11基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.3所示的KCNJ11正向引物、如SEQ IDNO.4所示的KCNJ11反向引物、在SEQ ID NO.13所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的KCNJ11野生型探针和在SEQ ID NO.14所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的KCNJ11突变型探针；
PPARG基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.5所示的PPARG正向引物、如SEQ IDNO.6所示的PPARG反向引物、在SEQ ID NO.15所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的PPARG野生型探针和在SEQ ID NO.16所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的PPARG突变型探针；
SLC47A1 rs2289669基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.7所示的SLC47A1rs2289669正向引物、如SEQ ID NO.8所示的SLC47A1 rs2289669反向引物、在SEQ ID NO.17所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669野生型探针和在SEQ IDNO.18所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669突变型探针；
和SLC47A2 rs12943590基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.9所示的SLC47A2rs12943590正向引物、如SEQ ID NO.10所示的SLC47A2 rs12943590反向引物、在SEQ IDNO.19所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590野生型探针和在SEQ ID NO.20所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590突变型探针。
本发明还提供了基于上述技术方案所述引物探针组的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物探针组。
优选的是，所述试剂盒还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq酶和无核酸酶水。
优选的是，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照包括第一阳性对照、第二阳性对照和第三阳性对照；所述第一阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的野生型基因的质粒等比混合物；
所述第三阳性对照分别为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的突变型基因的质粒等比混合物；
所述第二阳性对照分别为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的突变型基因和野生型基因的质粒等比混合物。
优选的是，所述试剂盒的反应条件为：酶处理95℃变性，5min；40个循环，95℃15s，60℃30s。
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组或上述技术方案所述试剂盒在检测人CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590基因多态性中的应用。
本发明提供了用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法。本发明所述引物探针组能够实现基因多态性的快速、准确、灵敏及特异性好的检测，能从基因层面指导糖尿病的个体化用药。
附图说明
图1为本发明提供的CYP2C9*3(CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3)分型结果图；
图2为本发明提供的KCNJ11(67G/G、67A/G、67A/A)分型结果图；
图3为本发明提供的PPARG(34C/C、34C/G、34G/G)分型结果图；
图4为本发明提供的SLC47A1 rs2289669(G/G、G/A、A/A)分型结果图；
图5为本发明提供的SLC47A2 rs12943590(C/C、C/T、T/T)分型结果图。
具体实施方式
本发明提供了用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组，包括：
CYP2C9*3基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.1所示的CYP2C9*3正向引物、如SEQID NO.2所示的CYP2C9*3反向引物、在SEQ ID NO.11所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3野生型探针和在SEQ ID NO.12所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3突变型探针；
KCNJ11基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.3所示的KCNJ11正向引物、如SEQ IDNO.4所示的KCNJ11反向引物、在SEQ ID NO.13所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的KCNJ11野生型探针和在SEQ ID NO.14所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的KCNJ11突变型探针；
PPARG基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.5所示的PPARG正向引物、如SEQ IDNO.6所示的PPARG反向引物、在SEQ ID NO.15所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的PPARG野生型探针和在SEQ ID NO.16所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的PPARG突变型探针；
SLC47A1 rs2289669基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.7所示的SLC47A1rs2289669正向引物、如SEQ ID NO.8所示的SLC47A1 rs2289669反向引物、在SEQ ID NO.17所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669野生型探针和在SEQ IDNO.18所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669突变型探针；
和SLC47A2 rs12943590基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.9所示的SLC47A2rs12943590正向引物、如SEQ ID NO.10所示的SLC47A2 rs12943590反向引物、在SEQ IDNO.19所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590野生型探针和在SEQ ID NO.20所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590突变型探针。
本发明所述引物探针组的具体序列如表1所示。在本发明中，所述探针为Taqman-MGB荧光检测探针。本发明优选利用所述引物扩增需要样本DNA，然后利用探针检测荧光的释放和强度来检测基因多态性。
表1引物探针序列表
CYP2C9是磺脲类药物体内代谢酶，能降低磺脲类药体内清除率，CYP2C9*3(CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3)中CYP2C9*3/*3者药物血药浓度高，疗效较好，低血糖风险也升高；PPARG为噻唑烷二酮类药物激活受体，PPARG(34C>G)多态性能影响噻唑烷二酮类药物的疗效，PPARG(34C/C、34C/G、34G/G)中34G/G者受体敏感性增加，降糖效应增加；突变患者水肿风险升高；KCNJ11是磺脲类药物受体，KCNJ11(67A>G)多态性影响磺脲类药物疗效，KCNJ11(67G/G、67A/G、67A/A)中67A/A者对磺脲类药物敏感增加；SLC47A1rs2289669能影响药物进入肝脏的速率，G/G＞G/A＞A/A药物转运入肝功能依次降低，降糖效应减弱；SLC47A2 rs12943590可影响肾脏对双胍类药物的清除率，SLC47A2 rs12943590(C/C、C/T、T/T),T/T型药物转运入肾功能降低，药物经肾清除减慢，降糖效应增强。本发明优选运用PCR-荧光探针技术，检测上述5个基因位点多态性，多态性与用药关系如表2所示。
表2基因多态性与用药关系
本发明还提供了基于上述技术方案所述引物探针组的检测试剂盒，包括上述技术方案所述引物探针组。本发明所述试剂盒优选采用荧光定量PCR方法进行检测，通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性。本发明所述试剂盒具有快速、准确、灵敏及特异性好的特点，能从基因层面指导糖尿病的个体化用药。
在本发明中，所述试剂盒还包括PCRBuffer、dNTPS、HS-Taq酶和无核酸酶水。在本发明中，所述无核酸酶水优选用作空白对照。在本发明中，每20μL所述试剂盒的反应体系优选包括2μL PCR Buffer(1×)、2μL dNTPS(0.2mM～0.3mM)、0.2μL HS-Taq酶(1U)、11.1μL无核酸酶水、0.4μL引物和0.4μL探针。在此体系中，待测样品的添加量优选为2μL。
在本发明中，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照包括第一阳性对照、第二阳性对照和第三阳性对照；所述第一阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的野生型质粒等比混合物；
所述第三阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型质粒等比混合物；
所述第二阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型和野生型的质粒等比混合物。在本发明中，所述第二阳性对照优选为含突变型基因和野生型基因的质粒1:1混合的质粒。
本发明对所述质粒没有特殊限定，选取常规质粒进行上述基因重组质粒的构建方法即可，本发明对所述质粒的构建方法和表达方法均没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的重组质粒构建和表达方法即可。如质粒优选为T载体，所述T载体与上述五种基因的野生型、突变型基因片段分别连接后，优选转化到complement大肠杆菌JM109中。三种阳性对照对应所检测基因位点的三种型别，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
在本发明中，所述试剂盒的反应条件为：酶处理95℃变性，5min；40个循环，95℃15s，60℃30s(采集荧光)。在本发明中，所述酶包括Taq酶、HS-Taq酶。
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组或上述技术方案所述试剂盒在检测人CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590基因多态性中的应用。
在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：
1)待测样本处理与核酸提取，作为PCR的模板；
2)加样：从试剂盒中取出上述各成分组成PCR反应液，从待检样本DNA(或对照品)中取1.5μL加至PCR反应液中；
3)PCR扩增：酶处理95℃变性，5min；40cycles，95℃15s，60℃30s；
4)PCR结果有判定：在试剂盒对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线进行结果判读，如表3所示。
表3荧光扩增曲线判读表格
FAM通道 VIC通道 结果判读
Ct值≤34 No Ct或Ct值≥38 纯合野生
Ct值≤34 Ct值≤34 杂合突变
No Ct或Ct值≥38 Ct值≤34 纯合突变
在本发明中，所述待测样品优选包括EDTA抗凝全血。在本发明中，所述PCR的模板中，DNA的含量优选≥5ng/μL。
下面结合具体实施例对本发明所述的用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
一种用于CYP2C9*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590基因多态性检测的特异性引物设计
本发明的CYP2C9*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590基因多态性的PCR引物探针(见表1)，是根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)公开的人类全基因组序列，使用Primer Premier3.0设计，引物和MGB标记的探针由上海INVITROGEN有限公司合成。
实施例2
一种用于CYP2C9*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590基因突变检测的试剂盒
所述的试剂盒包括CYP2C9*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、SLC47A1rs2289669、SLC47A2 rs12943590五种PCR反应液。
CYP2C9PCR反应液包含序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12；
KCNJ11(67A/G)PCR反应液包含序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14；
PPARG(34C/G)PCR反应液包含序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16；
SLC47A1 rs2289669PCR反应液包含序列SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18；
SLC47A2 rs12943590PCR反应液包含序列SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20。
所述的试剂盒反应液中引物探针浓度：0.1uM～0.3uM。
所述的试剂盒中反应液还包括：PCR Buffer(1×)、dNTPS(0.2mM～0.3mM)、HS-Taq酶(1U)、无核酸酶水(将体系补充至18.0μL)
所述的试剂盒中还包括：三种阳性对照(第一阳性对照、第二阳性对照、第三阳性对照)和空白对照。所述第一阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的野生型质粒等比混合物；
所述第三阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型质粒等比混合物；
所述第二阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型和野生型质粒等比混合物。在本发明中，所述第二阳性对照优选为含突变型基因和野生型基因的质粒1:1混合的质粒。
实施例3
本发明的试剂盒在检测人全血中的应用
本发明采用的无核酸酶水为自产、10×PCR buffer、dNTP购自大连宝生物；DNA提取试剂盒为湖南百伯基因生物技术有限公司《DNA提取或纯化试剂盒》(备案号：湘长械备20150166)。本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。
方法：
一、生物样本：
为2018年6～12月期间在湘雅医学检验所检测的504例EDTA抗凝血。
二、DNA提取：
取无菌的1.5mLEP管，加入250μL全血。
加750μL细胞裂解液，颠倒混匀5-6次，室温静置10min。
12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀。
依次加入20μL蛋白酶K、250μL裂解液ABL，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次。
取出，加入250μL无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s。
将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中。10,000rpm离心1min。
弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500μL洗液I，10,000rpm，1min离心。
弃收集管中废液，加入700μL洗液II，10,000rpm，1min，离心。弃废液。(洗液II使用前需加入无水乙醇至80％)
重复上一步骤一次。
弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm，2min。
将吸附柱插入到新的EP管中。加入30～100μL DNA溶解液(65℃预热可提高DNA获得率)，室温静置5min。
10,000rpm，1min，离心。弃吸附柱，EP管内液体即为DNA溶液。2-8℃保存，若需长期保存请置于-20℃或更低温度。
三、加样：
从实施例2所述试剂盒中取出所需数量PCR反应液(每检测位点的PCR管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)。PCR反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖。从待检样本DNA(或对照品)中取1.5μL加至PCR反应液中。振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。
四、PCR流程
1、使用的PCR仪器为ABI 7500，反应体系为20μL；
2、PCR反应条件如下表4所示：
表4 PCR反应程序
五、结果判定
空白对照结果为阴性(No Ct或Ct值≥38)
表3为PCR结果判定：
荧光阈值：FAM的阈值为100000，VIC的阈值为60000
实施例4
本发明的试剂盒检测结果在指导糖尿病用药中的应用
根据荧光定量PCR中的结果判定(表4)得出CYP2C9*3、KCNJ11(67A/G)、PPARG(34C/G)、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs129435905个位点的基因型。本发明基因型与糖尿病用药关系对应表见表5。此表格仅供参考，实际药物选择请结合临床。图1为CYP2C9*3(CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3、CYP2C9*3/*3)分型结果图，其中，图1-1为CYP2C9*1/*1结果示例，图1-2为CYP2C9*1/*3结果示例，图1-3为CYP2C9*3/*3结果示例；图2为KCNJ11(67G/G、67A/G、67A/A)分型结果图，其中，图2-1为KCNJ11(67G/G)结果示例，图2-2为KCNJ11(67A/G)结果示例，图2-3为KCNJ11(67A/A)结果示例；图3为PPARG(34C/C、34C/G、34G/G)分型结果图，其中，图3-1为PPARG(34C/C)结果示例，图3-2为PPARG(34C/G)结果示例，图3-3为PPARG(34G/G)结果示例；图4为SLC47A1 rs2289669(G/G、G/A、A/A)分型结果图，其中，图4-1为SLC47A1rs2289669(G/G)结果示例，图4-2为SLC47A1 rs2289669(G/A)结果示例，图4-3为SLC47A1rs2289669(A/A)结果示例；图5为SLC47A2 rs12943590(C/C、C/T、T/T)分型结果图，其中，图5-1为SLC47A2 rs12943590(C/C)结果示例，图5-2为SLC47A2 rs12943590(C/T)结果示例，图5-3为SLC47A2 rs12943590(T/T)结果示例。
表5基因型与糖尿病用药关系
注意：药物在体内的过程非常复杂，影响药物疗效和毒副反应的因素很多，医生必须根据患者的病理生理特征、合并用药、临床表现、本检测结果，结合自己的专业判断确定用药方案。不能将本检测结果作为用药的唯一依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中南大学
<120> 用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组、试剂盒及方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctgcatgc aagacagga 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaggctggt ggggagaa 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaatacgtg ctgacacgcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcttggaca caaagcgggc 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttatgggtg aaactctggg agat 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagacagtg tatcagtgaa ggaatc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatttgcaac atcccctttg tc 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagtttgtgc taagcatcgt aacc 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcatcccac aagttgccat 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccgtgtcgg tacagcct 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccagagata cattgac 17
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccagagata ccttgac 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccctgccgag cccaggtacc 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accctgccaa gcccaggtac c 21
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcctattga cccagaaa 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctcctattga cgcagaa 17
<210> 17
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggaacttc cac 13
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgggaactcc cacg 14
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tagcccctcc tcct 14
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tagctcctcc tcctg 15

Claims (6)

1.用于指导糖尿病个体化用药相关基因多态性检测的引物探针组，其特征在于，包括：
CYP2C9*3基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.1所示的CYP2C9*3正向引物、如SEQ IDNO.2所示的CYP2C9*3反向引物、在SEQ ID NO.11所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3野生型探针和在SEQ ID NO.12所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的CYP2C9*3突变型探针；
KCNJ11基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.3所示的KCNJ11正向引物、如SEQ ID NO.4所示的KCNJ11反向引物、在SEQ ID NO.13所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的KCNJ11野生型探针和在SEQ ID NO.14所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的KCNJ11突变型探针；
PPARG基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.5所示的PPARG正向引物、如SEQ ID NO.6所示的PPARG反向引物、在SEQ ID NO.15所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的PPARG野生型探针和在SEQ ID NO.16所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的PPARG突变型探针；
SLC47A1 rs2289669基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.7所示的SLC47A1 rs2289669正向引物、如SEQ ID NO.8所示的SLC47A1 rs2289669反向引物、在SEQ ID NO.17所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669野生型探针和在SEQ ID NO.18所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A1 rs2289669突变型探针；
和SLC47A2 rs12943590基因检测用引物探针：如SEQ ID NO.9所示的SLC47A2rs12943590正向引物、如SEQ ID NO.10所示的SLC47A2 rs12943590反向引物、在SEQ IDNO.19所示序列的5’端修饰有FAM、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590野生型探针和在SEQ ID NO.20所示序列的5’端修饰有VIC、3’端修饰有MGB的SLC47A2 rs12943590突变型探针。
2.基于权利要求1所述引物探针组的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物探针组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq酶和无核酸酶水。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照；所述阳性对照包括第一阳性对照、第二阳性对照和第三阳性对照；所述第一阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590位点的野生型质粒等比混合物；
所述第三阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型质粒等比混合物；
所述第二阳性对照为含CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2rs12943590位点的突变型和野生型质粒等比混合物。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：酶处理95℃变性，5min；40个循环，95℃15s，60℃30s。
6.权利要求1所述引物探针组或权利要求2～5任一项所述试剂盒在检测人CYP2C9*3、KCNJ11、PPARG、SLC47A1 rs2289669、SLC47A2 rs12943590基因多态性中的应用。
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