CN1847257A - 一种与肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相关的单核苷酸多态性及其用途 - Google Patents
一种与肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相关的单核苷酸多态性及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种与肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相关的单核苷酸多态性，以及在肥厚型心肌病严重程度诊断方面的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种与肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相关的单核苷酸多态性，以及在肥厚型心肌病严重程度诊断方面的用途。
背景技术
早在19世纪中叶，法国人A.Vulpian就在镜下观察并描述了肥厚型心肌病，但是直到20世纪50年代后期，肥厚型心肌病独特的临床特点才被系统地论述。它通常以不对称的左和/或右心室肥厚为特征，可累及心室的不同部位，尤以心室间隔为著，左室容积可正常或减少。典型的形态学改变为肌纤维排列紊乱。临床表现为呼吸困难、心绞痛及晕厥，心律失常、猝死亦常见。肥厚型心肌病以往被认为是一种少见的心脏疾病，但Maron等进行的流行病学调查显示，年轻人的发病率达0.2％[1]。肥厚型心肌病有50％以上为常染色体显性遗传，称家族性肥厚型心肌病(FHC)。分子遗传学研究发现，编码肌小节结构蛋白的基因突变是家族性肥厚型心肌病的根本病因[2、3]。
肌小节是心肌收缩的基本单位，主要由粗、细肌丝两部分组成。粗肌丝主要为肌球蛋白(myosin)和肌球蛋白连接蛋白C(MyBPC)，前者包括两条肌球蛋白重链(MHC)和两对轻链——必需/碱性轻链(MELC，MLC-1)及调节/磷酸化轻链(MRLC，MLC-2)。细肌丝包括肌动蛋白(actin)、α-原肌球蛋白(α-Tm)和肌钙蛋白复合体(TnT，TnC，TnI)。此外，肌小节成分还有肌连蛋白(titin)等。
目前，已证实13个基因160多个位点的突变与FHC的发病有关，其中有10种是编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因[4](表1)。
表1.家族性肥厚型心肌病致病基因的发生频率及突变类型
| 蛋白 | 基因 | 染色体定位 | 频率 | 突变 |
| β-MHCcMyBPCcTnTα-TmcTnIMLC-1MLC-2Titinα-Actinα-MHCPKA钾通道线粒体 | MYH7MYBPC3TNNT2TPM1TNNI3MYL3MYL2TTNACTCMYH6PRKAG2KCNQ4MTTI | 14q11.2-q1211p11.21q3215q2219p13.2-q13.23p21.2-p21.312q23-q24.32q24.111q14q7q22-q31.11p34线粒体 | ～50％～20％～15％～5％～5％＜5％＜5％＜5％＜5％罕见？罕见罕见 | 74个错义、3个缺失、一个无义突变13个错义、12个剪接位点、8个插入/缺失突变12个错义、1个剪接位点、1个缺失突变6个错义突变7个错义、1个缺失突变2个错义突变7个错义、1个无义突变1个错义突变5个错义突变1个错义、一个移码突变1个错义突变(合并WPW)1个缺失突变(合并耳聋)异亮氨酸、甘氨酸tRNA突变 |
分子遗传学的研究初步揭示了FHC的异质性特点，不仅存在基因型的异质性即多种基因多种突变可以导致FHC，而且存在表型的异质性即外显率、心肌肥厚的程度、不适症状、心源性猝死、心律失常、预后等也因人而异。这种异质性尤其是表型的异质性引起了研究者的兴趣，同时也是急需解决的难题之一。目前考虑与下列因素有关：①突变引起的肌小节的功能损害程度在不同突变位置与突变蛋白类型间有显著差异；②环境因素及后天获得性特质(如生活方式不同、各种风险因素的存在及活动等)对表型的影响；③修饰基因和/或多肽性的存在，干扰了突变基因的表达，影响了疾病的临床表型。其中修饰基因已引起越来越多的注意。修饰基因的研究策略之一是基于大样本人群的病例对照研究，SNP因在基因组中分布广，正逐渐成为遗传多态标记中的新宠。截至2003年8月24日，NCBI已收录SNP已达1,729,779，其中证实的有548,734个。如此大量SNP信息资源为开展HCM的病例对照关联研究提供了极大便利，使得能够花费较少的人力，物力通过关联分析从众多候选基因中寻找修饰基因和易感遗传因素。通过候选HCM修饰基因SNP与HCM临床表型(包括左室肥厚，左室重量，左室内径，左房内径，左室游离壁厚度，左室射血分数，左室缩短比数等)的关联研究可以达到以下目的：1寻找HCM的修饰基因，探讨HCM发病机制，为HCM的干预，治疗提供靶点；2明确修饰基因对临床表型的影响；3与HCM临床表型相关联的SNP可以作为表记，进行HCM的危险分层；4可以将修饰基因的SNP与致病基因突变筛查相结合，预测患者的临床与预后，并为开展个性化治疗奠定基础。
目前获得的修饰基因影响疾病临床表型的证据之一是血管紧张素I转化酶插入/缺失多肽性的影响：较对照人群而言，D等位基因更加普遍地存在于肥厚型心肌病病人及高猝死率病人中。在排除MYBPC3突变的MYH7的403位点突变携带者身上，发现D等位基因与心肌肥厚有相关性，从而提出家族性肥厚型心肌病(FHC)的多基因修饰概念。
本发明中通过对肥厚型心肌病病人进行基因型筛查，发现了肌球蛋白连接蛋白C(cMyBPC)基因中存在的新的多态性位点，它们与肥厚型心肌病病人中心肌肥厚程度相关。
发明内容
本发明公开了cMYBPC基因中新发现的单核苷酸多态性位点。本发明还提供了可用于检测这一核苷酸多态性的寡核苷酸，以及利用这样的寡核苷酸检测该多态性的方法。本发明提供了利用这样的核苷酸多态性确定肥厚型心肌病预后或严重程度或者药物筛选或评估的方法。本发明另外涉及微阵列。
附图说明
图1显示了cMYBPC基因中第18443位点处存在的A/G多态性测序图。该位点在第30外显子，GAA密码子编码氨基酸序列的第1096位的谷氨酸(E)，这个氨基酸位点C10 Ig结构域，密码子最后一个核苷酸A→G，其编码的氨基酸并没有改变。
具体实施方式
在本发明中，术语“样品”是指来源于人类个体的任何生物学样品，包括但不限于例如细胞，组织样品如机体软组织例如骨组织、毛发等，生物学流体如淋巴液、血液、唾液、尿液和其它机体排泄液等。术语“分离的”意指非天然存在的。“分离的核酸”指并不与其所来源的个体基因组中相邻的5’和/或3’侧翼序列相毗邻的核酸。因此，“分离的核酸”也包括插入载体内的核酸，掺入异源细胞的基因组内的核酸，或者以独立体存在的核酸。该术语还包括与其它核酸序列相连接的重组核酸。这样的重组核酸可能用于生产融合蛋白。
在本发明中，野生型cMYBPC基因指的是现有技术中已知的cMYBPC基因，其序列以Genbank登录号gi：Y10629公开在Genbank数据库中，在本发明中以SEQ ID NO：2表示。在该序列中，第30个外显子内的第18443位核苷酸残基为A。该等位基因在本发明中被称作等位基因A。本发明中发现，在该核苷酸残基位点处的核苷酸残基还可以是G，这样的等位基因在本发明中被称作等位基因G，也称作cMYBPC变体基因。因此，对于cMYBPC基因的第18443位残基而言，cMYBPC基因存在三种基因型：A/A、A/G和G/G。
在一个实施方案中，本发明提供了一种cMYBPC变体基因或其片段，其在对应于Genbank登录号gi：Y10629(SEQ ID NO：2)所列序列中的第18443位核苷酸残基处含有G而不是A。
在进一步的实施方案中，本发明的变体基因或片段中还含有额外的突变，包括任何已知的或将来获知的突变或核苷酸多态性。
本发明还涉及由上述变体基因或片段衍生的mRNA或cDNA。
本发明还涉及可以区分上述野生型cMYBPC基因和变体基因或其包含第18443位核苷酸多态性位点的片段或者由其衍生的mRNA或cDNA或者它们的互补序列的核酸，例如寡核苷酸。这样的核酸可以不同的能力与等位基因A或其片段和等位基因G或其片段发生杂交，例如仅与其中之一发生杂交，从而辨别出该位点处存在的核苷酸残基。该核酸可作为探针或引物用于特异性检测人类个体中的上述多态性。本领域中的技术人员均清楚，探针一般具有与目的核酸的序列互补、并与包含待检测多态性的核酸特异性杂交的序列。该寡核苷酸一般定位于突变位点周围，特异性地检测样品中上述突变的存在与否。优选地，所述核酸或其互补序列中含有上文所定义的核苷酸多态性。作为例示，寡核苷酸引物或探针可设计成待检测的多态性位点位于其5’或3’末端或者在中间，或者待检测的多态性位点位于该引物或探针的互补序列的5’或3’末端或者在中间。在本发明的上下文中，术语“特异性检测”是指该寡核苷酸只与包含上文定义的等位基因之一或其片段或互补序列发生杂交，而不与另一等位基因或其片段或互补序列的核酸发生杂交。
寡核苷酸探针或引物可设计成使得18443位多态性位点的核苷酸序列或与其互补的序列的整个或部分包含在探针或引物的核苷酸序列中。这样，有可能利用由此制备的寡核苷酸作探针通过杂交或差异杂交的存在与否来确定18443位多态性位点处存在的核苷酸残基，或者作为引物通过扩增并随后检测多态性情况。这种检测可通过多种方法进行，包括例如测序、限制性酶切等。或者，可以将探针或引物用可检测标记标记上，从而可以很容易地区分开不同的等位基因。由于第18443位核苷酸残基为A时在该位点附近没有SacI酶切位点，而第18443位核苷酸残基为G时形成了SacI酶切位点。因此，可通过SacI限制性内切酶的切割而将这两种等位基因区分开。
寡核苷酸探针或引物一般长度大于约10bp，例如10-100个核苷酸，优选地，其长度为15-75个核苷酸，更优选18-50个核苷酸，尤其优选为20-35个核苷酸，最优选为23-30个核苷酸。本领域中的技术人员可以很容易设计出合适的寡核苷酸探针或引物，用于多态性位点的检测。至于其制备，则可通过本领域技术人员熟知的方法进行，包括但不限于例如化学合成法等。优选地，探针/引物是被可检测标记的，以便于检测。标记可以是例如生物素、荧光染料、放射性同位素等，但并不限于此。它们是现有技术中已知的，并可通过常规方法连接到探针/引物上。该核酸可以是单链的，也可以是双链的。
在本领域中众所周知，可利用引物通过添加游离核苷酸而延伸核酸序列。杂交指的是在严谨条件下与核酸序列发生选择性结合。在本文中，严谨条件是仅允许引物与含多态性位点的等位基因之一的核苷酸序列或其互补序列杂交，而不与另一等位基因的核酸序列或其互补序列杂交的条件。依照所使用的引物，普通技术人员可以通过常规实验确定相应的严谨杂交条件。在这方面有众多的现有技术可供参考，包括例如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。
本发明还涉及利用设计成在扩增后将得到包含多态性位点的片段的引物进行突变检测。所述引物一般定位于多态性位点周围或者其5’或3’方向1000bp、优选500bp、更优选250bp、尤其优选200bp、最优选100bp的范围内，其长度一般大于约10bp，优选为15-100bp，更优选为18-75bp，尤其优选为20-50bp，最优选为25-40bp。
还可以在本发明的寡核苷酸序列5’和/或3’末端连接一些额外的核苷酸序列。这样的寡核苷酸也在本发明的范围内。
利用这样的寡核苷酸，通过对来自人类个体的遗传材料进行扩增和随后分析，可以确定所述人类个体中cMYBPC基因第18443位核苷酸残基位点的等位基因类型。例如，可以将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后用溴化乙锭、SYBR绿色溶液、诸如此类染色，从而以条带(DNA片段)的形式检测扩增产物。由此，可以以DNA片段的形式检测包含所述多态性位点的基因片段。除了琼脂糖凝胶电泳以外，也可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳。进一步地，可以分离扩增产物，随后通过测序或者限制性酶切分析多态性位点的类型。还有可能使用预先经诸如荧光染料等物质标记的引物进行PCR，并检测扩增产物。还可以采用不需要电泳的检测方法；在这种方法中，将扩增产物结合到固体支持物诸如微型板上，并通过荧光、酶反应、诸如此类等手段来检测目的DNA片段。
本发明提供了检测上述核苷酸多态性的方法，包括应用上文所述寡核苷酸探针或引物检测生物学样品，或者应用设计成在扩增后将得到包含该突变的片段的引物对扩增该生物学样品并进行检测的步骤。在检测中，通常应用待测个体的生物学样品，例如其血液，但并不限于此。在一个实施方案中，直接应用该生物学样品进行检测。例如，利用上述核酸作为引物，通过PCR法扩增包含待检测多态性位点的片段。在另一个实施方案中，在检测前首先从该生物学样品分离遗传材料，例如基因组DNA，但并不限于此。检测可通过例如核酸杂交、PCR法、测序法、限制性片段长度多态性测定法等方法常规进行，但并不局限于这些方法。其条件是本领域普通技术人员所知的，或可非常容易地确定。优选地，使用如上所述制备的寡核苷酸作为引物，用DNA聚合酶扩增编码包含待检测多态性位点的DNA片段。或者，将如上所述制备的探针与模板DNA杂交，从而检测那些具有感兴趣核苷酸多态性的DNA。可以依照常规方法来制备模板DNA，如氯化铯梯度离心、SDS裂解法、或酚/氯仿抽提。
本发明还涉及一种微阵列，其中含有上述寡核苷酸探针或引物。该寡核苷酸可以固定在固相支持物上。在一个实施方案中，所述微阵列是DNA芯片、基因芯片、微型芯片、珠阵等的形式。DNA芯片是将很多种DNA探针排列并固定在基片例如玻璃片上，然后在上面进行标记DNA的杂交、通过检测探针上的标记信号而可区分地检测完全匹配和核苷酸错配，由此对核酸进行检测。芯片的常规制备方法是本领域技术人员已知的。
本发明还涉及可用于检测上述核苷酸多态性的试剂盒，其中包括一种或多种相关的诊断性引物或探针和/或可区分18443位核苷酸多态性位点处的上述多态性的寡核苷酸引物，例如前文所述的寡核苷酸探针或引物。试剂盒中还可包括容器、使用说明书、缓冲液、酶和/或其它反应成分。优选地，其中还包含阳性对照和阴性对照，以便进一步确认检测结果。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于预定测定法的任何和所有成分酶或成分。这些成分的实例包括但不限于寡核苷酸、聚合酶(如Taq聚合酶)、缓冲液(如Tris缓冲液)、dNTP、对照试剂(如组织样品、用作阳性和阴性对照的靶寡核苷酸、等)、标记和/或检测试剂(荧光染料诸如VIC、FAM)、固体支持物、说明书、例示性图表和/或产品信息、抑制剂等。本发明的试剂盒可以是只包含部分必需成分的部分试剂盒。在这种情况中，使用者可以提供其余成分。本发明的试剂盒可以包含两个或多个分开的容器，每个都包含将要使用的部分成分。例如，在试剂盒中，第一个容器包含酶，而第二个容器包含寡核苷酸。酶的具体实例包括适当保存缓冲液或容器中的结构特异性切割酶。
本发明还涉及确定肥厚型心肌病患者中心肌肥厚严重性的方法，包括对个体的体外样品检测cMYBPC基因中第18443位核苷酸残基处的多态性。优选地，检测步骤是按照前文所述多态性检测方法进行的。例如，使用位于多态性位点上下游的寡核苷酸首先对包含待检测的多态性位点的核酸片段进行PCR扩增。检测可通过例如PCR法、测序法、限制性片段长度多态性等进行。
本发明还涉及利用上述cMYBPC变体基因作为靶点筛选或评估药物的方法，包括例如对在cMYBPC变体基因第18443位核苷酸位点处含有G/G基因型的细胞、组织、器官或动物个体给予一种或多种药物，并评估其一个或多个指示肥厚型心肌病状况的指标，包括例如心肌厚度，以指示疾病改善状况。操作对象可以是个体，例如小鼠。或者，操作对象也可以是细胞，例如人的心肌细胞。这样，可以在个体或细胞水平上对药物进行筛选或评估。
下面以实施例的方式对本发明作出说明。这些实施例都是示范性的，它们不以任何方式限定本发明的范围。
实施例
实施例1 基因组DNA的提取
1研究对象的选择
研究对象为在中国医学科学院阜外心血管病医院诊断明确的门诊就诊或住院的肥厚型心肌病病人，共100例，经家族调查无血缘关系。其中包括肥厚型心肌病家系先证者51人，相关家系成员356人，散发病例49人。正常研究对照120例为性别、年龄匹配的健康人。入选者填写《分子遗传学研究病例调查表》，内容包括：病人联系方式、个人一般情况、临床症状、体检结果、家族史调查、实验室检查、心电图(必要时Holter)，胸片报告，超声心动图报告(必要时需心脏MRI或左室及冠脉造影结果)。建立资料数据库。肥厚型心肌病诊断标准(WHO/ISFC 1996年公布)
(1)基本标准：超声心动图诊断的原因不明的心脏左室壁厚度大于或等于13mm；或心尖部肥厚或右室肥厚。
(2)参考标准：心电图左室高电压表现，伴/不伴II、III、avF、avL及V4V5导联病理性Q波及ST-T改变。
(3)排除标准：长期高血压、缺血性心肌病及其他可引起心室肥厚的原发性疾病。
(4)家族性肥厚型心肌病确定标准：有心肌病的家族遗传倾向，即病人(先证者)家族中有多人发病，并符合常染色体显性遗传特点。
2基因组DNA的分离
取患者肘静脉血5ml，EDTA(0.5M)抗凝，2500rpm离心10min。小心吸取上层血浆，用1.5ML的Eppendorf管分装。在血细胞中加入3倍体积的溶血液(NH4Cl 8.29g、KHCO3 1.0g、EDTA-Na2 0.03734g，加双蒸馏水至1000ml，调节PH为7.4)，摇匀，冰浴15min。2500rpm离心10min，弃上清。向细胞沉淀中加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。3000rpm离心10min，弃上清，得到白细胞，直接用于提取基因组DNA，或者于-80℃冻存备用。
如下提取基因组DNA：取白细胞，加4.5ml SE(NaCl 4.383g、EDTA-Na2 9.306g加双蒸馏水至1000ml，调节PH值为8.0)，使劲吹打，混匀。沿管壁加入0.5ml的10％SDS，然后加蛋白酶E(100mg/ml，MilliQ水)50μl，首尾轻摇10min，混匀，然后于37℃水浴过夜。第二天取出，沿管壁加3ml饱和NaCl，迅速手摇15s，使蛋白变性析出，然后于4000rpm离心10min。取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。2500rpm离心10min。取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。2500rpm离心10min，取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇后，首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。将DNA挑至管壁，用75％乙醇洗涤2遍。将DNA挑至0.5ml管中，冻干。最后加TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，调节PH为8.0)300μl，使DNA溶解，紫外分光光度计测OD值定量，4℃保存。
实施例2 PCR法检测肌球白连接蛋白C(cMYBPC)基因中的多态性
为检测肌球蛋白连接蛋白C(cMYBPC)基因中的多态性，进行了PCR，其中所用引物及扩增条件如下表2所示(基因组序列来自Genebank database，登陆号为Y10629)：
表4
| 外显子 | PCR片段长度 | 引物 | PCR反应条件 |
| Exon1Exon 2Exon 3-5Exon 6Exon 7-9Exon 11.12exon13exon14-17exon 18exon 19.20 | 145bp550bp1016bp344bp674bp594bp315bp915bp537bp537bp | F 5’atg gtg agt agc ctg gtg tga c 3’R 5’ccc cct caa gaa ctc ctc ct 3’F 5’tgt cct cct ctg aga aat gaa cag 3’R 5’cag caa agg caa gaa agt gtg a 3’F 5’gtg gag ggg tct ctg gtt agt 3’R 5’tct gtg tgc ctt gtg cct tct3’F 5’ggg tgc gga gcc ttg tct3’R 5’gcc ttg ggg ttt ctc tca cac3’F 5’cag ggc agg gct tct caa a3’R 5’gac aga caa gga aac caa ctc aga3’F 5’ggg tgg ggt cca ggt ctt t3’R 5’atg ccc tct cct ctc ctg tgt3’F 5’gcg gca cag agg gga ttg3’R 5’ggg cag gag gca agg cta t3’F 5’tct cgg ggc tca ctt cct c3’R 5’gtc acc tca gca tcg tca ttt tag3’F 5’cag cct aaa cct cat cct tct ca3’R 5’tgt ttc ctg tgt ctc tct ctg t3’F 5’cac ttt tac gct gcc tac ctc tg3’ | 95℃5’，94℃30’’，58℃30’’，72℃30’’(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，62℃30’’，72℃40’’(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，62℃30’’，72℃40’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，62℃30’’，72℃30’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，63.9℃30’’，72℃40’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，62.5℃30’’，72℃40’’(39cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，56℃30’’，72℃30’’(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，63℃30’’，72℃90’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，58℃30’’，72℃40’’(36cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，58℃30’’， |
| exon 21.22exon 23exon 24.25exon 26exon 27exon 28.29exon 30-.32exon 33.34 | 623bp525bp619bp567bp275bp770bp996bp605bp | R 5’atc ctt gct ttt ccc tct gtg a3’F 5[‘tgg ctc tcc cgt ttc tct ga3’R 5’agc aac aca ccc gac caa gt3’F 5’agt cgg tgc cca gag atg aat3’R 5’cag cag tgt cgc agg aaa tct3’F 5’ctg tgg cgg tta gtt gga gtg3’R 5’agg atg aaa gga gac tgt3’F 5’act tga act cgg gag gca gaa3’R 5’ccc tct ctg cac ttt ttc cct a3’F 5’cag tgg gag tgg ggt gtc ag3’R 5’ggt gtc aat ggc ggg tct t3’F 5’agg gag gtt gga gct gtg ga3’R 5’tgg gga gga ctt ggc ttg t3’F 5’gga ccc aac cca cag ctc ac3’R 5’agg ctg ggg aga gga ctg c3’F 5’gga ccc ccc gag tag aaa ca3’R 5’gcc cct aca gcc tcc cat tt3’ | 72℃40’’(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，56℃30’’，72℃40’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，53℃30’’，72℃50’’(36cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，58℃30’’，72℃40’’(38cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，55.5℃30’’，72℃30’’(35cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，60℃30’’，72℃40’’(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，62℃30’’，72℃50’’(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，66.5℃30’’，72℃120’’(40cycles)；72℃7’95℃5’，94℃30’’，56.3℃30’’，72℃50’’(35cycles)；72℃7’ |
按照表4中的PCR条件对各患者或对照的基因组DNA进行PCR扩增，并按照实施例2的方法分离扩增产物并对其测序。由此筛选出来的基因突变列于表5中。
表1.引物及扩增条件(MYBPC3，gi：Y10129)
| 外显子 | 目的片段长度 | 引物序列 | PCR反应条件 |
| Exon30-32 | 996bp | F 5’gga ccc aac cca cag ctc ac3’R 5’agg ctg ggg aga gga ctg c3’ | 95℃5m；94℃30s，66.5℃30s，72℃120s(40cycles)；72℃7m |
PCR反应基本体系(50μl)
引物(浓度20pmol/μl) 1μl
10×buffer(含Mg2+) 5μl
TaqDNA聚合酶(2u/μl) 1μl
dNTP(10mM) 1μl
人基因组DNA 1μl
消毒双蒸水 41μl
(3)按上述配制反应体系，在PCR仪上进行反应，吸取2μl PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定，显示得到了预期长度的PCR产物。
4.PCR反应产物测序前纯化
将50μl PCR反应产物同其6倍体积的无水乙醇与5M醋酸胺(5∶1)混合溶液混合，置于-80℃30分钟以上，然后于14,000rpm、4℃离心15分钟，弃去上清，向沉淀中加入200μl的75％酒精，于14,000rpm、4℃离心5分钟，吸上清弃去。将沉淀室温或冷冻干燥后，加入20μl TE溶解，并取吸2μl等分试样经2％琼脂糖凝胶(0.5×TBE缓冲液配制)电泳进行定量。
5.末端双脱氧法测序
配制如下反应体系(20μl)
BigDyeTM 4μl
BigDyeTM缓冲液 2μl
引物(10pmol/μl) 2μl
按照如下进行PCR测序反应(根据引物的退火温度而定)：
94℃ 2min
4℃ 保存
或94℃ 2min
4℃ 保存
反应完成后，进行测序产物的纯化：向20μl产物中加25μl醋酸铵(5M)和125μl乙醇，置-70℃1小时，然后14,000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀制加入75％乙醇100μl，于14,000rpm离心5分钟，弃上清。将沉淀于95℃1分钟烤干后，加入2μl上样缓冲液，混匀，于94℃变性5分钟，然后迅速置于冰上。将纯化后的测序反应产物在ABI PRISM377自动测序仪上测序，并在IMAC 333计算机上用AssemblyLIGNTM、Sequencing Analysis 3.4软件进行测序结果的分析。
结果显示，cMYBPC基因第30号外显子中的第18443位核苷酸残基处存在A/G多态性。该位点位于第30个外显子内，GAA密码子编码氨基酸序列第1096位的谷氨酸(E)，这个氨基酸位于C10 Ig结构域，密码子最后一个核苷酸A→G，其编码的氨基酸并没有改变。为了对进一步的肥厚型心肌病患者中的此核苷酸多态性进行检测，设计了如下引物：F1 5’-CCC AAC CCA CAG CTC ACA-3’；R5’-CCC TTC CTG ATG CCG AGA-3’。以F1、R为引物，对患者和正常人的基因组DNA按下述条件扩增：
PCR反应体系(20μl)：
引物(20pmol/μl) 0.4μl
10×buffer(含Mg2+) 2μl
TaqDNA聚合酶(2u/μl) 0.5μl
dNTP(10mM) 0.4μl
人基因组DNA 0.2μl
消毒双蒸水 16.5μl
PCR反应条件：
95℃ 5min
72℃ 10min
4℃ 保存
经2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，发现扩增出了预期的约463bp片段。其中，A等位基因的扩增片段中没有SacI的酶切位点，而G等位基因的扩增片段中有SacI酶切位点。因此，以SacI对PCR产物进行酶切可以区分这两种等位基因，其中前者可以见到463bp的片段，而后者为183bp和240bp的两条片段。
对226位HCM患者及176位正常人进行上述测定，结果如下：
| 研究对象 | MYBPC3 18443 Genotype | ||
| HCM患者正常对照 | AA8786 | AG117120 | GG2220 |
在入选的226例HCM患者和226例对照中，我们观察了该位点不同基因型的频率，并比较了不同基因型的HCM患者心肌肥厚的程度。结果见表2。cMYBPC基因18443A/G多态位点不同基因型在HCM患者和正常对照组的分布频率无明显差别(p＞0.05)。携带GG基因型的HCM患者肥厚心肌的厚度(25.2±5.9mm)大于携带AG，AA基因型(18.9±4.98mm，p＜0.01)的HCM患者。同时我们也观察比较了携带不同基因型的HCM患者其他临床表型(发病年龄、晕厥、ECG变化、SAM征、LVDD、LADD)，结果未见显著差别。以上结果说明cMYBPC基因的18443A/G多态位点不同的基因型能够导致HCM患者不同程度的心肌肥厚，提示cMYBPC基因不仅是HCM的致病基因，而且还是影响心肌肥厚程度的修饰基因。
Claims (10)
1.一种分离的cMYBPC变体基因或者其片段，其在对应于Genbank登录号gi：Y10629列出的序列(SEQ ID NO：2)中的第18443位残基处含有G而不是A。
2.权利要求1的分离的cMYBPC变体基因或者其片段，其中还包含额外的突变或核苷酸多态性。
3.一种核酸，其可与权利要求1或2的cMYBPC变体基因或片段或者其互补序列特异性杂交，但不能与SEQ ID NO：2所示基因或其互补序列的核酸杂交。
4.权利要求3的核酸，其长度为10-100个核苷酸，优选为15-75个核苷酸，更优选为18-50个核苷酸，尤其优选为20-35个核苷酸，最优选为23-30个核苷酸。
5.权利要求4的核酸，其中所述18443位核苷酸残基位点位于该核酸的5’末端或3’末端或中间。
6.权利要求3-5中任一项的核酸，其中所述探针被可检测性标记上，例如被生物素、荧光染料、放射性同位素等标记上。
7.一种试剂盒，其中包含权利要求3-6中任一项所述的核酸，以及使用说明书。
8.一种确定cMYBPC基因中第18443位核苷酸残基处的核苷酸多态性的方法，包括应用权利要求3-6中任一项所述的核酸作为探针或引物检测生物学样品，或者应用设计成在扩增后将得到包含该多态性位点的片段的引物对扩增该生物学样品并进行检测的步骤。
9.一种微阵列，其中包含权利要求3-6中任一项所述的核酸。
10.一种筛选或评估药物的方法，包括对在cMYBPC基因中第18443位核苷酸残基处包含G或A残基的细胞、组织、器官或动物个体给予一种或多种药物，并评估其一个或多个指示肥厚型心肌病状况的指标，例如心肌肥厚程度，以指示疾病改善状况。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510062988 CN1847257A (zh) | 2005-04-04 | 2005-04-04 | 一种与肥厚型心肌病中心肌肥厚程度相关的单核苷酸多态性及其用途 |
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ID=37077025
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| CN (1) | CN1847257A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695606A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-22 | 昆明理工大学 | 用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 |
| CN106868175A (zh) * | 2017-03-28 | 2017-06-20 | 昆明理工大学 | 一种引物组合物及其应用 |
-
2005
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105695606A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-22 | 昆明理工大学 | 用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 |
| CN105695606B (zh) * | 2016-04-07 | 2020-08-28 | 昆明理工大学 | 用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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