WO2021060311A1 - 脳腫瘍を検査する方法 - Google Patents

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WO2021060311A1
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hsa
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brain tumor
test
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隆雄 安井
馬場　嘉信
敦至 夏目
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国立大学法人東海国立大学機構
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Definitions

  • the present invention relates to a method for inspecting a brain tumor and the like.
  • Brain tumor is a general term for tumors that form in the skull, and can be divided into two types: primary brain tumor and metastatic brain tumor. Brain tumors are usually found in patients who complain of subjective symptoms such as headache, vomiting, paralysis, aphasia / dysarthria, and impaired consciousness, imaging tests for minor head injuries, and imaging tests in health examinations such as brain docks. .. In diagnostic imaging, CT, MRI, cerebral angiography, etc. are used. If a brain tumor is found by diagnostic imaging, the tumor is removed by craniotomy, and the removed tissue is used for pathological diagnosis. At present, tumor markers for detecting malignant brain tumors with markers in blood are not widely used in clinical practice.
  • MicroRNA is a small molecule in the body composed of 20-25 bases, and is promising as a biomarker for predicting the onset of disease.
  • Patent Document 1 reports a plurality of miRNAs that can be used as biomarkers for malignant brain tumors from blood that can be collected with minimal invasiveness.
  • An object of the present invention is to provide a novel biomarker for brain tumors and a method for using the same.
  • the present inventor has miR-345-3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR in body fluid-derived samples collected from the subject. -199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR -26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR -296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140 -3p, miR-122-5p, miR-335-3p,
  • Item 1 A method of testing for brain tumors (1) In the body fluid-derived sample collected from the subject, miR-345-3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b- 3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-122-5p, miR- 335-3p, miR-539-5p
  • Item 2. A step of determining whether or not the subject has a brain tumor based on the amount or concentration of the biomarker detected in the step (1).
  • Item 1. The inspection method according to Item 1.
  • the biomarkers are miR-345-3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483- 3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR- 541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR- 20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-122-5p, miR-335-3p, miR-539-5p, miR-374b-5p, miR-144-5p, miR
  • the biomarkers are miR-345-3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, and miR-483.
  • Item 5. The inspection method according to Item 3 or 4, wherein the biomarker is 3 or more types.
  • Item 6 The test method according to any one of Items 3 to 5, wherein the brain tumor is a glioma.
  • the biomarkers are miR-6070, miR-450a-2-3p, miR-4638-3p, miR-20a-3p, miR-646, miR-151a-5p, miR-151b, miR-146a-5p, miR- Consists of 371a-3p, miR-21-3p, miR-578, miR-4428, miR-5095, miR-193a-3p, miR-4538, miR-492, miR-4482-5p, and miR-4768-3p Item 2.
  • the inspection method according to Item 1 or 2 which is at least one selected from the group.
  • Item 8 Any of Items 1, 2 and 7, wherein the biomarker is at least one selected from the group consisting of miR-6070, miR-450a-2-3p, miR-4638-3p, and miR-20a-3p. The inspection method described in.
  • Item 9. The inspection method according to Item 7 or 8, wherein the biomarker is 3 or more.
  • Item 10 The test method according to any one of Items 1 to 9, wherein the body fluid is urine.
  • Item 11 The test method according to any one of Items 1 to 10, wherein the body fluid sample is an extracellular vesicle of urine.
  • Item 12. The test method according to any one of Items 1 to 11, wherein the subject is a human.
  • miR-345-3p miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR- 204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-122-5p, miR-335-3p, miR-539-5p, miR-374b- 5p, miR-144-5p, miR-196a-5p
  • miR-345-3p miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR- 204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-122-5p, miR-335-3p, miR-539-5p, miR-374b- 5p, miR-144-5p, miR-196a-5p
  • biomarker for a brain tumor.
  • the present invention is, in one aspect, a method for testing a brain tumor, wherein (1) miR-345-3p, miR-208a-5p, miR- in a body fluid-derived sample collected from a subject. 188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251- 5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR- 32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2- 5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-5
  • the type of brain tumor to be examined is not particularly limited.
  • Examples of brain tumors include glioma, meningioma, primary malignant lymphoma of the central nervous system, pituitary adenoma, schwannoma, craniopharyngioma and the like.
  • glioma, meningioma and the like are preferably mentioned as targets of the inspection method of the present invention.
  • Brain tumors of all classes, grades, and stages in the various classification criteria for brain tumors are tested.
  • the subject is the target organism of the test method of the present invention, and the species thereof is not particularly limited.
  • Examples of the organism species of the subject include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, and humans are preferable.
  • the condition of the subject is not particularly limited.
  • the subjects include, for example, a sample whose presence or absence is unknown whether or not they have a brain tumor, a sample which has already been determined to have a brain tumor by another method, and a sample which has already been determined to have no brain tumor by another method. Examples thereof include specimens that are being treated for brain tumors.
  • Body fluid is not particularly limited.
  • body fluids include urine, whole blood, serum, plasma, spinal fluid, saliva, joint fluid, tissue fluid (including bronchoalveolar lavage fluid), sweat, tears, sputum, nasal juice, and the like, preferably urine. ..
  • the body fluid-derived sample may be the body fluid itself, or may be a sample obtained by performing some operation (separation, purification, drug addition, etc.) on the body fluid.
  • the body fluid-derived sample extracellular vesicles of body fluid are preferable, and extracellular vesicles of urine are particularly preferable.
  • the body fluid-derived sample one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the extracellular vesicle is not particularly limited as long as it is a membrane vesicle secreted or released from the cell.
  • Extracellular vesicles are usually defined as membrane vesicles that are responsible for local and systemic intercellular communication by transporting intracellular proteins and genetic information (mRNA, microRNA, etc.) out of the cell.
  • Examples of extracellular vesicles include exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, ectosomes, microparticles, secretory microvesicles and the like. Of these, exosomes are preferred.
  • Extracellular vesicles can be purified, separated, concentrated, etc. from urine according to or according to a known method.
  • methods for purifying, separating, and concentrating extracellular vesicles include a method using nanowires, an ultracentrifugation method (for example, pellet down method, sucrose cushioning method, density gradient centrifugation method, etc.), and a method using an immunoaffinity carrier. Examples include a gel filtration method, a field flow fractionation method, and a FACS method. Further, purification, separation, concentration and the like of extracellular vesicles can be performed using a commercially available kit.
  • the method using nanowires is particularly preferable from the viewpoint of efficiently capturing extracellular endoplasmic reticulum in urine.
  • the method using nanowires is described in, for example, International Publication No. 2015/137427. These methods may be adopted alone or in combination of two or more.
  • the detection targets in step (1) are miR-345-3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a-5p, miR-93-3p, miR-328-5p. , MiR-483-3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a-1-3p, miR-27b-3p, miR-338 -5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296-3p, miR-598-5p, miR-125b-2 -3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-140-3p, miR-122-5p, miR-335-3p, miR -539-5p, miR-374b-5p, miR-144-5p
  • the target biomarker is a biomarker whose expression level is changed in a brain tumor, and the brain tumor can be differentiated by using this as an index.
  • BM1B At least one biomarker selected from the group is a target biomarker whose amount in brain tumor specimens tends to be lower than in healthy specimens.
  • miR-345-3p miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a -5p, miR-93-3p, miR-328-5p, miR-483-3p, miR-204-3p, miR-411-3p, miR-1251-5p, miR-30c-2-3p, miR-26a -1-3p, miR-27b-3p, miR-338-5p, miR-541-3p, miR-224-3p, miR-143-3p, miR-32-3p, miR-202-5p, miR-296 -3p, miR-598-5p, miR-125b-2-3p, miR-20b-3p, miR-181b-2-3p, miR-29b-2-5p and the like, more preferably miR-345- Examples thereof include 3p, miR-208a-5p, miR-188-3p, miR-504-5p, miR-199a -5p, miR-93-3p, miR-328-5
  • miR-509-5p, miR-208a-5p, miR-345-3p, miR-30c-2-3p, miR-199a-5p, miR are preferable.
  • -483-3p, miR-204-3p, miR-188-3p, miR-328-5p, miR-504-5p, miR-224-3p, etc. are mentioned, and more preferably miR-509-5p, miR- 208a-5p, miR-345-3p, miR-30c-2-3p, miR-199a-5p and the like can be mentioned.
  • miR-539-5p miR-99a-5p, miR-181b-2-3p, miR-29a-3p, miR-29b-2-5p, miR-301a-5p, miR-376b-5p , MiR-146a-3p, miR-216a-5p, miR-363-5p, miR-367-5p, miR-504-5p, miR-122-5p, miR-196a-5p, miR-335-3p, miR -1251-5p, miR-125b-2-3p, miR-93-3p, miR-143-3p and the like can be mentioned.
  • At least one biomarker (BM2) selected from the group can be utilized as a biomarker for brain tumors, preferably including gliomas and meningiomas.
  • BM2 consists of miR-151a-5p, miR-151b, miR-4428, miR-4482-5p, miR-4538, miR-4638-3p, miR-4768-3p, miR-5095, and miR-6070.
  • At least one biomarker (BM2A) selected from the group is a target biomarker whose amount in brain tumor specimens tends to be higher than in healthy specimens.
  • At least one biomarker (BM2B) selected from the group consisting of and miR-646 is a target biomarker whose amount in a brain tumor sample tends to be lower than that in a healthy sample.
  • miR-6070, miR-450a-2-3p, miR-4638-3p, miR-20a-3p, etc. are preferable from the viewpoint of higher diagnosis rate at the time of judgment.
  • miR-450a-2-3p, miR-4638-3p, miR-193a-3p, miR-4428, miR-578, miR-4538, miR are preferable from the viewpoint of higher sensitivity at the time of judgment.
  • miR-151b, miR-6070, miR-151a-5p, miR-20a-3p, miR-21-3p, miR-4482-5p are preferable from the viewpoint of higher specificity at the time of judgment.
  • Examples thereof include miR-146a-5p, miR-646, miR-371a-3p, miR-4638-3p, and more preferably miR-151b, miR-6070, miR-151a-5p. , MiR-20a-3p, miR-21-3p, etc.
  • the base sequence of the target biomarker can be specified in a known database (for example, miRBase: http://www.mirbase.org/).
  • the number of target biomarkers in step (1) may be only one, but two or more, three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more. , 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, 21 or more, 22 Species or more, 23 species or more, 24 species or more, 25 species or more, 26 species or more, 27 species or more, 28 species or more, 29 species or more, 30 species or more, 31 species or more, 32 species or more, 33 species or more, 34 species or more , 35 or more, 36 or more, 37 or more, 38 or more, 39 or more, 40 or more, 41 or more, 42 or more, 43 or more, 44 or more, 45 or more, 46 or more, 47 Species or more, 48 species or more, 49 species or more, 50 species or more, 51 species or more, 52 species or more, 53 species or more, 54 species or
  • BM1 is 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more. , 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 Species or more, 25 or more, 26 or more, 27 or more, 28 or more, 29 or more, 30 or more, 31 or more, 32 or more, 33 or more, 34 or more, 35 or more, 36 or more , 37 or more, 38 or more, 39 or more, 40 or more, 41 or more, 42 or more, 43 or more, or 44, and / or BM2 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16
  • Detection is usually performed by measuring the amount or concentration of the target biomarker.
  • concentration is not limited to the absolute concentration, but may be a relative concentration, a weight per unit volume, or raw data measured to know the absolute concentration.
  • the method for detecting the target biomarker is not particularly limited as long as it can specifically detect a part or all of the target biomarker.
  • Specific examples of the detection method include RNA-seq analysis method, RT-PCR method, nucleic acid chip analysis method, Northern blotting method and the like.
  • RNA-seq analysis method When using the RNA-seq analysis method, specifically, cDNA is prepared from RNA derived from a subject according to a conventional method, sequence analysis is performed using a next-generation sequencer, etc., and based on the obtained data. Examples thereof include a method of obtaining expression level information by performing mapping, gene expression analysis, expression level analysis, and the like.
  • cDNA is prepared from RNA derived from a subject according to a conventional method, and a pair of primers (the above-mentioned cDNA (-) so that the target region can be amplified using this as a template.
  • a method of hybridizing a normal strand that binds to a strand) and a reverse strand that binds to a + strand) and performing a PCR method according to a conventional method to detect the obtained amplified double-stranded DNA can be exemplified. ..
  • the amplified double-stranded DNA was detected by a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the above PCR using a primer labeled with RI or a fluorescent substance in advance.
  • a method of transferring double-stranded DNA to a nylon membrane or the like according to a conventional method and hybridizing it with a labeled probe for detection can be used.
  • nucleic acid chip analysis When using nucleic acid chip analysis, prepare a nucleic acid chip to which a nucleic acid probe (single-stranded or double-stranded) is attached, and hybridize it with RNA derived from a subject or a nucleic acid prepared from the RNA by a conventional method. Examples thereof include a method of soaking and detecting the formed double strand.
  • the probe When using the Northern blot method, specifically, the probe is labeled with a radioisotope (32P, 33P, etc .: RI) or a fluorescent substance, and the probe is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method. After hybridizing with the derived mRNA, the double strand of the formed diagnostic agent and the mRNA derived from the subject's sample is signaled from the probe label (labeled substance such as RI or fluorescent substance).
  • a radiation detector, a fluorescence detector, or the like can be exemplified.
  • the inspection method of the present invention including the step (1), it is possible to provide the amount and / or concentration of the target biomarker which is a detection index of the brain tumor, thereby assisting the detection of the brain tumor and the like.
  • test results by the test method of the present invention including step (1) can be used for determining the therapeutic effect, elucidating the pathophysiology of brain tumors, predicting the prognosis of brain tumors, stratifying patients, selecting treatment methods (individualized medicine, treatment responsiveness), etc. Can be used.
  • the test method of the present invention further determines whether or not the subject has a brain tumor based on (2) the amount or concentration of the biomarker detected in the step (1). Including the process of According to the inspection method of the present invention including the step 2, it is possible to determine a brain tumor.
  • step (2) is: (2a) A step of determining that the subject has a brain tumor when the amount or concentration of the BM1A and / or the BM2A detected in the step (1) is above the cutoff value. Is preferably included.
  • step (2) is (2b) A step of determining that the subject has a brain tumor when the amount or concentration of the BM1B and / or BM2B detected in the step (1) is equal to or less than the cutoff value. Is preferably included.
  • step (2) (2c)
  • the amount or concentration of the BM1A and / or BM2A detected in the step (1) is equal to or higher than the cutoff value, and the amount or concentration of the BM1B and / or BM2B detected in the step (1).
  • the cutoff value can be appropriately set by those skilled in the art from the viewpoints of sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, etc., for example, a subject in a body fluid collected from a subject not suffering from a brain tumor. Based on the amount and / or concentration of the biomarker, it can be a predetermined value or a predetermined value each time.
  • the cutoff value is, for example, 0.7 of the amount and / or concentration of the target biomarker (mean, median, etc. when there are multiple subjects) in body fluids collected from a subject who does not have a brain tumor. The value can be up to 1.5 times.
  • the determination can be made by a method using a discriminant.
  • the discriminant is an arbitrary discriminant analysis method that can create a discriminant that distinguishes between a malignant brain tumor and a healthy one, such as Fisher's discriminant analysis, Mahalanobis distance non-linear discriminant analysis, neural network, Support Vector Machine (SVM). ) Etc., but is not limited to these specific examples.
  • step (2) it is also possible to make a judgment using a method such as a neural network, k-nearest neighbor method, decision tree, or logistic regression analysis.
  • a method such as a neural network, k-nearest neighbor method, decision tree, or logistic regression analysis.
  • the therapeutic effect can be determined by setting the cutoff value to, for example, a value based on the amount and / or concentration of the target biomarker in the past sample for the same sample.
  • test method of the present invention If it is determined by the test method of the present invention that includes the step (2) of diagnosing the brain tumor with higher accuracy, the test method of the present invention is further diagnosed by a doctor of the brain tumor. By combining the applied steps, brain tumors can be diagnosed with higher accuracy. In addition, since the test method of the present invention can detect a brain tumor more accurately, by combining the above steps with the test method of the present invention, it is possible to more efficiently and more accurately diagnose "affected by a brain tumor".
  • the accuracy of the test method of the present invention is further increased or the above-mentioned "2. Higher accuracy of the brain tumor”. If it is diagnosed as having a brain tumor as described in "Diagnosis in”, the combination of the test method of the present invention and the step of applying the diagnosis by a doctor is further applied to (3) Having a brain tumor. By performing the step of treating the disease on the subject determined or diagnosed as having, the disease of the subject can be treated.
  • step 3 is combined with the test method of the present invention or with respect to a combination of the test method of the present invention and a step of applying a diagnosis by a doctor.
  • the subject suffering from the brain tumor can be treated more efficiently and more reliably.
  • the treatment method for brain tumors is not particularly limited, and examples thereof include medication treatment, surgical treatment, and radiation therapy.
  • the treatment method can be used alone or in combination of two or more.
  • the drug used for the medication treatment is not particularly limited, and examples thereof include a biopharmacy (biopharmacy), a non-steroidal anti-inflammatory drug, and a steroid (adrenocortical steroid).
  • the medicine may be used alone, in combination of two, or in combination of three or more.
  • the present invention in one embodiment, comprises a brain tumor test agent (hereinafter, also referred to as “the test agent of the present invention”) containing a detection agent for a target biomarker (the present specification). In the above, it may be referred to as “the test agent of the present invention”). This will be described below.
  • the target biomarkers, brain tumors, etc. are the same as the definitions in "1. Brain tumor inspection method" above.
  • the detection agent of the present invention is not particularly limited as long as it can specifically detect the target biomarker.
  • Examples of the detection agent include primers and probes for the target biomarker.
  • the detection agent of the present invention may be modified as long as its function is not significantly impaired. Modifications include, for example, the addition of labels such as fluorescent dyes, enzymes, proteins, radioisotopes, chemical luminescent materials, biotin and the like.
  • fluorescent dye used in the present invention those generally labeled with nucleotides and used for detection and quantification of nucleic acid can be preferably used, for example, HEX (4,7,2', 4', 5', 7). '-hexachloro-6-carboxylfluorescein, green fluorescent dye), fluorescein (fluorescein), NED (trade name, Applied Biosystems, yellow fluorescent dye), or 6-FAM (trade name, Applied Biosystems, yellow) Green fluorescent dyes), rhodamin or derivatives thereof [eg, tetramethylrhodamine (TMR)], but are not limited thereto.
  • TMR tetramethylrhodamine
  • any of the known labeling methods can be used [see Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)].
  • Commercially available fluorescent labeling kits can also be used (eg, Amersham Pharmacia, Oligonucleotide ECL 3'-Oligo Labeling System, etc.).
  • the detection agent of the present invention can also be used by immobilizing it on an arbitrary solid phase. Therefore, the test agent of the present invention can be provided in the form of a substrate on which a detection agent is immobilized (for example, a microarray chip on which a probe is immobilized).
  • the solid phase used for immobilization is not particularly limited as long as it can immobilize a polynucleotide or the like, and examples thereof include a glass plate, a nylon membrane, microbeads, a silicon chip, a capillary or another substrate. Can be done.
  • Fixation of the detection agent on the solid phase is not particularly limited.
  • the fixation method is well known in the art depending on the type of fixation probe, for example, in the case of a microarray, a commercially available spotter (manufactured by Amersham) is used [for example, photolithographic technology (Affymetrix), Insitu synthesis of oligonucleotides by inkjet technology (Rosetta Inpharmatics)].
  • the primer, probe, etc. are not particularly limited as long as they selectively (specifically) recognize the target biomarker and the nucleic acid derived from the target biomarker.
  • “selectively (specifically) recognizing” means that, for example, in the Northern blotting method, the target biomarker can be specifically detected, and in the RT-PCR method, the target biomarker or a nucleic acid derived from the target biomarker. It means that (cDNA, etc.) is specifically amplified, but is not limited to this, as long as it can be determined by a person skilled in the art that the detected substance or amplified substance is derived from the target biomarker. Good.
  • primers and probes include the polynucleotide described in (a) below and the polynucleotide described in (b) below: (A) A polynucleotide having at least 15 consecutive bases in the base sequence of the target biomarker and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide, and (b) a base sequence of the target biomarker or a base sequence complementary thereto Included are at least one selected from the group consisting of polynucleotides having at least 15 bases that hybridize under stringent conditions.
  • a complementary polynucleotide or a complementary base sequence is a full-length sequence of a polynucleotide consisting of the base sequence of a target biomarker, or a base sequence having a length of at least 15 consecutive bases in the base sequence.
  • a polynucleotide or base that is basically complementary to its partial sequence here, for convenience, these are also referred to as "regular chains" based on the base pair relationship such as A: T and G: C. It means an array.
  • such a complementary strand is not limited to the case where it completely forms a complementary sequence with the base sequence of the target positive strand, and has a complementary relationship to the extent that it can hybridize with the target positive strand under stringent conditions. It may have.
  • the stringent condition here is to combine the complex or probe as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. For example, as cleaning conditions after hybridization, conditions of about "1 x SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand maintains a hybridized state with the positive strand of interest even when washed under such conditions.
  • cleaning conditions of "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C” are listed as stricter hybridization conditions, and "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C” are listed as stricter hybridization conditions.
  • a complementary strand a strand consisting of a base sequence having a completely complementary relationship with the base sequence of the positive chain of interest, and at least 90%, preferably 95%, more preferably of the strand.
  • a chain consisting of a base sequence having 98% or more, more preferably 99% or more of identity can be exemplified.
  • Primers, probes, etc. can be designed using, for example, various design programs based on the base sequence of the target biomarker. Specifically, a candidate sequence of a primer or probe obtained by subjecting the base sequence of the target biomarker to a design program, or a sequence containing at least the sequence in a part thereof can be used as the primer or probe.
  • the base length of the primer, probe, etc. is not particularly limited as long as it has a continuous length of at least 15 bases as described above, and can be appropriately set according to the application.
  • As the base length for example, when used as a primer, for example, 15 bases to 35 bases can be exemplified, and when used as a probe, for example, 15 bases to 35 bases can be exemplified.
  • the test agent of the present invention may contain other detection agents (for example, probes for detecting nucleic acids such as other miRNAs, antibodies, etc.) other than the detection agents of the present invention.
  • the test agent of the present invention may be a test agent capable of examining other diseases and conditions in addition to the brain tumor.
  • the detection agent of the present invention is included as a detection agent for brain tumor examination. From this point of view, the test agent of the present invention is, in one aspect, a brain tumor test agent containing a brain tumor test detector comprising the detection agent of the present invention.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a composition.
  • the composition may contain other components, if necessary.
  • Other ingredients include, for example, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, moisturizers, colorants, fragrances. , Chelating agent and the like.
  • the test agent of the present invention may be in the form of a kit.
  • the kit may contain one that can be used for detecting the target biomarker in the body fluid of the subject.
  • Specific examples of such products include various reagents (for example, buffer solutions), instruments (for example, instruments for purifying and separating body fluids), and the like.
  • the present invention relates to a method for screening an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for a brain tumor (hereinafter, may be referred to as “the active ingredient screening method of the present invention”). This will be described below.
  • the measurement of the amount or concentration of the body fluid-derived sample, the target biomarker, the brain tumor, and the target biomarker is the same as the definition in "1. Brain tumor inspection method" above.
  • Animal species are not particularly limited. Examples of animal species include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits. A brain tumor model animal can be preferably used.
  • test substance it can be widely used regardless of whether it is a naturally occurring compound or an artificially produced compound. Further, not only the purified compound but also a composition in which various compounds are mixed and an extract of animals and plants can be used.
  • Compounds include not only low molecular weight compounds but also high molecular weight compounds such as proteins, nucleic acids and polysaccharides.
  • the biomarker used as an index is BM1A and / or BM2A
  • the value of the above index was collected from an animal not treated with the test substance.
  • the test substance is used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for brain tumor (or a candidate substance for an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for brain tumor). Includes steps to select.
  • the biomarker used as an index is BM1B and / or BM2B
  • the value of the above index was collected from an animal not treated with the test substance.
  • the test substance is used as an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for brain tumor (or a candidate substance for an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for brain tumor). Includes steps to select.
  • the corresponding biomarker means the same miRNA as the target biomarker used as an index.
  • High means, for example, that the index value is twice, five times, ten times, 20 times, 50 times, or 100 times the control value.
  • Low means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 of the control value.
  • the amount or concentration of a target biomarker in a body fluid-derived sample collected from an animal treated with a test substance is used as an index for a brain tumor.
  • the present invention relates to a method for evaluating inducible or exacerbation (sometimes referred to as “the method for evaluating toxicity of the present invention” in the present specification). This will be described below.
  • target biomarkers For body fluid-derived samples, target biomarkers, brain tumors, measurement of the amount or concentration of target biomarkers, animal species, test substances, etc., refer to "1. Brain tumor inspection method” and “5. Prevention or treatment of brain tumors”. It is the same as the definition in "Method of screening the active ingredient of the drug”.
  • the value of the above index is a body fluid collected from an animal not treated with the test substance. Including a step of determining that the test substance is inducing or exacerbating a brain tumor when it is higher than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in.
  • the value of the above index is a body fluid collected from an animal not treated with the test substance. Including a step of determining that the test substance is inducing or exacerbating a brain tumor when it is lower than the amount or concentration (control value) of the corresponding biomarker in.
  • the corresponding biomarker means the same miRNA as the target biomarker used as an index.
  • High means, for example, that the index value is twice, five times, ten times, 20 times, 50 times, or 100 times the control value.
  • Low means, for example, that the index value is 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100 of the control value.
  • Test example 1 Search for brain tumor biomarkers and determination of brain tumors 1
  • MiRNAs were extracted from 62 urine samples from glioma patients and 100 urine samples from healthy subjects. The miRNA extraction was performed using a previously developed nanoscale rod (nanowire). This method is described in International Publication No. 2015/137427. It has been confirmed that this method captures extracellular endoplasmic reticulum in urine more efficiently than the conventional method.
  • Microarray analysis Toray Co., Ltd., miRNA Oligo chip, 3D-Gene (registered trademark) was performed, and the expression level was 1.5 times or more different in glioma patients and statistically significant difference (compared to healthy subjects).
  • Human miRNAs hsa-miR
  • p-value of less than 0.05 were selected by Wilcoxon's rank sum test.
  • hsa-miRs selected first, 44 types of hsa-miRs showing the same expression behavior as mmu-miR were found in hsa-miRs whose preservation was confirmed in humans and mice. Glioma was determined using these 44 types of hsa-miR. The judgment targets were 62 urine samples of the above-mentioned glioma patients and 100 urine samples of healthy subjects.
  • hsa-miR-122-5p hsa-miR-124-3p, hsa-miR-1251-5p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-144-5p, hsa-miR-146a-3p, hsa-miR-148a-5p, hsa-miR-181b-2-3p, hsa-miR-188-3p, hsa-miR-196a-5p, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-202-5p, hsa-miR-204-3p, hsa-miR-208a-5p, hsa-miR-20b-3p, hsa-miR
  • the expression level (mean expression level) of 3p, hsa-miR-509-5p, and glioma patients was lower than the expression level (mean expression level) of healthy subjects.
  • miRNAs were used alone or in combination to create a formula for determining the presence or absence of glioma by logistic regression analysis.
  • the data was normalized by the global normalization method, and the normalized data was used as it was.
  • Table 1 shows the sensitivity, specificity, and AUC of glioma determination using the prepared determination formula.
  • the cutoff value was set in Youden index.
  • Test example 2 Search for brain tumor biomarkers and brain tumor determination 2
  • the miRNA expression level was analyzed in the same manner as in Test Example 1 for 110 urine samples of brain tumor patients (including both glioma patients and meningeal species patients) and 100 urine samples of healthy subjects, and biomarkers were used. Was searched and judged.
  • data normalization was performed by the global normalization method, and after data normalization, all 0 values were set to 1, log conversion (base 2) was performed, and values of 3 or less were truncated to 0.
  • the judgment formula was created after narrowing down the miRNA by L1 regularization, and then cross validation was also performed to confirm the judgment formula. The judgment formula of this test example is shown below.
  • hsa-miR-146a-5p The 18 types of hsa-miR used for the judgment are described below.
  • hsa-miR-146a-5p The 18 types of hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR- 371a-3p, hsa-miR-4428, hsa-miR-4482-5p, hsa-miR-450a-2-3p, hsa-miR-4538, hsa-miR-4638-3p, hsa-miR-4768-3p, hsa-miR-492, hsa-miR-5095, hsa-
  • hsa-miR-151a-5p hsa-miR-151b
  • hsa-miR-4428 hsa-miR-4482-5p
  • hsa-miR-4538 hsa-miR-4638-3p
  • hsa-miR-146a-5p hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR-371a-3p, hsa-miR-450a-2-
  • the expression levels (mean expression levels) of 3p, hsa-miR-492, hsa-miR-578, and hsa-miR-646 in brain tumor patients were lower than those in healthy subjects (mean expression levels). ..
  • Table 2 shows the sensitivity, specificity, and diagnosis rate for determining brain tumors.

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Abstract

脳腫瘍の新規バイオマーカー及びその利用方法を提供すること。　脳腫瘍を検査する方法であって、特定のmiRNAをバイオマーカーとして検出 する工程、を含む、検査方法。

Description

脳腫瘍を検査する方法
　本発明は、脳腫瘍を検査する方法等に関する。
　脳腫瘍は、頭蓋骨の中にできる腫瘍の総称であり、原発性脳腫瘍と転移性脳腫瘍の2つに分けられる。通常、脳腫瘍は、頭痛、嘔吐、麻痺、失語・構音障害、意識障害などの自覚症状を訴える患者や軽微な頭部外傷の画像検査、脳ドックのような健康診断における画像検査などにより発見される。画像診断では、CT、MRI、脳血管造影などが利用される。
画像診断によって脳腫瘍が発見された場合には、開頭手術により腫瘍を摘出し、摘出した組織を用いて、病理診断を行う。現時点では悪性脳腫瘍を血液中のマーカーで発見するための腫瘍マーカーは、臨床現場において普及していない。
　マイクロRNAは20-25塩基で構成される生体内小分子であり、疾患発症を予測するバイオマーカーとして有望視されている。特許文献１では、低侵襲に採取できる血液から悪性脳腫瘍のバイオマーカーに使用可能な複数のmiRNAが報告されている。
国際公開第2017/171039号
　本発明は、脳腫瘍の新規バイオマーカー及びその利用方法を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、被検体から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種をバイオマーカーとして脳腫瘍を検査できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　脳腫瘍を検査する方法であって、
（1）被検体から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、
を含む、検査方法。
　項２．　（2）前記工程（1）で検出された前記バイオマーカーの量又は濃度に基づいて、前記被検体が脳腫瘍に罹患しているか否かを判定する工程、
を含む、項１に記載の検査方法。
　項３．　前記バイオマーカーがmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、及びmiR-509-5pからなる群より選択される少なくとも1種である、項１又は２に記載の検査方法。
　項４．　前記バイオマーカーがmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、及びmiR-483-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、項１～３のいずれかに記載の検査方法。
　項５．　前記バイオマーカーが3種以上である、項３又は４に記載の検査方法。
　項６．　前記脳腫瘍が神経膠腫である、項３～５のいずれかに記載の検査方法。
　項７．　前記バイオマーカーがmiR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、項１又は２に記載の検査方法。
　項８．　前記バイオマーカーがmiR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、及びmiR-20a-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、項１、２及び７のいずれかに記載の検査方法。
　項９．　前記バイオマーカーが3種以上である、項７又は８に記載の検査方法。
　項１０．　前記体液が尿である、項１～９のいずれかに記載の検査方法。
　項１１．　前記体液試料が尿の細胞外小胞である、項１～１０のいずれかに記載の検査方法。
　項１２．　前記被検体がヒトである、項１～１１のいずれかに記載の検査方法。
　項１３．　miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、脳腫瘍の検査薬。
　項１４．　miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、脳腫瘍の検査キット。
　項１５．　被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
　項１６．　被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の誘発性又は増悪性の評価方法。
　本発明によれば、脳腫瘍のバイオマーカーを提供することができる。該バイオマーカーを利用することにより、脳腫瘍の検査、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング、脳腫瘍の誘発性又は増悪性の評価等が可能になり得る。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　1．脳腫瘍の検査方法
　本発明は、その一態様において、脳腫瘍を検査する方法であって、（1）被検体から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、を含む、検査方法（本明細書において、「本発明の検査方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　1-1．工程（1）
　検査対象である脳腫瘍の種類は、特に制限されない。脳腫瘍としては、例えば神経膠腫、髄膜腫、中枢神経系原発悪性リンパ腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫等が挙げられる。これらの中でも、本発明の検査方法の対象として、好適には、神経膠腫、髄膜腫等が挙げられる。脳腫瘍の各種分類基準における全てのクラス、グレード、ステージの脳腫瘍が検査対象となる。
　被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
　被検体の状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば脳腫瘍に罹患しているかどうか不明な検体、脳腫瘍に罹患していると既に別の方法により判定されている検体、脳腫瘍に罹患していないと既に別の方法により判定されている検体、脳腫瘍の治療中の検体等が挙げられる。
　体液は、特に制限されない。体液としては、例えば尿、全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁などが挙げられ、好ましくは尿が挙げられる。
　体液由来試料は、体液そのものであってもよいし、体液に何らからの操作（分離、精製、薬剤添加等）をして得られた試料であってもよい。体液由来試料としては、体液の細胞外小胞が好ましい、尿の細胞外小胞が特に好ましい。体液由来試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　細胞外小胞は、細胞から分泌、放出等される膜小胞である限り特に制限されない。細胞外小胞は、通常は、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている膜小胞として定義される。細胞外小胞としては、例えばエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体、エクトソーム、マイクロパーティクル、分泌マイクロベシクル等が挙げられる。これらの中でもエクソソームが好ましい。
　細胞外小胞は、尿から、公知の方法に従って又は準じて、精製、分離、濃縮等することができる。細胞外小胞を精製、分離、濃縮等する方法としては、例えばナノワイヤを利用した方法、超遠心法（例えばペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等）、イムノアフィニティー担体を用いる方法、ゲルろ過法、フィールド・フロー分画法、FACS法等が挙げられる。また、細胞外小胞の精製、分離、濃縮等は、市販のキットを用いて行うことも可能である。これらの中でも、尿中細胞外小胞体を効率よく捕捉することができるという観点から、ナノワイヤを利用した方法が特に好ましい。ナノワイヤを利用した方法については、例えば、国際公開第2015／137427号に記載されている。これらの方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
　工程（1）の検出対象は、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（本明細書において、これらをまとめて「対象バイオマーカー」と示すこともある。）である。
　対象バイオマーカーは、脳腫瘍において発現量が変化しているバイオマーカーであり、これを指標とすることにより脳腫瘍を鑑別可能である。
　対象バイオマーカー中、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、及びmiR-509-5pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1）は、好ましくは神経膠腫のバイオマーカーとして利用することができる。
　BM1の中でも、miR-122-5p、miR-124-3p、miR-1251-5p、miR-125b-2-3p、miR-140-3p、miR-143-3p、miR-144-5p、miR-146a-3p、miR-148a-5p、miR-181b-2-3p、miR-188-3p、miR-196a-5p、miR-202-5p、miR-204-3p、miR-20b-3p、miR-216a-5p、miR-224-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-296-3p、miR-29a-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-32-3p、miR-335-3p、miR-338-5p、miR-363-5p、miR-367-5p、miR-374b-5p、miR-376b-5p、miR-411-3p、miR-504-5p、miR-539-5p、miR-541-3p、miR-598-5p、miR-93-3p、及びmiR-99a-5pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1A）は、脳腫瘍検体における量が健常検体における量よりも高い傾向にある対象バイオマーカーである。
　BM1の中でも、miR-199a-5p、miR-208a-5p、miR-30c-2-3p、miR-328-5p、miR-345-3p、miR-483-3p、及びmiR-509-5pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM1B）は、脳腫瘍検体における量が健常検体における量よりも低い傾向にある対象バイオマーカーである。
　BM1の中でも、判定時のAUC（Area Under the Curve）がより高いという観点から、好ましくはmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p等が挙げられ、より好ましくはmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p等が挙げられる。
　BM1の中でも、判定時の感度がより高いという観点から、好ましくはmiR-509-5p、miR-208a-5p、miR-345-3p、miR-30c-2-3p、miR-199a-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-188-3p、miR-328-5p、miR-504-5p、miR-224-3p等が挙げられ、より好ましくはmiR-509-5p、miR-208a-5p、miR-345-3p、miR-30c-2-3p、miR-199a-5p等が挙げられる。
　BM1の中でも、判定時の特異度がより高いという観点から、好ましくはmiR-140-3p、miR-144-5p、miR-148a-5p、miR-202-5p、miR-20b-3p、miR-539-5p、miR-99a-5p、miR-181b-2-3p、miR-29a-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-376b-5p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-363-5p、miR-367-5p、miR-504-5p、miR-122-5p、miR-196a-5p、miR-335-3p、miR-1251-5p、miR-125b-2-3p、miR-93-3p、miR-143-3p、miR-188-3p、miR-541-3p、miR-124-3p、miR-338-5p、miR-374b-5p、miR-296-3p、miR-411-3p、miR-26a-1-3p等が挙げられ、より好ましくはmiR-140-3p、miR-144-5p、miR-148a-5p、miR-202-5p、miR-20b-3p、miR-539-5p、miR-99a-5p、miR-181b-2-3p、miR-29a-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-376b-5p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-363-5p、miR-367-5p、miR-504-5p、miR-122-5p、miR-196a-5p、miR-335-3p、miR-1251-5p、miR-125b-2-3p、miR-93-3p、miR-143-3p等が挙げられる。
　対象バイオマーカー中、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM2）は、好ましくは神経膠腫及び髄膜腫を含む脳腫瘍のバイオマーカーとして利用することができる。
　BM2の中でも、miR-151a-5p、miR-151b、miR-4428、miR-4482-5p、miR-4538、miR-4638-3p、miR-4768-3p、miR-5095、及びmiR-6070からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM2A）は、脳腫瘍検体における量が健常検体における量よりも高い傾向にある対象バイオマーカーである。
　BM2の中でも、miR-146a-5p、miR-193a-3p、miR-20a-3p、miR-21-3p、miR-371a-3p、miR-450a-2-3p、miR-492、miR-578、及びmiR-646からなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカー（BM2B）は、脳腫瘍検体における量が健常検体における量よりも低い傾向にある対象バイオマーカーである。
　BM2の中でも、判定時の診断率がより高いという観点から、好ましくはmiR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p等が挙げられる。
　BM2の中でも、判定時の感度がより高いという観点から、好ましくはmiR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-193a-3p、miR-4428、miR-578、miR-4538、miR-646、miR-5095、miR-371a-3p等が挙げられ、より好ましくはmiR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-193a-3p、miR-4428等が挙げられる。
　BM2の中でも、判定時の特異度がより高いという観点から、好ましくはmiR-151b、miR-6070、miR-151a-5p、miR-20a-3p、miR-21-3p、miR-4482-5p、miR-146a-5p、miR-646、miR-371a-3p、miR-4638-3p等が挙げられ、より好ましくはmiR-151b、miR-6070、miR-151a-5p
、miR-20a-3p、miR-21-3p等が挙げられる。
　対象バイオマーカーは、公知のデータベース（例えば、miRBase：http://www.mirbase.org/）でその塩基配列等を特定することができる。
　工程（1）における対象バイオマーカーの数は、1種のみでもよいが、2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、21種以上、22種以上、23種以上、24種以上、25種以上、26種以上、27種以上、28種以上、29種以上、30種以上、31種以上、32種以上、33種以上、34種以上、35種以上、36種以上、37種以上、38種以上、39種以上、40種以上、41種以上、42種以上、43種以上、44種以上、45種以上、46種以上、47種以上、48種以上、49種以上、50種以上、51種以上、52種以上、53種以上、54種以上、55種以上、56種以上、57種以上、58種以上、59種以上、60種以上、61種以上、又は62種であることができる。より多くの対象バイオマーカーを組み合わせることにより、脳腫瘍の検査等を、より正確に行うことが可能になる。
　本発明の好ましい一態様においては、BM1の2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、18種以上、19種以上、20種以上、21種以上、22種以上、23種以上、24種以上、25種以上、26種以上、27種以上、28種以上、29種以上、30種以上、31種以上、32種以上、33種以上、34種以上、35種以上、36種以上、37種以上、38種以上、39種以上、40種以上、41種以上、42種以上、43種以上、若しくは44種、及び／又はBM2の2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上、11種以上、12種以上、13種以上、14種以上、15種以上、16種以上、17種以上、若しくは18種を対象バイオマーカーとすることができる。
　検出は、通常は、対象バイオマーカーの量又は濃度を測定することによって行われる。「濃度」とは、絶対濃度に限らず、相対濃度や、単位体積辺りの重量や、絶対濃度を知るために測定した生データなどでもよい。
　対象バイオマーカーを検出する方法としては、対象バイオマーカーの一部又は全部を特異的に検出できる方法であれば特に制限されない。検出方法としては、具体的には、例えば、RNA-seq解析法、RT-PCR法、核酸チップ解析法、ノーザンブロット法等を挙げることができる。
　RNA-seq解析法を利用する場合は、具体的には、被検体由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、次世代シークエンサー等を用いてシークエンス解析を行い、得られたデータに基づいてマッピング、遺伝子発現解析、発現量解析等を行い、発現量情報を得る方法が挙げられる。
　RT-PCR法を利用する場合は、具体的には、被検体由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的領域が増幅できるように、一対のプライマー（上記cDNA（－鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識プローブを使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。
　核酸チップ解析を利用する場合は、核酸プローブ（1本鎖又は2本鎖）を貼り付けた核酸チップを用意し、これに被検体由来のRNAまたは該RNAから常法によって調製された核酸とハイブリダイズさせて、形成された二本鎖を検出する方法を挙げることができる。
　ノーザンブロット法を利用する場合は、具体的には、プローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした上記発現系由来のmRNAとハイブリダイズさせた後、形成された診断薬と被検者の試料由来のmRNAとの二重鎖を、プローブの標識物（RI若しくは蛍光物質などの標識物質）に由来するシグナルを放射線検出器又は蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法によれば、脳腫瘍の検出指標である対象バイオマーカーの量及び／又は濃度を提供することができ、これにより脳腫瘍の検出などを補助することができる。
　工程（1）を含む本発明の検査方法による検査結果は、治療効果判定、脳腫瘍の病態解明、脳腫瘍の予後予測、患者層別化、治療方法の選択（個別化医療、治療反応性）等に利用し得る。
　1-2．工程（2）
　本発明の検査方法は、一態様として、さらに、（2）前記工程（1）で検出された前記バイオマーカーの量又は濃度に基づいて、前記被検体が脳腫瘍に罹患しているか否かを判定する工程、を含む。該工程2を含む本発明の検査方法によれば、脳腫瘍を判定することが可能となる。
　検出したバイオマーカーがBM1A及び／又はBM2A含む場合、工程（2）は、
（2a）前記工程（1）で検出された前記BM1A及び／又はBM2Aの量又は濃度がカットオフ値上である場合に、前記被検体が脳腫瘍に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。
　検出したバイオマーカーがBM1B及び／又はBM2Bを含む場合、工程（2）は、
（2b）前記工程（1）で検出された前記BM1B及び／又はBM2Bの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が脳腫瘍に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。
　検出したバイオマーカーがBM1A及び／又はBM2A、並びにBM1B及び／又はBM2Bを含む場合、工程（2）は、
（2c）前記工程（1）で検出された前記BM1A及び／又はBM2Aの量又は濃度がカットオフ値以上であり、且つ前記工程（1）で検出された前記BM1B及び／又はBM2Bの量又は濃度がカットオフ値以下である場合に、前記被検体が脳腫瘍に罹患していると判定する工程、
を含むことが好ましい。
　カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、脳腫瘍に罹患していない被検体から採取された体液における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいて、その都度定められた値、或いは予め定められた値とすることができる。カットオフ値は、例えば、脳腫瘍に罹患していない被検体から採取された体液における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度（被検体が複数の場合は、平均値、中央値など）の、例えば0.7～1.5倍の値とすることができる。
　また、工程（2）においては、判別式を用いた方法で判定することもできる。判別式は、悪性脳腫瘍と健常とを区別的に判別する判別式を作成することができる任意の判別分析法、例えばフィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ニューラルネットワーク、Support Vector Machine（SVM）などを用いて作成できるが、これらの具体例に限定されない。
　さらに、工程（2）において、例えばニューラルネットワーク、k-近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を利用して判定することもできる。
　工程（2）の好ましい一態様においては、被検体が脳腫瘍の治療中の検体である場合、
カットオフ値を、例えば同一検体についての過去の試料における対象バイオマーカーの量及び／又は濃度に基づいた値とすることにより、治療効果を判定することができる。
　2．脳腫瘍のより高い精度での診断
　工程（2）を含む本発明の検査方法により、被検体が脳腫瘍に罹患していると判定された場合、本発明の検査方法に、さらに脳腫瘍の医師による診断を適用する工程を組み合わせることによって、より高い精度で脳腫瘍を診断することができる。また、本発明の検査方法はより正確に脳腫瘍を検出できるので、本発明の検査方法に上記工程を組み合わせることによって、より効率的且つより正確に「脳腫瘍に罹患している」と診断できる。
　3．脳腫瘍の治療
　工程（2）を含む本発明の検査方法により被検体が脳腫瘍に罹患していると判定された場合は本発明の検査方法に対してさらに、或いは上記「2．脳腫瘍のより高い精度での診断」に記載の様に脳腫瘍に罹患していると診断された場合は本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対してさらに、（3）脳腫瘍に罹患していると判定又は診断された被検体に対して、該疾患の治療を行う工程を行うことによって、被検体の該疾患を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより正確に脳腫瘍を検出できるので、本発明の検査方法に対して、或いは本発明の検査方法と医師による診断を適用する工程との組合せに対して工程3を組み合わせることによって、脳腫瘍に罹患している被検体をより効率的に、より確実に治療できる。
　脳腫瘍の治療方法としては、特に制限されないが、例えば投薬治療、外科治療、放射線治療等が挙げられる。治療方法は1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。投薬治療に用いる医薬としては、特に制限されないが、例えば生物学的製剤（バイオ医薬品）、非ステロイド性抗炎症薬、ステロイド（副腎皮質ステロイド）等が挙げられる。医薬は、1種、2種、又は3種以上を組み合わせて用いることができる。
　4．脳腫瘍の検査薬
　本発明は、その一態様において、対象バイオマーカーの検出剤（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）を含む、脳腫瘍の検査薬（本明細書において、「本発明の検査薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　対象バイオマーカー、脳腫瘍等については、上記「1．脳腫瘍の検査方法」における定義と同様である。
　本発明の検出剤は、対象バイオマーカーを特異的に検出できるものである限り特に制限されない。該検出剤としては、例えば対象バイオマーカーに対するプライマー、プローブ等が挙げられる。
　本発明の検出剤は、その機能が著しく損なわれない限りにおいて、修飾が施されていてもよい。修飾としては、例えば、標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の付加が挙げられる。
　本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、こ
れらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
　本発明の検出剤は、任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の検査薬は、検出剤を固定化した基板（例えばプローブを固定化したマイクロアレイチップ等。）の形態として提供することができる。
　固定化に使用される固相は、ポリヌクレオチド等を固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相への検出剤の固定は、特に制限されない。固定方法は、例えばマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
　プライマーやプローブ等は、対象バイオマーカーやそれに由来する核酸等を選択的に（特異的に）認識するものであれば、特に限定されない。ここで、「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、対象バイオマーカーが特異的に検出できること、またRT-PCR法においては対象バイオマーカー若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物が対象バイオマーカーに由来するものであると判断できるものであればよい。
　プライマーやプローブの具体例としては、下記（a）に記載するポリヌクレオチド並びに下記（b）に記載するポリヌクレオチド：
　（a）対象バイオマーカーの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、並びに
　（b）対象バイオマーカーの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
　相補的なポリヌクレオチド又は相補的な塩基配列（相補鎖、逆鎖）とは、対象バイオマーカーの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチド又は塩基配列を意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
　プライマーやプローブ等は、例えば対象バイオマーカーの塩基配列をもとに、例えば各種設計プログラムを利用して設計することができる。具体的には前記対象バイオマーカーの塩基配列を設計プログラムにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
　プライマーやプローブ等の塩基長は、上述のように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであれば特に制限されず、用途に応じて適宜設定することができる。塩基長としては、例えばプライマーとして用いる場合であれば、例えば15塩基～35塩基が例示でき、例えばプローブとして用いる場合であれば、例えば15塩基～35塩基が例示できる。
　本発明の検査薬には、本発明の検出剤以外の、他の検出剤（例えば、他のmiRNA等の核酸を検出するためのプローブや、抗体等）が含まれていてもよい。この場合の本発明の検査薬は、脳腫瘍の他に、他の疾患や状態も検査することができる検査薬であってもよい。この場合、本発明の検出剤は、脳腫瘍検査用の検出剤として含まれている。この観点から、本発明の検査薬は、その一態様において、本発明の検出剤からなる脳腫瘍検査用検出剤を含む、脳腫瘍の検査薬である。
　本発明の検査薬は、組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
　本発明の検査薬は、キットの形態であってもよい。該キットには、上記検出剤或いはこれを含む上記組成物のほかに、被検体の体液における対象バイオマーカーの検出に使用し得るものを含んでいてもよい。このようなものの具体例としては、各種試薬（例えば緩衝液等）、器具（例えば体液の精製、分離用器具）等が挙げられる。
　5．脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料における、対象バイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液由来試料、対象バイオマーカー、脳腫瘍、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定等については、上記「1．脳腫瘍の検査方法」における定義と同様である。
　動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。好適には脳腫瘍モデル動物を使用することができる。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、BM1A及び／又はBM2Aである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分（或いは、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、BM1B及び／又はBM2Bである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分（或いは、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分の候補物質）として選択する工程を含む。
　対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じmiRNAを意味する。
　「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
　6．脳腫瘍の誘発性又は増悪性の評価方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料における、対象バイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の誘発性又は増悪性の評価方法（本明細書において、「本発明の毒性評価方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　体液由来試料、対象バイオマーカー、脳腫瘍、対象バイオマーカーの量又は濃度の測定、動物の生物種、被検物質等については、上記「1．脳腫瘍の検査方法」及び「5．脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法」における定義と同様である。
　本発明の毒性評価方法は、より具体的には、指標とするバイオマーカーが、BM1A及び／又はBM2Aである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも高い場合に、前記被検物質を脳腫瘍の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
　本発明の毒性評価方法は、別の具体例として、指標とするバイオマーカーが、BM1B及び／又はBM2Bである場合、上記指標の値が、被検物質で処理されていない動物から採取された体液における対応バイオマーカーの量又は濃度（対照値）よりも低い場合に、前記被検物質を脳腫瘍の誘発性又は増悪性があると判定する工程を含む。
　対応バイオマーカーとは、指標としている対象バイオマーカーと同じmiRNAを意味する。
　「高い」とは、例えば指標の値が、対照値の2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍であることを意味する。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100であることを意味する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．脳腫瘍バイオマーカーの探索及び脳腫瘍判定1
　神経膠腫患者の尿62検体および健常者の尿100検体から、miRNAを抽出した。miRNA抽出は、以前開発したナノスケールの棒（ナノワイヤ）を用いて行った。この方法については、国際公開第2015／137427号に記載されている。本法は、従来法に比べ尿中細胞外小胞体を効率よく捕捉することが確認されている。マイクロアレイ解析（東レ社製、miRNA Oligo chip、3D-Gene（登録商標））を行い、健常者と比較し、神経膠腫患者において、発現レベルが1.5倍以上異なり、かつ統計学的に有意差（Wilcoxonの順位和検定にてp値0.05未満）が認められるヒトmiRNA (hsa-miR)を選定した。
　miRNAによる標的mRNAの認識は、主にseed配列と呼ばれる5′末端のわずか7～8塩基と標的mRNAの主に3′非翻訳領域の相補的塩基配列との間における塩基対形成によって行われる。このseed配列は一部のmiRNAで異なる種間でも保存されており、そのためseed配列が保存されているmiRNAは種を超えて同様の機能を有すると考えられている。そこで、マイクロアレイ解析（東レ社製、miRNA Oligo chip、3D-Gene（登録商標））を行い、健常マ
ウスに比較し、脳腫瘍モデルマウスにおいて、発現レベルが1.5倍以上異なるマウスmiRNA(mmu-miR)を選定した。最初に選定したhsa-miRのうち、ヒトとマウスで保存性が確認されているhsa-miRで、mmu-miRと同様の発現挙動を示したhsa-miRを44種類認めた。この44種類のhsa-miRを用いて神経膠腫の判定を行なった。判定対象は、上記の神経膠腫患者の尿62検体および健常者の尿100検体とした。
　判定に用いた44種類のhsa-miRを以下に記載する。hsa-miR-122-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-1251-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-148a-5p、hsa-miR-181b-2-3p、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-204-3p、hsa-miR-208a-5p、hsa-miR-20b-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-224-3p、hsa-miR-26a-1-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-2-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-30c-2-3p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-328-5p、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-345-3p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-367-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-376b-5p、hsa-miR-411-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-509-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-541-3p、hsa-miR-598-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-99a-5p。
　なお、これらの内、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-1251-5p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-148a-5p、hsa-miR-181b-2-3p、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-204-3p、hsa-miR-20b-3p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-224-3p、hsa-miR-26a-1-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-2-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-367-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-376b-5p、hsa-miR-411-3p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-541-3p、hsa-miR-598-5p、hsa-miR-93-3p、及びhsa-miR-99a-5pは、神経膠腫患者における発現レベル（発現量平均値）が、健常者における発現レベル（発現量平均値）よりも高かった。
　一方、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-208a-5p、hsa-miR-30c-2-3p、hsa-miR-328-5p、hsa-miR-345-3p、hsa-miR-483-3p、及びhsa-miR-509-5p、神経膠腫患者における発現レベル（発現量平均値）が、健常者における発現レベル（発現量平均値）よりも低かった。
　これらのmiRNAを、単独で又は組み合わせ、ロジスティック回帰解析にて神経膠腫の有無の判定式を作成した。なお、データの正規化はglobal normalization法により行い、正規化後のデータをそのまま使用した。作成された判定式を用いた神経膠腫判定の感度、特異度、及びAUCを表１に示す。なおカットオフ値はYouden indexにて設定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　試験例2．脳腫瘍バイオマーカーの探索及び脳腫瘍判定2
　脳腫瘍患者（神経膠腫患者及び髄膜種患者の両方を含む）の尿110検体および健常者の尿100検体を対象として、試験例1の方法と同様にしてmiRNA発現量を解析し、バイオマーカーの探索及び判定を行った。なお、本試験例では、データの正規化はglobal normalization法により行い、データの正規化後に0の値を全て1とし、log変換（底2）し、3以下の値は0に切り捨てた。また、本試験例では、L1正則化でmiRNAの絞り込みを行ってから判定式を作成し、その後cross validationも行って判定式の確認をした。本試験例の判定式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　判定に用いた18種類のhsa-miRを以下に記載する。hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-20a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-4428、hsa-miR-4482-5p、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-4538、hsa-miR-4638-3p、hsa-miR-4768-3p、hsa-miR-492、hsa-miR-5095、hsa-miR-578、hsa-miR-6070、hsa-miR-646。
　なお、これらの内、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-151b、hsa-miR-4428、hsa-miR-4482-5p、hsa-miR-4538、hsa-miR-4638-3p、hsa-miR-4768-3p、hsa-miR-5095、及びhsa-miR-6070は、脳腫瘍患者における発現レベル（発現量平均値）が、健常者における発現レベル（発現量平均値）よりも高かった。
　一方、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-20a-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-492、hsa-miR-578、及びhsa-miR-646は、脳腫瘍患者における発現レベル（発現量平均値）が、健常者における発現レベル（発現量平均値）よりも低かった。
　脳腫瘍判定の感度、特異度、及び診断率を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (16)

  1. 脳腫瘍を検査する方法であって、
    （1）被検体から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーを検出する工程、
    を含む、検査方法。
  2. （2）前記工程（1）で検出された前記バイオマーカーの量又は濃度に基づいて、前記被検体が脳腫瘍に罹患しているか否かを判定する工程、
    を含む、請求項１に記載の検査方法。
  3. 前記バイオマーカーがmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、及びmiR-509-5pからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１又は２に記載の検査方法。
  4. 前記バイオマーカーがmiR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、及びmiR-483-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１～３のいずれかに記載の検査方法。
  5. 前記バイオマーカーが3種以上である、請求項３又は４に記載の検査方法。
  6. 前記脳腫瘍が神経膠腫である、請求項３～５のいずれかに記載の検査方法。
  7. 前記バイオマーカーがmiR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１又は２に記載の検査方法。
  8. 前記バイオマーカーがmiR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、及びmiR-20a-3pからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１、２及び７のいずれかに記載の検査方法。
  9. 前記バイオマーカーが3種以上である、請求項７又は８に記載の検査方法。
  10. 前記体液が尿である、請求項１～９のいずれかに記載の検査方法。
  11. 前記体液試料が尿の細胞外小胞である、請求項１～１０のいずれかに記載の検査方法。
  12. 前記被検体がヒトである、請求項１～１１のいずれかに記載の検査方法。
  13. miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、脳腫瘍の検査薬。
  14. miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの検出剤を含む、脳腫瘍の検査キット。
  15. 被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
  16. 被検物質で処理された動物から採取された体液由来試料体液由来試料における、miR-345-3p、miR-208a-5p、miR-188-3p、miR-504-5p、miR-199a-5p、miR-93-3p、miR-328-5p、miR-483-3p、miR-204-3p、miR-411-3p、miR-1251-5p、miR-30c-2-3p、miR-26a-1-3p、miR-27b-3p、miR-338-5p、miR-541-3p、miR-224-3p、miR-143-3p、miR-32-3p、miR-202-5p、miR-296-3p、miR-598-5p、miR-125b-2-3p、miR-20b-3p、miR-181b-2-3p、miR-29b-2-5p、miR-301a-5p、miR-140-3p、miR-122-5p、miR-335-3p、miR-539-5p、miR-374b-5p、miR-144-5p、miR-196a-5p、miR-124-3p、miR-363-5p、miR-376b-5p、miR-367-5p、miR-29a-3p、miR-146a-3p、miR-216a-5p、miR-148a-5p、miR-99a-5p、miR-509-5p、miR-6070、miR-450a-2-3p、miR-4638-3p、miR-20a-3p、miR-646、miR-151a-5p、miR-151b、miR-146a-5p、miR-371a-3p、miR-21-3p、miR-578、miR-4428、miR-5095、miR-193a-3p、miR-4538、miR-492、miR-4482-5p、及びmiR-4768-3pからなる群より選択される少なくとも1種のバイオマーカーの量又は濃度を指標とする、脳腫瘍の誘発性又は増悪性の評価方法。
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