WO2017171039A1 - 悪性脳腫瘍の検出キット又はデバイス及び検出方法 - Google Patents

悪性脳腫瘍の検出キット又はデバイス及び検出方法 Download PDF

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真紀子 吉本
聡子 小園
淳平 河内
近藤　哲司
信正　均
孝広 落谷
善孝 成田
大野　誠
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東レ株式会社
国立研究開発法人国立がん研究センター
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a kit or device for detecting a malignant brain tumor comprising a nucleic acid that can specifically bind to a specific miRNA, and a nucleic acid that is used for examining whether or not a subject has a malignant brain tumor. And a method for detecting a malignant brain tumor, comprising measuring the expression level of the miRNA.
  • Brain tumors are classified into primary brain tumors that originate from the brain tissue itself and metastatic brain tumors in which cancers of other organs have spread to the brain.
  • Primary brain tumors are divided into benign and malignant, and are subdivided according to the cell type of origin.
  • Primary brain tumors are mainly glioma (malignant), central nervous system primary malignant lymphoma (malignant), meningiomas (mainly benign), pituitary adenoma (benign), schwannoma (benign), congenital tumor Glioma accounts for 28% of the total. Glioma is further classified into astrocytoma, oligodendroglioma, oligodendrocyte astrocytoma, ciliary cell astrocytoma, ependymoma, ganglion glioma, etc.
  • the present invention are mainly glioma (malignant), central nervous system primary malignant lymphoma (malignant), meningiomas (mainly benign), pituitary adenoma (benign), schwannoma (benign), congenital tumor Glioma accounts for 28% of the total. Glioma is further classified into astrocytoma,
  • the UICC Unio Internationalis Contra Canum
  • TNM Tumors 6th edition
  • TNM stage classification
  • the grade of malignancy of a brain tumor is classified into grades I to IV according to the 2007 WHO classification.
  • Brain tumors are usually detected by patients who complain of subjective symptoms such as headache, vomiting, paralysis, aphasia, articulation disorder, and consciousness disorder, imaging of minor head trauma, and medical examinations such as brain tests .
  • image diagnosis CT, MRI, cerebral angiography and the like are used.
  • a brain tumor is found by image diagnosis, the tumor is removed by craniotomy and a pathological diagnosis is performed using the removed tissue.
  • tumor markers for detecting malignant brain tumors with markers in the blood are not widely used in clinical settings.
  • Patent Document 1 describes a method for treating and diagnosing cancers including brain tumors using miRNAs that have different expression levels between human glioblastoma stem cells and normal neural stem cells.
  • Patent Document 1 only describes change data of miRNA expression level in cells. Obtaining brain cells as a specimen imposes a heavy physical burden on the patient, and therefore a test method using brain cells as a specimen is not preferable.
  • the diagnostic method described in Patent Document 1 is lacking in industrial practicality because there is no description about the discrimination performance and means such as specific accuracy, sensitivity, and specificity for discriminating brain tumors.
  • An object of the present invention is to provide a novel malignant brain tumor marker and a method capable of effectively detecting a malignant brain tumor.
  • RNA genes that can be used as detection markers for malignant brain tumors from blood that can be collected in a minimally invasive manner, and nucleic acids that can specifically bind to these genes. It has been found that malignant brain tumors can be detected significantly by using, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • a kit for detecting a malignant brain tumor comprising a nucleic acid capable of specifically binding to at least one polynucleotide selected from the group consisting of miR-3195 and miR-6683-3p.
  • miR-1909-3p is hsa-miR-1909-3p
  • miR-6869-5p is hsa-miR-6869-5p
  • miR-3178 is hsa-miR-3178
  • miR-4787 -5p is hsa-miR-4787-5p
  • miR-6510-5p is hsa-miR-6510-5p
  • miR-4695-5p is hsa-miR-4695-5p
  • miR-4634 is hsa -MiR-4634
  • miR-4449 is hsa-miR-4449
  • miR-3195 is hsa-miR-3195
  • miR-6636-3p is hsa-miR-6636-3p ( The kit according to 1).
  • miR-187-5p is hsa-miR-187-5p.
  • a polynucleotide that is capable of specifically binding to a miR-187-5p polynucleotide as shown in the following (f) to (j):
  • H a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to the base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more consecutive bases
  • Its fragments including (I) a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to a base sequence in which u is t in the base sequence
  • a device for detecting malignant brain tumor comprising a nucleic acid capable of specifically binding to at least one polynucleotide selected from the group consisting of miR-3195 and miR-6683-3p.
  • miR-1909-3p is hsa-miR-1909-3p
  • miR-6869-5p is hsa-miR-6869-5p
  • miR-3178 is hsa-miR-3178
  • miR-4787 -5p is hsa-miR-4787-5p
  • miR-6510-5p is hsa-miR-6510-5p
  • miR-4695-5p is hsa-miR-4695-5p
  • miR-4634 is hsa -MiR-4634
  • miR-4449 is hsa-miR-4449
  • miR-3195 is hsa-miR-3195
  • miR-6636-3p is hsa-miR-6636-3p ( The device according to 7).
  • (9) The polynucleotide shown in the following (a) to (e): (A) including a polynucleotide consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more consecutive bases Its fragments, (B) a polynucleotide comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 10, (C) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence in which u is t in the nucleotide sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more A fragment thereof containing a continuous base of (D) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 or
  • a polynucleotide that is capable of specifically binding to a miR-187-5p polynucleotide as shown in the following (f) to (j):
  • H a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to the base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more consecutive bases
  • Its fragments including (I) a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to a base sequence in which u is t in the base sequence
  • a method for detecting a malignant brain tumor comprising detecting the presence or absence.
  • malignant brain tumor refers to any malignant tumor formed in the brain. Specifically, malignant brain tumors include glioma and central nervous system primary malignant lymphoma.
  • benign tumor of the brain refers to any benign tumor formed in the brain.
  • the benign tumor of the brain is not particularly limited, but a typical example is a benign meningioma.
  • polynucleotide is used for nucleic acids including RNA, DNA, and RNA / DNA (chimera).
  • the DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • the RNA includes total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, non-coding RNA and synthetic RNA.
  • synthetic DNA and “synthetic RNA” are artificially generated using, for example, an automatic nucleic acid synthesizer based on a predetermined base sequence (which may be either a natural sequence or a non-natural sequence). It refers to the prepared DNA and RNA.
  • non-natural sequence is intended to be used in a broad sense, and is a sequence (for example, one or more nucleotide substitutions, deletions, insertions and / or additions) that differs from the natural sequence ( That is, it includes a mutant sequence), a sequence containing one or more modified nucleotides (ie, a modified sequence), and the like.
  • polynucleotide is used interchangeably with “nucleic acid”.
  • a “fragment” is a polynucleotide having a base sequence of a continuous part of a polynucleotide, and desirably has a length of 15 bases or more, preferably 17 bases or more, more preferably 19 bases or more. .
  • RNA and double-stranded DNA include not only RNA and double-stranded DNA, but also each single-stranded DNA such as positive strand (or sense strand) or complementary strand (or antisense strand) constituting the same. It is intended to be used.
  • the length is not particularly limited.
  • “gene” refers to double-stranded DNA including human genomic DNA, single-stranded DNA (positive strand), and single-stranded DNA having a sequence complementary to the positive strand (complementary). Strand) (eg, cDNA), microRNA (miRNA), and fragments thereof, and transcripts.
  • Strand eg, cDNA
  • miRNA microRNA
  • transcripts eg, a transcript of a transcript sequence
  • the “gene” is not limited to a “gene” represented by a specific nucleotide sequence (or sequence number), but also RNAs having biological functions equivalent to RNA encoded by these, for example, homologs (ie, homologs). Or orthologs), variants such as gene polymorphisms, and “nucleic acids” encoding derivatives.
  • the “nucleic acid” encoding such homologue, variant or derivative is, for example, the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 39 under the stringent conditions described later, or the base A “nucleic acid” having a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence in which u is t in the sequence can be mentioned.
  • the “gene” does not ask whether the functional region is different, and may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron. Further, the “gene” may be contained in the cell, may be released outside the cell and may be present alone, or may be encapsulated in a vesicle called an exosome.
  • exosome is a vesicle encased in a lipid bilayer secreted from a cell. Exosomes are derived from multivesicular endosomes, and when released to the extracellular environment, they may contain biological substances such as “genes” such as RNA and DNA and proteins. It is known that exosomes are contained in body fluids such as blood, serum, plasma, serum and lymph.
  • RNA refers to RNA synthesized using a DNA sequence of a gene as a template.
  • RNA is synthesized in such a manner that RNA polymerase binds to a site called a promoter located upstream of the gene and ribonucleotides are bound to the 3 'end so as to be complementary to the DNA base sequence.
  • This RNA includes not only the gene itself but also the entire sequence from the transcription start point to the end of the poly A sequence, including the expression control region, coding region, exon or intron.
  • “transcript” also includes RNA (eg, miRNA) produced from RNA (eg, miRNA precursor) synthesized using the DNA sequence of a gene as a template, unless otherwise contextual.
  • microRNA is a protein complex that is transcribed as a hairpin-like RNA precursor, cleaved by a dsRNA cleaving enzyme having RNase III cleaving activity, and called RISC. 15-25 base non-coding RNA (mature miRNA) involved in the translational repression of mRNA and mainly used.
  • miRNA miRNA
  • “miRNA” used herein is not only “miRNA” represented by a specific base sequence (or SEQ ID NO), but also the “miRNA” unless the context indicates only mature miRNA.
  • precursors pre-miRNA, pri-miRNA
  • miRNAs that have equivalent biological functions, such as homologs (ie, homologs or orthologs), variants of genetic polymorphisms, and derivatives .
  • homologs ie, homologs or orthologs
  • variants of genetic polymorphisms and derivatives .
  • miRNA having a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the specific base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 39.
  • a “miRNA” may be a gene product of a miR gene (a gene encoding a miRNA precursor), such a gene product being a mature miRNA (eg, as described above) non-coding RNA of 15 to 25 bases, or 19 to 25 bases involved in mRNA translational suppression) or miRNA precursors (eg, pre-miRNA or pri-miRNA as described above).
  • the “probe” includes a polynucleotide used for specifically detecting RNA produced by gene expression or a polynucleotide derived therefrom and / or a polynucleotide complementary thereto.
  • the “primer” includes a polynucleotide that specifically recognizes and amplifies RNA generated by gene expression or a polynucleotide derived therefrom and / or a polynucleotide complementary thereto.
  • a complementary polynucleotide is a polynucleotide comprising a base sequence defined by any of SEQ ID NOs: 1 to 39 or a base sequence in which u is t in the base sequence.
  • the description “a polynucleotide comprising a complementary base sequence” to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 39 or a base sequence in which u is t in the base sequence is basically understood in the same manner. .
  • stringent conditions refers to a degree to which a polynucleotide such as a nucleic acid probe or primer is larger than other sequences (for example, an average of background measurement values + standard error of background measurement values ⁇ 2 or more). Measured value) refers to conditions for hybridizing to the target sequence. Stringent conditions are sequence-dependent and depend on the environment in which hybridization is performed. By controlling the stringency of hybridization and / or wash conditions, target sequences that are 100% complementary to a polynucleotide, such as a nucleic acid probe, can be identified. Specific examples of “stringent conditions” will be described later.
  • the “Tm value” means a temperature at which a double-stranded portion of a polynucleotide is denatured into a single strand and the double strand and the single strand are present at a ratio of 1: 1.
  • variant refers to a natural variant caused by polymorphism, mutation, etc., or any nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 39, or u in the nucleotide sequence in the case of nucleic acid.
  • nucleotide sequence of t, or a partial sequence thereof a variant containing one or more (eg, 1 to several) base deletions, substitutions, additions or insertions, or a full-length sequence of the base sequence or a partial sequence thereof
  • a polynucleotide variant comprising a nucleotide sequence exhibiting% identity of about 90% or more, about 95% or more, about 97% or more, about 98% or more, about 99% or more, or a full-length sequence of the base sequence or a partial sequence thereof Means a nucleic acid that hybridizes with a polynucleotide or oligonucleotide containing a stringent condition as defined above.
  • “several” means an integer of about 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2.
  • a variant of a polynucleotide can be prepared using a well-known technique such as a site-directed mutagenesis method or a mutagenesis method using a PCR method.
  • % identity can be determined using the above-described BLAST or FASTA protein or gene search system with or without introducing a gap (Zheng Zhang et al., 2000, J. Comput. Biol., 7, p203-214; Altschul, SF et al., 1990, Journal of Molecular Biology, 215, p403-410; Pearson, WR et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.85, pp. 2444-2448).
  • the term “derivative” refers to a modified nucleic acid, a non-limiting group such as a labeled derivative such as a fluorophore, a modified nucleotide (for example, a halogen, an alkyl such as methyl, an alkoxy such as methoxy, a group such as thio, carboxymethyl, etc.
  • a derivative containing PNA peptide nucleic acid; Nielsen, PE, etc.
  • a “nucleic acid” capable of specifically binding to a polynucleotide selected from the group of miRNAs that are the above malignant brain tumor markers is a synthesized or prepared nucleic acid, specifically a “nucleic acid probe”.
  • a “primer” to detect the presence or absence of a malignant brain tumor in a subject, or the presence or absence of a malignant brain tumor, the degree of morbidity, the presence or absence of improvement of a malignant brain tumor, the degree of improvement, and the treatment of a malignant brain tumor Directly or indirectly for diagnosing susceptibility to or screening for candidate substances useful for the prevention, amelioration or treatment of malignant brain tumors.
  • transcript polynucleotide represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 39 or a cDNA synthesized nucleic acid thereof in a living body, particularly a body fluid such as blood, urine, etc. in relation to the occurrence of malignant brain tumor.
  • Nucleotides, oligonucleotides, and polynucleotides that can be recognized and bound specifically. These nucleotides, oligonucleotides and polynucleotides are used as probes for detecting the gene expressed in vivo, in tissues or cells based on the above properties, and for amplifying the gene expressed in vivo. It can be effectively used as a primer.
  • the term “detection” can be replaced by the terms inspection, measurement, detection, discrimination, or decision support. Further, in this specification, the term “evaluation” is used in a meaning including supporting diagnosis or evaluation based on a test result or a measurement result.
  • subject includes humans, primates including chimpanzees, pet animals such as dogs and cats, livestock animals such as cows, horses, sheep and goats, rodents such as mice and rats, Mammals such as animals raised in zoos.
  • a preferred subject is a human.
  • a “subject” suffering from a disease such as a malignant brain tumor or a benign brain tumor may be referred to as a “patient”.
  • “Healthy body” also means an animal that is such a mammal and does not suffer from the cancer to be detected.
  • a preferred healthy body is a human.
  • P or “P value” refers to the probability that, in a statistical test, a statistic more extreme than the statistic actually calculated from the data under the null hypothesis is observed. Indicates. Therefore, it can be considered that the smaller the “P” or “P value”, the more significant the difference between the comparison objects.
  • sensitivity means a ratio of (number of true positives) / (number of true positives + number of false negatives). High sensitivity makes it possible to detect malignant brain tumors at an early stage, leading to complete resection of cancer and a reduction in the recurrence rate.
  • specificity means a ratio of (number of true negatives) / (number of true negatives + number of false positives). If the specificity is high, it is possible to prevent an unnecessary additional test by misidentifying a healthy body as a malignant brain tumor patient, thereby reducing the burden on the patient and medical costs.
  • accuracy means a ratio of (number of true positives + number of true negatives) / (number of all cases). The accuracy indicates the rate at which the discrimination results for all the samples are correct, and is a first index for evaluating the discrimination performance (detection performance).
  • specimen as a target of determination, detection or diagnosis refers to a tissue in which the expression of the gene of the present invention changes as a result of the occurrence of a malignant brain tumor, the progression of a malignant brain tumor, or the display of a therapeutic effect on a malignant brain tumor.
  • biomaterials Specifically, brain tissue and surrounding blood vessels, meninges, organs suspected of metastasis, skin, and body fluids such as blood, urine, spinal fluid, saliva, sweat, tissue exudate, serum prepared from blood, plasma, In addition, it refers to stool, hair, and the like.
  • a biological sample extracted from these specimens specifically, a gene such as RNA or miRNA is also included in the determination, detection or diagnosis using the specimen.
  • hsa-miR-1909-3p gene or “hsa-miR-1909-3p” refers to the hsa-miR-1909-3p gene described in SEQ ID NO: 1 (miRBase Accession No. 1). MIMAT0007883) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-1909-3p gene can be obtained by the method described in Bar M et al., 2008, Stem Cells, Vol. 26, p2496-2505. Further, as a precursor of “hsa-miR-1909-3p”, “hsa-mir-1909” (miRBase Accession No. MI0008330, SEQ ID NO: 12) having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-6869-5p gene or “hsa-miR-6869-5p” refers to the hsa-miR-6869-5p gene (miRBase Accession No. 2) described in SEQ ID NO: 2. MIMAT0027638) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-6869-5p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Res, Vol. 22, p1634-1645.
  • “hsa-mir-6869” miRBase Accession No. MI0022716, SEQ ID NO: 13 having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-3178 gene or “hsa-miR-3178” refers to the hsa-miR-3178 gene (miRBase Accession No. MIMAT0015055) described in SEQ ID NO: 3 and other biological species. Includes homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-3178 gene can be obtained by the method described in Stark MS et al., 2010, PLoS One, 5, e9685.
  • “hsa-mir-3178” (miRBase Accession No. MI0014212, SEQ ID NO: 14) having a hairpin-like structure is known as a precursor of “hsa-miR-3178”.
  • hsa-miR-4787-5p gene or “hsa-miR-4787-5p” refers to the hsa-miR-4787-5p gene described in SEQ ID NO: 4 (miRBase Accession No. MIMAT0019956) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-4787-5p gene can be obtained by the method described in Persson H et al., 2011, Cancer Res, 71, p78-86.
  • “hsa-mir-4787” miRBase Accession No. MI0017434, SEQ ID NO: 15 having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-6510-5p gene or “hsa-miR-6510-5p” refers to the hsa-miR-6510-5p gene described in SEQ ID NO: 5 (miRBase Accession No. MIMAT0025476) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-6510-5p gene can be obtained by the method described in Joyce CE et al., 2011, Hum Mol Genet, 20, p4025-4040.
  • hsa-mir-6510 as a precursor of “hsa-miR-6510-5p” having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-4695-5p gene or “hsa-miR-4695-5p” refers to the hsa-miR-4695-5p gene (miRBase Accession No. 6) described in SEQ ID NO: 6. MIMAT0019788) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-4695-5p gene can be obtained by the method described in Persson H et al., 2011, Cancer Res, 71, p78-86.
  • “hsa-mir-4695” miRBase Accession No. MI0017328, SEQ ID NO: 17 having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-4634 gene or “hsa-miR-4634” refers to the hsa-miR-4634 gene (miRBase Accession No. MIMAT0019691) described in SEQ ID NO: 7 or other biological species. Includes homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-4634 gene can be obtained by the method described in Persson H et al., 2011, Cancer Res, 71, p78-86.
  • “hsa-mir-4634” (miRBase Accession No. MI0017261, SEQ ID NO: 18) having a hairpin-like structure is known as a precursor of “hsa-miR-4634”.
  • hsa-miR-4449 gene or “hsa-miR-4449” refers to the hsa-miR-4449 gene (miRBase Accession No. MIMAT0018968) described in SEQ ID NO: 8 or other biological species. Includes homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-4449 gene can be obtained by the method described in Jim DD et al., 2010, Blood, 116, e118-127.
  • hsa-mir-4449 as a precursor of “hsa-miR-4449”, “hsa-mir-4449” (miRBase Accession No. MI0016792, SEQ ID NO: 19) having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-3195 gene or “hsa-miR-3195” refers to the hsa-miR-3195 gene (miRBase Accession No. MIMAT0015079) described in SEQ ID NO: 9 or other biological species. Includes homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-3195 gene can be obtained by the method described in Stark MS et al., 2010, PLoS One, 5, e9685.
  • “hsa-mir-3195” (miRBase Accession No. MI0014240, SEQ ID NO: 20) having a hairpin-like structure is known as a precursor of “hsa-miR-3195”.
  • hsa-miR-6836-3p gene or “hsa-miR-6836-3p” refers to the hsa-miR-683-3p gene (miRBase Accession No. 5) described in SEQ ID NO: 10. MIMAT0027575) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-6836-3p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Res, Vol. 22, p1634-1645.
  • hsa-mir-6836 miRBase Accession No. MI0022682, SEQ ID NO: 21 having a hairpin-like structure is known.
  • hsa-miR-187-5p gene or “hsa-miR-187-5p” refers to the hsa-miR-187-5p gene described in SEQ ID NO: 11 (miRBase Accession No. MIMAT0004561) and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-187-5p gene can be obtained by the method described in Lim LP et al., 2003, Science, 299, p1540.
  • “hsa-mir-187” (miRBase Accession No. MI000000274, SEQ ID NO: 22) having a hairpin-like structure is known.
  • isomiR miRNA RD. Et al., 2008, Genome Research, Vol. 18, p. 610-621.
  • miRBBase Release 21 in addition to the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 9 and 11, a number of polynucleotide variants and fragments represented by SEQ ID NOs: 23 to 39 called isomiR are also shown. These can also be obtained as a variant or fragment of miRNA having the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 9 and 11.
  • variants of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 9 and 11 of the present invention or a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which u is t in the nucleotide sequence it is registered, for example, in miRBBase Release 21
  • examples of the longest mutant include polynucleotides having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 23 to 32, respectively.
  • Examples of the shortest mutant registered in miRBBase Release 21 include polynucleotides each having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 33 to 39.
  • polynucleotides that are numerous isomiRs for miRNAs of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 8, 9, and 11 registered in miRBase are also included.
  • examples of the polynucleotide containing the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 11 include the polynucleotides represented by any of SEQ ID NOs: 12 to 22, which are precursors.
  • telomere binding bindable means that a nucleic acid used in the present invention, such as a nucleic acid probe or primer, binds to a specific target nucleic acid and cannot substantially bind to other nucleic acids.
  • a malignant brain tumor can be easily detected with high accuracy. For example, it is possible to easily detect (determine) whether or not a patient has a malignant brain tumor using as an index the measured value of the miRNA in a sample (blood, serum, etc.) that can be collected with minimal invasiveness of the patient.
  • a sample blood, serum, etc.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequences of hsa-miR-1909-3p represented by SEQ ID NO: 1 and hsa-miR-1909-5p generated from hsa-mir-1909 represented by SEQ ID NO: 12, which is a precursor. The relationship is shown.
  • hsa-miR-1909-3p SEQ ID NO: 1 of malignant brain tumor patients (98), benign brain tumor patients (14), and healthy subjects (100) selected as a learning sample group (training cohort)
  • Each measured value is represented as a vertical axis.
  • hsa-miR-1909-3p (SEQ ID NO: 1) of malignant brain tumor patients (49), benign brain tumor patients (7), and healthy subjects (50) selected as a validation sample group
  • Each measured value is represented as a vertical axis.
  • hsa-miR-1909-3p SEQ ID NO: 1
  • hsa-miR- of malignant brain tumor patients 98
  • healthy subjects 100
  • benign brain tumor patients (14) selected as a learning sample group
  • the dotted line in the figure indicates the discrimination boundary for discriminating both groups having a discrimination score of 0.
  • the discriminant score obtained from the discriminant created in the learning sample group is represented on the vertical axis
  • the sample group is represented on the horizontal axis.
  • the dotted line in the figure indicates the discrimination boundary for discriminating both groups having a discrimination score of 0.
  • Left figure (same as left figure in FIG.
  • hsa-miR-1909-3p sequence of malignant brain tumor patients (98), healthy subjects (100), and benign brain tumor patients (14) selected as a learning sample group No. 1
  • the dotted line in the figure indicates the discrimination boundary for discriminating both groups having a discrimination score of 0.
  • the discriminant score obtained from the discriminant created in the learning sample group is the vertical axis, and the sample group is It is expressed as an axis.
  • the dotted line in the figure indicates the discrimination boundary for discriminating both groups having a discrimination score of 0.
  • Target nucleic acid of malignant brain tumor for detecting the presence and / or absence of malignant brain tumor or malignant brain tumor cells using the nucleic acid / polynucleotide (eg, nucleic acid probe or primer) for detecting malignant brain tumor of the present invention as defined above
  • Major target nucleic acids as malignant brain tumor markers include hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p Using at least one miRNA selected from the group consisting of hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, and hsa-miR-6636-3p Can do.
  • hsa-miR-187-5p miRNA can also be preferably used as a target nucleic acid.
  • the miRNA used as the target nucleic acid include human genes containing the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 11 (for example, hsa-miR-1909-3p and hsa-miR-6869-5p, respectively).
  • genes, homologues, transcripts, mutants and derivatives are as defined above.
  • a preferred target nucleic acid in a human specimen is a human gene comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 39, or a transcription product thereof, more preferably the transcription product such as hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, and hsa-miR-187-5p miRNA, or its precursor RNA, pri-miRNA or pre-miRNA.
  • the first target gene is the hsa-miR-1909-3p gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the second target gene is the hsa-miR-6869-5p gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the third target gene is the hsa-miR-3178 gene, a homologue thereof, a transcription product thereof, or a mutant or derivative thereof. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the fourth target gene is the hsa-miR-4787-5p gene, its homologues, their transcription products, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the fifth target gene is the hsa-miR-6510-5p gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the sixth target gene is the hsa-miR-4695-5p gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the seventh target gene is the hsa-miR-4634 gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the eighth target gene is the hsa-miR-4449 gene, a homologue thereof, a transcription product thereof, or a mutant or derivative thereof. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the ninth target gene is the hsa-miR-3195 gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the tenth target gene is the hsa-miR-6836-3p gene, its homologues, their transcription products, or their mutants or derivatives. Until now, there has been no report that changes in the expression of this gene or its transcription product can serve as markers for malignant brain tumors.
  • the eleventh target gene is the hsa-miR-187-5p gene, its homologues, their transcripts, or their mutants or derivatives.
  • Patent Document 1 reports that changes in the expression of hsa-miR-187-5p miRNA can serve as markers for malignant brain tumors.
  • nucleic acid for detection of malignant brain tumor a nucleic acid, such as a nucleic acid probe or primer, for detecting (discriminating) or diagnosing a malignant brain tumor using a nucleic acid that can specifically bind to the target nucleic acid as the malignant brain tumor marker.
  • a nucleic acid such as a nucleic acid probe or primer, for detecting (discriminating) or diagnosing a malignant brain tumor using a nucleic acid that can specifically bind to the target nucleic acid as the malignant brain tumor marker.
  • a nucleic acid such as a nucleic acid probe or primer that can be used for detecting a malignant brain tumor or diagnosing a malignant brain tumor is a target nucleic acid as a malignant brain tumor marker, ie, miR-1909-3p, miR- 6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, miR-6636-3p, or miR-187-5p Genes such as human-derived hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695 5p, hsa-miR-4634, hsa miR-4449, hsa-mi
  • the above target nucleic acids may increase or decrease in their expression level depending on the type of the target nucleic acid in subjects suffering from malignant brain tumors compared to healthy subjects or patients with benign brain tumors. (Hereinafter referred to as “increase / decrease”). Therefore, the nucleic acid of the present invention that can specifically bind to the target nucleic acid described above is a sample derived from a subject (such as a human) suspected of having a malignant brain tumor (for example, a body fluid such as blood) and a sample derived from a healthy body. By measuring the expression level of the target nucleic acid and comparing them, it can be effectively used to detect a malignant brain tumor.
  • a subject such as a human
  • a malignant brain tumor for example, a body fluid such as blood
  • the nucleic acid of the present invention is used to measure the expression level of the target nucleic acid in a sample (eg, a body fluid such as blood) derived from a subject (eg, a human) suspected of having a malignant brain tumor and a sample derived from a benign brain tumor patient. By comparing them, it can be used effectively to discriminate from patients with benign brain tumors and specifically detect malignant brain tumors.
  • a sample eg, a body fluid such as blood
  • a subject eg, a human
  • Nucleic acids such as nucleic acid probes or primers for detecting malignant brain tumor that can be used in the present invention are nucleic acid probes that can specifically bind to a polynucleotide comprising a base sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1 to 10, for example. Or a primer for amplifying a polynucleotide comprising the base sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • nucleic acid probe or primer or the like for detecting a malignant brain tumor for example, a nucleic acid probe that can specifically bind to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 11
  • a primer for amplifying a polynucleotide comprising the base sequence represented by can be further used.
  • the nucleic acid such as the above-described nucleic acid probe or primer used for the detection of malignant brain tumor has a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 39, or a base sequence in which u is t in the base sequence.
  • a polynucleotide group and a complementary polynucleotide group thereof Including a polynucleotide group and a complementary polynucleotide group thereof, a polynucleotide group (for example, DNA) having a base sequence complementary to the base sequence, and a polynucleotide group that hybridizes under stringent conditions (described later) and the complement thereof It includes a combination of one or a plurality of polynucleotides selected from a polynucleotide group and a polynucleotide group containing 15 or more, preferably 17 or more consecutive bases contained in the base sequence of the polynucleotide group. These polynucleotides can be used as nucleic acid probes and primers for detecting the above malignant brain tumor marker, which is a target nucleic acid.
  • nucleic acid / polynucleotides for detecting malignant brain tumor that can be used in the present invention, are selected from the group consisting of the following polynucleotides (a) to (e) 1 Or a plurality of polynucleotides.
  • the nucleic acid for detecting a malignant brain tumor that can be used in the present invention, for example, a nucleic acid probe or primer, It can contain at least one polynucleotide selected from the group consisting of the polynucleotides shown in (f) to (j).
  • fragment containing 15 or more consecutive bases of the above-mentioned polynucleotide is included in the base sequence of each polynucleotide, for example, 15 to less than the total number of bases in the sequence, 17 to all bases in the sequence It may include, but is not limited to, sequences with numbers of bases ranging from less than number, 19 to less than the total number of bases in the sequence.
  • Any of the above polynucleotides or fragments thereof used in the present invention may be DNA or RNA.
  • a polynucleotide having a base sequence in which u is t in a predetermined base sequence is DNA.
  • the above-mentioned polynucleotide that can be used in the present invention can be prepared using a general technique such as a DNA recombination technique, a PCR method, or a method using a DNA / RNA automatic synthesizer.
  • DNA recombination techniques and PCR methods are described in, for example, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willy & Sons, US (1993); Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory United, United States, 1998. Technology can be used.
  • the acquisition method is also known. Therefore, by cloning this gene, a polynucleotide as a nucleic acid probe or primer that can be used in the present invention can be prepared.
  • Nucleic acids such as nucleic acid probes or primers for detecting malignant brain tumors can be chemically synthesized using an automatic DNA synthesizer.
  • the phosphoramidite method is used for this synthesis, and single-stranded DNA of up to about 100 bases can be automatically synthesized by this method.
  • Automatic DNA synthesizers are commercially available from, for example, Polygen, ABI, Applied BioSystems, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention can also be prepared by a cDNA cloning method.
  • a cDNA cloning method for example, microRNA Cloning Kit Wako can be used as the cDNA cloning technique.
  • the polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 11 does not exist in vivo as miRNA or a precursor thereof.
  • the base sequence of hsa-miR-1909-3p represented by SEQ ID NO: 1 is generated from the precursor hsa-mir-1909 represented by SEQ ID NO: 12, and this precursor is as shown in FIG.
  • the base sequences of hsa-miR-1909-3p (SEQ ID NO: 1) and hsa-miR-1909-5p have mismatched sequences.
  • a polynucleotide having a base sequence completely complementary to the base sequence of hsa-miR-1909-3p represented by SEQ ID NO: 1 is not naturally generated in vivo.
  • a polynucleotide comprising a base sequence completely complementary to the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 2 to 11 has an artificial base sequence that does not exist in the living body.
  • the polynucleotide consisting of a base sequence completely complementary to the target base sequence means a polynucleotide consisting only of the base sequence complementary to the full-length sequence of the target base sequence.
  • a kit or device for detecting a malignant brain tumor The present invention also provides a polynucleotide (including a variant, fragment, or derivative) that can be used as a nucleic acid probe or primer in the present invention for measuring a target nucleic acid that is a malignant brain tumor marker.
  • a kit or a device for detecting a malignant brain tumor comprising one or more of which may be referred to hereinafter as detection polynucleotides).
  • the target nucleic acid that is a malignant brain tumor marker in the present invention is preferably one or more selected from the following group 1: miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p , MiR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, and miR-6636-3p.
  • another malignant brain tumor marker such as miR-187-5p may be further used as a target nucleic acid.
  • the kit or device of the present invention is a nucleic acid capable of specifically binding to a target nucleic acid that is the above malignant brain tumor marker, preferably a nucleic acid for detecting a malignant brain tumor described in “2. Nucleic acid for detecting a malignant brain tumor”. Nucleic acids such as probes or primers, specifically, one or a plurality of polynucleotides selected from the polynucleotides described in 2 above.
  • the kit or device of the present invention includes a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11, or a base sequence in which u is t in the base sequence.
  • the polynucleotide fragment that can be included in the kit or device of the present invention is, for example, one or more, preferably two or more polynucleotides selected from the following group (1).
  • a polynucleotide comprising 15 or more consecutive bases contained in a base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 11 and wherein u is t or a base sequence complementary thereto.
  • the polynucleotide is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 11, or a nucleotide sequence in which u is t in the nucleotide sequence, a polynucleotide comprising a complementary sequence thereof.
  • the size of a polynucleotide fragment is, for example, 15 to less than the total number of bases of the sequence, 17 to less than the total number of bases of the sequence,
  • the number of bases is in a range such as less than the total number of bases.
  • the combination of the above-mentioned polynucleotides constituting the kit or device of the present invention is represented by, for example, SEQ ID NOs shown in Table 1 described later (SEQ ID NOS: 1 to 11 corresponding to miRNA markers in Table 1). It may be any combination of the above polynucleotides consisting of a base sequence or a base sequence complementary thereto (complementary sequence). For example, a combination of nucleic acids capable of specifically binding to each of the polynucleotides represented by the combinations of SEQ ID Nos. Listed in Table 6 is mentioned, but these are only examples, and other various possible combinations are possible. All are intended to be encompassed by the present invention.
  • each sequence of two or more of the SEQ ID NOs (target nucleic acids) shown in Table 1 is used as a combination of the above-mentioned polynucleotides constituting a kit or device for distinguishing a malignant brain tumor from a healthy body.
  • a combination of the above-mentioned polynucleotides consisting of a base sequence represented by a number, a base sequence complementary thereto, or a fragment thereof is desirable.
  • a sufficient discrimination performance can be obtained with two combinations of SEQ ID NOs shown in Table 1, but three or more may be combined.
  • a combination of two polynucleotides used as a target nucleic acid for discriminating a malignant brain tumor patient from a benign brain tumor patient and a healthy body is selected from polynucleotides consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11 Of the two combinations, a combination comprising one or more selected from SEQ ID NOs: 1 to 10 newly found as malignant brain tumor markers is preferable.
  • a combination of nucleic acids that can specifically bind to each of the target nucleic acids in such a combination can be used in a kit or a device for distinguishing malignant brain tumors from healthy bodies.
  • the number of combinations of the above-mentioned cancer type-specific polynucleotides (target nucleic acids) can be one, two, three, four, five, or more combinations, More preferably, it is a combination of four or more, and usually a sufficient discrimination performance can be obtained with four combinations.
  • Examples of combinations of target nucleic acids (malignant brain tumor markers) used in the present invention include, but are not limited to, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence complementary thereto, and the above cancer type-specific poly From the nucleotide sequence represented by three SEQ ID NOs selected from other SEQ ID NOs (SEQ ID NOs: 2 to 10) and SEQ ID NO: 11 (miR-187-5p) included in nucleotide group 1 or nucleotide sequences complementary thereto Examples of combinations with such polynucleotides are given below.
  • a combination of a target nucleic acid (malignant brain tumor marker) used in the present invention includes, but is not limited to, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a base sequence complementary thereto, and the above cancer type-specific poly Nucleotide sequences represented by three SEQ ID NOs selected from other SEQ ID NOs (SEQ ID NOS: 1, 3 to 10) and SEQ ID NO: 11 (miR-187-5p) included in nucleotide group 1 or bases complementary thereto Examples of combinations with polynucleotides comprising sequences are given below.
  • Examples of combinations of target nucleic acids (malignant brain tumor markers) used in the present invention include, but are not limited to, a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence complementary thereto, and the above cancer type-specific poly Nucleotide sequences represented by three SEQ ID NOs selected from other SEQ ID NOs (SEQ ID NOS: 1-2, 4-10) and SEQ ID NO: 11 (miR-187-5p) included in nucleotide group 1 or complementary thereto
  • Examples of combinations with polynucleotides consisting of simple base sequences are given below.
  • Nucleic acids that can specifically bind to each of the target nucleic acids in the combinations exemplified above are preferably used as a set of polynucleotides for detecting malignant brain tumors in the kit or device of the present invention or the method for detecting (discriminating) malignant brain tumors. Can be used.
  • the kit or device of the present invention includes a polynucleotide for detecting a malignant brain tumor according to the present invention described above (including a base sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a base complementary thereto)
  • a polynucleotide for detecting a malignant brain tumor according to the present invention described above (including a base sequence represented by at least one of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a base complementary thereto)
  • known polynucleotides that allow for malignant brain tumor detection or polynucleotides that may be found in the future can also be included.
  • the polynucleotides contained in the kit of the present invention can be individually or arbitrarily combined and packaged in different containers.
  • the kit of the present invention can further include a kit for extracting nucleic acid (for example, total RNA) from body fluids, cells or tissues, a fluorescent substance for labeling, an enzyme and medium for nucleic acid amplification, instructions for use, and the like.
  • nucleic acid for example, total RNA
  • the device of the present invention is a device for measuring a cancer marker in which a nucleic acid such as a polynucleotide according to the present invention described above is bound or attached to a solid phase, for example.
  • a nucleic acid such as a polynucleotide according to the present invention described above is bound or attached to a solid phase
  • the material of the solid phase are plastic, paper, glass, silicon, and the like. From the viewpoint of ease of processing, the preferable material of the solid phase is plastic.
  • the shape of the solid phase is arbitrary, for example, a square shape, a round shape, a strip shape, a film shape and the like.
  • Examples of the device of the present invention include a device for measurement by a hybridization technique, and specific examples include a blotting device, a nucleic acid array (for example, a microarray, a DNA chip, an RNA chip, etc.).
  • the nucleic acid array technology uses a high-density dispenser called a spotter or arrayer on the surface of a solid phase that has been subjected to surface treatment such as introduction of functional groups such as L-lysine coat, amino group, and carboxyl group as necessary.
  • the method of spotting nucleic acids the method of spraying nucleic acids onto a solid phase using an inkjet that ejects fine droplets from a nozzle with a piezoelectric element, the method of sequentially synthesizing nucleotides on a solid phase, etc.
  • an array such as a chip is produced by binding or attaching the nucleic acids one by one, and the target nucleic acid is measured using hybridization using this array.
  • the kit or device of the present invention comprises at least one, preferably at least 2, more preferably at least 3, most preferably at least 5 to all of the polynucleotides of the above-mentioned group 1 malignant brain tumor markers. And a nucleic acid capable of specifically binding.
  • the kit or device of the present invention can optionally further comprise a nucleic acid capable of specifically binding to miR-187-5p, a known malignant brain tumor marker.
  • kit or device of the present invention can be used for the detection of a malignant brain tumor in the following “4.
  • the present invention further includes the kit or device of the present invention (including the above-described nucleic acid that can be used in the present invention) described in the above “3. Kit or device for detecting malignant brain tumor” or for detecting malignant brain tumor.
  • the expression level of the target nucleic acid in the sample specifically, the following groups: miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510- Expression level of at least one gene selected from 5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, and miR-6636-3p, and optionally miR-187-5p gene (typically Measuring the amount of miRNA or miRNA precursor) (preferably measured in vitro). No, it provides a method for detecting malignant brain tumors.
  • a sample eg, blood, serum, plasma, etc.
  • the patient after measuring the expression level of the target nucleic acid in the sample, the patient is further suspected to have a malignant brain tumor.
  • This method evaluates that a subject suspected of having a malignant brain tumor is suffering from a malignant brain tumor if there is a statistically significant difference in the expression level of the target nucleic acid in both samples. May be included.
  • This method uses the expression level of the target nucleic acid measured for the specimen derived from the subject and the expression level of the non-malignant control group (comparing them), and the subject is suffering from a malignant brain tumor. Alternatively, it may include evaluating the absence of a malignant brain tumor (whether or not the patient has a malignant brain tumor) and detecting the presence or absence of the malignant brain tumor. The evaluation of whether or not the subject has a malignant brain tumor may be to obtain an index indicating the presence or absence of the malignant brain tumor.
  • an index value indicating the presence of a malignant brain tumor is obtained, it is determined that the presence of the malignant brain tumor in the subject has been detected, and if an index value indicating that the subject is not suffering from a malignant brain tumor is obtained It can be determined that no malignant brain tumor was detected in the subject.
  • the above method of the present invention enables early diagnosis of cancer with minimal invasiveness, high sensitivity and specificity, thereby leading to early treatment and improvement of prognosis, as well as monitoring disease aversion and surgical Enables monitoring of the effectiveness of radiotherapeutic and chemotherapeutic treatments.
  • a nucleic acid that can contain a target nucleic acid derived from a malignant brain tumor is extracted from a specimen such as blood, serum, or plasma of the present invention.
  • a method for extracting a nucleic acid to be used in a target nucleic acid detection assay from a sample it is particularly preferable to prepare by adding an RNA extraction reagent in 3D-Gene (registered trademark) RNA extraction reagent liquid sample kit (Toray Industries, Inc.).
  • the general acidic phenol method (Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform (AGPC) method), Trizol (registered trademark) (Life Technologies), Trizol (life technologies), or Isogen It may be prepared by adding an RNA extraction reagent containing acidic phenol such as (Nippon Gene). Furthermore, kits such as miRNeasy (registered trademark) Mini Kit (Qiagen) can be used, but are not limited to these methods.
  • the present invention also provides a kit or device of the present invention, or a polynucleotide for detecting a malignant brain tumor that can be used in the kit (a polynucleotide that can specifically bind to one target nucleic acid miRNA, or two or more targets described above).
  • a combination of polynucleotides capable of specifically binding to each of the nucleic acid miRNAs is provided for in vitro detection of an expression product of a miR gene from a malignant brain tumor in a subject-derived specimen.
  • the present invention also provides a kit or device of the present invention, or a polynucleotide for detecting a malignant brain tumor (a polynucleotide that can specifically bind to one target nucleic acid miRNA, or each of two or more target nucleic acid miRNAs).
  • a combination of polynucleotides capable of specifically binding to a subject) in the detection of malignant brain tumors in a subject in the detection of malignant brain tumors in a subject.
  • the present invention also provides a kit or device of the present invention for detecting or diagnosing a malignant brain tumor in a subject, or the polynucleotide (a polynucleotide that can specifically bind to one target nucleic acid miRNA, or two or more).
  • the present invention includes the polynucleotide (a polynucleotide that can specifically bind to one target nucleic acid miRNA, or a combination of polynucleotides that can specifically bind to each of two or more target nucleic acid miRNAs). Also provides diagnostics for malignant brain tumors.
  • the polynucleotide, kit, device and the like for detecting a malignant brain tumor of the present invention are useful for diagnosis of a malignant brain tumor.
  • the kit or the device includes a polynucleotide for detecting a malignant brain tumor that can be used in the present invention, as described above, alone or in any possible combination.
  • the polynucleotide contained in the kit or device of the present invention can be used as a probe or a primer.
  • a primer Life Technologies' TaqMan (registered trademark) MicroRNA Assays, Qiagen's miScript PCR System, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • Polynucleotides contained in the kit or device of the present invention are quantitatively determined by hybridization techniques such as Northern blotting, Southern blotting, in situ hybridization, Northern hybridization, Southern hybridization, and quantitative RT-PCR.
  • a known method for specifically detecting a specific gene such as an amplification technique, it can be used as a primer or a probe according to a conventional method.
  • body fluid such as blood, serum, plasma, urine, etc. of the subject is collected according to the type of detection method used.
  • total RNA prepared from the body fluid by the above method may be used, and various polynucleotides including cDNA prepared based on the RNA may be used.
  • the kit or device of the present invention is useful for diagnosing malignant brain tumors or detecting the presence or absence of morbidity.
  • the detection of a malignant brain tumor using the kit or device is included in the kit or device from a subject suspected of having a malignant brain tumor using a specimen such as blood, serum, plasma, or urine.
  • the detection can be performed in vitro by detecting the expression level of the gene detected by the nucleic acid probe or primer.
  • the amount of target nucleic acid (malignant brain tumor marker such as miRNA) in a sample such as blood, serum, plasma, urine, etc. of a subject suspected of having a malignant brain tumor is included in the kit or device of the present invention.
  • the method of the present invention can be combined with diagnostic imaging methods such as CT scan, MRI (nuclear magnetic resonance apparatus), and cerebral angiography.
  • diagnostic imaging methods such as CT scan, MRI (nuclear magnetic resonance apparatus), and cerebral angiography.
  • a method for detecting that the sample does not contain an expression product of the miR gene derived from a malignant brain tumor or contains an expression product of the miR gene derived from a malignant brain tumor A body fluid such as blood, serum, plasma, urine, etc. of the subject was collected as a specimen, and the expression level of the target gene (miR gene) contained therein was selected from the polynucleotide group for detecting malignant brain tumor of the present invention. It includes assessing the presence or absence of a malignant brain tumor or detecting a malignant brain tumor by measuring using one or more polynucleotides (including mutants, fragments or derivatives).
  • the method for detecting a malignant brain tumor of the present invention for example, in a malignant brain tumor patient, when a therapeutic agent is administered for the improvement of the disease, the presence or absence of the improvement of the disease or the degree of the improvement may be evaluated or diagnosed. it can.
  • the method of the present invention includes, for example, the following steps (a), (b) and (c): (A) contacting a specimen derived from a subject in vitro with a polynucleotide in the kit or device of the present invention or the polynucleotide for detecting a malignant brain tumor of the present invention; (B) measuring the expression level of the target nucleic acid in the specimen using the polynucleotide as a nucleic acid probe or primer; (C) evaluating the presence or absence of a malignant brain tumor (cell) in the subject based on the result of (b), Can be included.
  • blood, serum, or plasma can be used as a preferable specimen.
  • the expression level is measured using a technique such as a hybridization technique such as a nucleic acid array method, a technique for determining a nucleotide sequence of a polynucleotide using a sequencer or the like, or a quantitative amplification technique such as a quantitative RT-PCR method.
  • a technique such as a hybridization technique such as a nucleic acid array method, a technique for determining a nucleotide sequence of a polynucleotide using a sequencer or the like, or a quantitative amplification technique such as a quantitative RT-PCR method.
  • step (c) above based on the result of (b), the subject evaluates whether or not the subject suffers from a malignant brain tumor, whereby the presence of a malignant brain tumor (cell) in the subject Alternatively, it may be a step of detecting absence.
  • the expression level of the target nucleic acid in the specimen derived from the subject is changed to the expression level of the target nucleic acid in the specimen derived from a healthy subject or a benign brain tumor patient (non-malignant control group) ("Reference” (Reference) ) Or “control” (also referred to as “Control”), if there is a statistically significant difference, the expression level of the target nucleic acid in the sample derived from the subject and the discriminant score obtained from the discriminant equation Whether or not the subject suffers from a malignant brain tumor can be evaluated (discriminated).
  • the present invention relates to miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449.
  • the expression level of the target nucleic acid in the sample of the subject is measured, and the measured expression level and the healthy body or benign brain tumor patient similarly measured Using the expression level of the (non-malignant control group) (control expression level), the subject suffers from a malignant brain tumor or suffers from a malignant brain tumor Ikoto the (whether suffering from malignant brain tumors) were evaluated in in vitro, and detecting the presence or absence of malignant brain tumors in a subject (presence or absence), provides methods for detecting a malignant brain tumor.
  • evaluation may be evaluation support based on the result of in vitro examination, instead of determination by a doctor.
  • miR-1909-3p is hsa-miR-1909-3p and miR-6869-5p is hsa-miR-6869-5p.
  • MiR-3178 is hsa-miR-3178
  • miR-4787-5p is hsa-miR-4787-5p
  • miR-6510-5p is hsa-miR-6510-5p
  • miR-4695-5p Is hsa-miR-4695-5p
  • miR-4634 is hsa-miR-4634
  • miR-4449 is hsa-miR-4449
  • miR-3195 is hsa-miR-3195
  • miR-6636 -3p is hsa-miR-6836-3p.
  • a nucleic acid capable of specifically binding to the target nucleic acid is represented by the following (a) to (the polynucleotide shown in e): (A) including a polynucleotide consisting of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more consecutive bases Its fragments, (B) a polynucleotide comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 10, (C) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 or a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence in which u is t in the nucleotide sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more A fragment thereof
  • a nucleic acid capable of specifically binding to the miR-187-5p polynucleotide can be further used.
  • miR-187-5p is hsa-miR-187-5p.
  • the nucleic acid capable of specifically binding to the miR-187-5p polynucleotide is a polynucleotide shown in the following (f) to (j): (F) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or a fragment thereof containing 15 or more consecutive bases; (G) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, (H) a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to the base sequence in which u is t in the base sequence, a variant thereof, a derivative thereof, or 15 or more consecutive bases Its fragments, including (I) a polynucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a base sequence complementary to a base sequence in which
  • Specimens used in the method of the present invention include biological tissues of a subject, body fluids such as blood, serum, plasma, urine and spinal fluid, preferably blood, serum, or plasma.
  • a specimen such as the biological tissue or body fluid may be directly used for the measurement of the expression level, or an RNA-containing nucleic acid sample prepared from the specimen and a sample containing a polynucleotide further prepared therefrom are used for the measurement. May be.
  • a subject refers to mammals such as, but not limited to, humans, monkeys, mice, rats, and the like, preferably humans.
  • the steps can be changed according to the type of specimen used as a measurement target.
  • RNA When RNA is used as a measurement target, detection of malignant brain tumor (cell) in a subject is, for example, the following steps (a), (b) and (c): (A) binding RNA prepared from a specimen of a subject or a complementary polynucleotide (cDNA) transcribed therefrom to a polynucleotide in the kit or device of the present invention; (B) RNA derived from a specimen bound to the polynucleotide or cDNA synthesized from the RNA by a hybridization technique using the polynucleotide as a nucleic acid probe, or by quantitative RT-PCR using the polynucleotide as a primer.
  • A binding RNA prepared from a specimen of a subject or a complementary polynucleotide (cDNA) transcribed therefrom to a polynucleotide in the kit or device of the present invention
  • B RNA derived from a specimen bound to the polynucleotide or
  • step (c) quantitatively or qualitatively measuring by determining the nucleotide sequence of the polynucleotide (said RNA or cDNA) with a sequencer, (C) detecting the presence or absence of malignant brain tumor (or change in gene expression level derived from malignant brain tumor) based on the measurement result of (b) above.
  • step (c) based on the measurement result of (b) above, it is evaluated whether or not the subject suffers from a malignant brain tumor compared to a healthy subject or a benign brain tumor patient (non-malignant control group), The presence or absence of a malignant brain tumor (or a change in gene expression level derived from a malignant brain tumor) in a subject may be detected.
  • step (a) the kit or device of the present invention after binding RNA or cDNA derived from a specimen is washed with a washing solution such as a buffer solution, and thereby unbound to the polynucleotide in the kit or device of the present invention. It is also preferable to further comprise removing the polynucleotide.
  • hybridization methods include, for example, Northern blotting, Southern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, in situ hybridization, Northern hybridization, Southern hybridization, sequencer, etc.
  • a technique for determining a base sequence can be used.
  • nucleic acid probes complementary strand radioisotopes (such as 32 P, 33 P, 35 S ) or a fluorescent substance labeled with a, subject organism it was transferred like a nylon membrane by a conventional method After hybridization with RNA derived from a specimen such as tissue or body fluid (blood, serum, plasma, etc.), a signal derived from the formed DNA / RNA double-stranded label (radioisotope or fluorescent substance) is radiated.
  • a method of detecting and measuring with a detector (such as BAS-1800II (Fuji Photo Film Co., Ltd.)) or a fluorescence detector (such as STORM 865 (GE Healthcare)) can be exemplified. .
  • RNA and its expression level can be detected and measured by using the above-mentioned primers that can be used in the present invention.
  • cDNA can be prepared according to a conventional method from RNA derived from a specimen such as a biological tissue or body fluid (blood, serum, plasma, etc.) of a specimen, and each target gene region can be amplified using this as a template.
  • a method of detecting a double-stranded DNA obtained by hybridizing a pair of primers of the present invention (consisting of a normal strand and a reverse strand that binds to the above cDNA) with cDNA and performing PCR by a conventional method Can be illustrated.
  • the above PCR is performed using a primer previously labeled with a radioisotope or a fluorescent substance, the PCR product is electrophoresed on an agarose gel, and then is detected with ethidium bromide or the like.
  • a method of detecting by staining the double-stranded DNA and a method of detecting the double-stranded DNA produced by transferring it to a nylon membrane or the like according to a conventional method and hybridizing with a labeled nucleic acid probe can be included.
  • RNA or its expression level can be detected or measured from the number of reads by using the above-described primer that can be used in the present invention.
  • a cDNA is prepared from a specimen-derived RNA such as a biological tissue or body fluid (blood, serum, plasma, etc.) of a subject according to a conventional method, and at least a part of the miR gene expression product that is a target nucleic acid is used as a template.
  • Primer pairs designed so that they can be amplified are hybridized with the cDNA, and nucleic acid amplification such as PCR is performed by a conventional method.
  • a method for detecting or measuring the amplified DNA with a sequencer can be exemplified.
  • the sequencer for example, HiSeq 2500 (Illumina) or Ion Proton (registered trademark) System (Thermo Fisher Scientific) can be used.
  • a sample such as a biological tissue or body fluid (blood, serum, plasma, etc.) of a subject is directly applied to a sequencer such as PacBio RS II (Pacific Biosciences) without nucleic acid amplification of RNA in the sample, and the target nucleic acid is applied.
  • a sequencer such as PacBio RS II (Pacific Biosciences) without nucleic acid amplification of RNA in the sample, and the target nucleic acid is applied.
  • a method of detecting or measuring is also exemplified.
  • RNA chip or DNA chip in which the nucleic acid probe (single strand or double strand) of the present invention is attached to a substrate (solid phase) is used.
  • the region where the nucleic acid probe is attached is called a probe spot, and the region where the nucleic acid probe is not attached is called a blank spot.
  • a gene group immobilized on a substrate generally has a name such as a nucleic acid chip, a nucleic acid array, or a microarray, and a DNA or RNA array includes a DNA or RNA macroarray and a DNA or RNA microarray.
  • the term “chip” includes all of them.
  • 3D-Gene registered trademark
  • Human miRNA Oligo chip Toray Industries, Inc.
  • the measurement of the DNA chip is not limited.
  • an image detector Teyphoon 9410 (GE Healthcare), 3D-Gene (registered trademark) scanner (Toray Industries, Inc.) or the like is used for the signal derived from the label of the nucleic acid probe)
  • the method of detecting and measuring can be illustrated.
  • stringent conditions refers to the extent to which a nucleic acid probe is larger than other sequences as described above (eg, average of background measurements + standard error of background measurements ⁇ 2 or more). In the measurement value) of the target sequence.
  • Stringent conditions are determined by hybridization and subsequent washing conditions.
  • the hybridization conditions are not limited, but for example, 30 to 60 ° C. and 1 to 24 hours in a solution containing SSC, surfactant, formamide, dextran sulfate, blocking agent and the like.
  • 1 ⁇ SSC is an aqueous solution (pH 7.0) containing 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate, and the surfactant includes SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton, or Tween.
  • More preferable hybridization conditions include 3 to 10 ⁇ SSC and 0.1 to 1% SDS.
  • Washing conditions after hybridization include, for example, a solution containing 0.5 ⁇ SSC at 30 ° C. and 0.1% SDS, and 0.2 at 30 ° C. There may be mentioned conditions such as continuous washing with a solution containing x SSC and 0.1% SDS and a 0.05 x SSC solution at 30 ° C. It is desirable that the complementary strand maintain a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • a complementary strand a strand consisting of a base sequence that is completely complementary to the target positive strand base sequence, and at least 80%, preferably at least 85%, more preferably, the strand. Examples include strands consisting of a base sequence having at least 90% or at least 95% identity, such as at least 98% or at least 99%.
  • Examples of conditions for performing PCR using the polynucleotide fragment for detecting malignant brain tumor in the kit of the present invention as a primer include, for example, 10 mM Tris-HCL (pH 8.3), 50 mM KCL, 1-2 mM MgCl 2 and the like.
  • treatment may be performed for 15 seconds to 1 minute at a Tm value calculated from the primer sequence +5 to 10 ° C.
  • the calculation of gene expression level is not limited, but for example, statistical analysis of gene expression microarray data (Speed T., Chapman and Hall / CRC), and n'begin.
  • the statistical processing described in Microarray gene expression data analysis can be used in the present invention.
  • a spot can be regarded as a detection spot.
  • the average value of the measured value of the blank spot can be regarded as the background, and can be subtracted from the measured value of the probe spot to obtain the gene expression level.
  • the missing value of the gene expression level is excluded from the analysis target, preferably replaced with the minimum value of the gene expression level in each DNA chip, or more preferably 0.1 from the logarithmic value of the minimum value of the gene expression level. Can be replaced with the subtracted value.
  • the number of samples to be measured is 20% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more, 2 6, preferably 2 8, more preferably 2 Only genes having a gene expression level of the 10th power or higher can be selected as an analysis target. Normalization of gene expression level (normalization) is not limited.
  • the present invention also uses the polynucleotide, kit, device (eg, chip), or a combination thereof for detecting a malignant brain tumor of the present invention to measure the expression level of a target gene in a specimen derived from a subject,
  • a malignant brain tumor and a healthy or benign brain tumor were created using the gene expression level of a sample from a subject (or patient) known to have and the gene expression level of a sample from a healthy or benign brain tumor patient as a teacher sample.
  • the expression level of the target gene in the specimen derived from the subject is substituted into a discriminant (discriminant function) that can be discriminately distinguished from each other, thereby evaluating the presence or absence of a malignant brain tumor
  • a discriminant discriminant function
  • the present invention is further known that a subject includes a malignant brain tumor and / or does not include a malignant brain tumor using the detection polynucleotide, kit, device (eg, chip), or combination thereof of the present invention.
  • a first step of measuring the expression level of a target gene (target nucleic acid) in a plurality of specimens in vitro, and using the measured value of the expression level of the target gene obtained in the first step as a teacher sample The second step of creating the formula, the third step of measuring the expression level of the target gene in the specimen derived from the subject in vitro in the same manner as the first step, and the discrimination obtained in the second step Substituting the measured value of the expression level of the target gene obtained in the third step into the formula, and based on the result obtained from the discriminant formula, the subject contains a malignant brain tumor,
  • the discriminant is an arbitrary discriminant analysis method capable of creating a discriminant for discriminating between malignant brain tumor and healthy, for example, Fisher discriminant analysis, nonlinear discriminant analysis by Mahalanobis distance, neural network, Although it can create using Support Vector Machine (SVM) etc., it is not limited to these specific examples.
  • SVM Support Vector Machine
  • Linear discriminant analysis is a method for discriminating group membership using Equation 1 as a discriminant when the boundary of grouping is a straight line or a hyperplane.
  • x is an explanatory variable
  • w is a coefficient of the explanatory variable
  • w 0 is a constant term.
  • the value obtained by the discriminant is called a discriminant score, and the measured value of a newly given data set is substituted into the discriminant as an explanatory variable, and the grouping can be discriminated by the code of the discriminant score.
  • Fisher's discriminant analysis which is a type of linear discriminant analysis, is a dimension reduction method for selecting a dimension suitable for class discrimination. Focusing on the variance of composite variables, the data with the same label is used. Combining highly discriminating synthetic variables by minimizing the variance (Venables, WN et al., Modern Applied Statistics with S. Fourth edition. Springer., 2002). In Fisher's discriminant analysis, a projection direction w that maximizes Equation 2 is obtained.
  • ⁇ is the average of inputs
  • ng is the number of data belonging to class g
  • ⁇ g is the average of inputs of data belonging to class g.
  • the numerator and denominator are the inter-class variance and intra-class variance when the data is projected in the direction of the vector w, respectively, and the discriminant coefficient w i is obtained by maximizing this ratio (written by Kanamori Takafumi et al., “ Pattern recognition ", Kyoritsu Shuppan (2009), Richard O. et al., Pattern Classification Second Edition, Wiley-Interscience, 2000).
  • the Mahalanobis distance is calculated by Equation 3 in consideration of data correlation, and can be used as a nonlinear discriminant analysis for discriminating a group having a close Mahalanobis distance from each group as a belonging group.
  • ⁇ is the center vector of each group
  • S ⁇ 1 is the inverse matrix of the variance-covariance matrix of that group.
  • the center vector is calculated from the explanatory variable x, and an average vector or a median vector can be used.
  • a boundary surface called a hyperplane is used to correctly classify the data set into a known grouping, with specific data items in the data set with a known grouping as explanatory variables and the grouping to be classified as an objective variable. And determine a discriminant for classifying data using the boundary surface.
  • the discriminant can determine the grouping by substituting the measured value of the newly given data set into the discriminant as an explanatory variable. Further, the discrimination result at this time may be a group to be classified, may be a probability of being classified into a group to be classified, or may be a distance from a hyperplane.
  • a method for dealing with a non-linear problem a method is known in which a feature vector is non-linearly transformed into a higher dimension and linear identification is performed in the space.
  • An expression in which the inner product of two elements in a non-linearly mapped space is expressed only by the input in the original space is called a kernel.
  • a kernel a linear kernel, RBF (Radial Basis Function) Kernel and Gaussian kernel.
  • the optimal discriminant that is, the discriminant, can be constructed only by calculating the kernel while avoiding the calculation of the features in the mapped space while actually mapping in high dimensions by the kernel (for example, Hideki Aso et al. Frontier 6 of Statistical Science, “Statistics of Pattern Recognition and Learning: New Concepts and Methods,” Iwanami Shoten (2004), Nero Christianiani et al., SVM Introduction, Kyoritsu Publishing (2008)).
  • C-support vector classification (C-SVC), a kind of SVM method, creates a hyperplane by learning with two explanatory variables to determine which group an unknown data set falls into (C. Cortes et al., 1995, Machine Learning, 20, p 273-297).
  • C-SVC discriminant An example of calculating a C-SVC discriminant that can be used in the method of the present invention is shown below.
  • all subjects are divided into two groups: malignant brain tumor patients and healthy subjects.
  • brain imaging can be used.
  • a data set (hereinafter referred to as “learning sample group”) composed of comprehensive gene expression levels of the two groups of serum-derived specimens is prepared, and there is a clear difference in gene expression levels between the two groups.
  • the discriminant by C-SVC is determined with the gene as the explanatory variable and the grouping as the target variable (eg, -1 and +1).
  • Equation 4 is an objective function to be optimized, where e is all input vectors, y is an objective variable, a is a Lagrange undetermined multiplier vector, Q is a positive definite matrix, and C is a parameter for adjusting the constraint condition.
  • Equation 5 is the discriminant finally obtained, and the group to which it belongs can be determined by the sign of the value obtained by the discriminant.
  • x is a support vector
  • y is a label indicating group membership
  • a is a corresponding coefficient
  • b is a constant term
  • K is a kernel function.
  • Equation 6 the RBF kernel defined by Equation 6 can be used.
  • x represents a support vector
  • ⁇ represents a kernel parameter that adjusts the complexity of the hyperplane.
  • a subject determines or evaluate whether a subject contains or does not contain a malignant brain tumor, or evaluate the expression level of a target gene derived from a malignant brain tumor in a subject-derived specimen in comparison with a control derived from a healthy subject
  • a neural network a k-neighbor method, a decision tree, a logistic regression analysis, or the like can be selected.
  • the method of the present invention comprises, for example, the following steps (a), (b) and (c): (A) The expression level of a target gene (target nucleic acid) in a specimen already known to be derived from a malignant brain tumor patient and from a benign brain tumor patient that does not include a healthy body or malignant brain tumor is determined according to the present invention.
  • A The expression level of a target gene (target nucleic acid) in a specimen already known to be derived from a malignant brain tumor patient and from a benign brain tumor patient that does not include a healthy body or malignant brain tumor is determined according to the present invention.
  • a polynucleotide, kit or device eg, a DNA chip
  • x in the formulas 1 to 3, 5 and 6 is an explanatory variable, and a value obtained by measuring a polynucleotide selected from the polynucleotides described in Section 2 above or a fragment thereof, and the like.
  • the explanatory variable for discriminating between the malignant brain tumor patient and the healthy or benign brain tumor patient of the present invention is, for example, the gene expression level selected from the following (1) to (2).
  • (1) A malignant brain tumor patient measured by any one of the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1 to 10 or a polynucleotide such as DNA containing 15 or more consecutive bases contained in the complementary nucleotide sequence Gene expression levels in sera of healthy, healthy, and benign brain tumor patients.
  • a malignant brain tumor patient a healthy body, which is measured by any one of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a polynucleotide such as DNA containing 15 or more consecutive bases contained in a complementary base sequence, and Gene expression level in serum of patients with benign brain tumor.
  • the creation of a discriminant requires a discriminant created from a learning sample group. Yes, in order to increase the discrimination accuracy of the discriminant, between the two groups consisting of the malignant brain tumor patient group and the healthy body group in the learning sample group, or between the two groups consisting of the malignant brain tumor patient group and the benign brain tumor patient group It is necessary to use a gene with a clear difference in expression level in the discriminant.
  • the gene used as the explanatory variable of the discriminant is determined as follows.
  • the comprehensive gene expression level of the malignant brain tumor patient group, which is the learning specimen group, and the exhaustive gene expression level of the healthy body group are used as a data set, and the P value of the t-test which is parametric analysis, Mann ⁇ which is non-parametric analysis
  • Mann ⁇ which is non-parametric analysis
  • Bonferroni correction for example, by multiplying the P value obtained by the test by the number of test repetitions, that is, the number of genes used in the analysis, and comparing it with the desired significance level, the first type of error in the entire test is obtained. Probability of occurrence can be suppressed.
  • the absolute value of the median expression ratio (Fold change) of each gene expression level is calculated between the gene expression level of the malignant brain tumor patient group and the gene expression level of the healthy group instead of the test, and the discriminant formula
  • the gene used for the explanatory variable may be selected.
  • the ROC curve may be created using the gene expression levels of the malignant brain tumor patient group and the healthy body group, and the gene used for the explanatory variable of the discriminant may be selected based on the AUROC value.
  • a discriminant that can be calculated by the above-described various methods is created using an arbitrary number of genes having a large difference in gene expression level obtained here.
  • a method of constructing a discriminant that obtains the maximum discriminating accuracy for example, a method of constructing a discriminant with any combination of genes satisfying the significance level of the P value, or a gene used to create a discriminant, gene expression There is a method in which evaluation is repeated while increasing one by one in descending order of quantity difference (Furey TS. Et al., 2000, Bioinformatics, Vol. 16, p906-14).
  • the gene expression level of another independent malignant brain tumor patient or healthy body is substituted into the explanatory variable, and the discrimination result of the group belonging to this independent malignant brain tumor patient or healthy body is calculated. That is, the diagnostic gene set and malignant that can detect more universal malignant brain tumors by evaluating the discriminant constructed using the found diagnostic gene set and the diagnostic gene set with independent specimen groups A method for discriminating brain tumors can be found.
  • the Split-sample method for evaluating the discriminating performance (generalization) of the discriminant In other words, the data set is divided into a learning sample group and a verification sample group, the gene selection and the discriminant creation by statistical test are performed in the learning sample group, and the verification sample group is discriminated by the discriminant formula and the verification sample group The accuracy, sensitivity, and specificity are calculated using the true group to which the belongs, and the discrimination performance is evaluated.
  • the gene selection and discriminant formula are created by statistical test using all the samples, and the newly prepared sample is discriminated by the discriminant to improve accuracy, sensitivity, and specificity. It is also possible to calculate and evaluate the discrimination performance.
  • any combination further including one or two or more of the above-described polynucleotides based on the complementary sequence thereof is defined as a diagnostic gene set.
  • a discriminant is constructed by using the expression level of the diagnostic gene set in a specimen derived from a patient whose diagnosis result of image examination or tissue diagnosis is a malignant brain tumor and a specimen derived from a benign brain tumor patient or a healthy body. As a result, by measuring the expression level of the diagnostic gene set of an unknown specimen, it is possible to distinguish with high accuracy and sensitivity that the subject from which the unknown specimen is derived contains a malignant brain tumor or does not contain a malignant brain tumor. Can do.
  • glioma astrocytoma, oligodendroglioma, oligodendroglioma
  • glioma as malignant brain tumor patients with no primary cancer other than the brain Human (7 grade II, 13 grade III, 29 grade IV) and 7 meningioma patients as benign brain tumor patients were collected using Venoject II vacuum blood collection tube VP-AS109K60 (Terumo Corporation)
  • the obtained serum samples were used as a verification sample group.
  • RNA extraction was obtained from 300 ⁇ L of serum obtained from a total of 318 patients including 150 healthy subjects, 147 patients with malignant brain tumors, and 21 patients with benign brain tumors. Using the RNA extraction reagent in the reagent from liquid sample kit (Toray Industries, Inc.), total RNA was obtained according to the protocol specified by the company.
  • RNA was fluorescently labeled based on the protocol (ver 2.20) defined by the company.
  • 3D-Gene (registered trademark) Human miRNA Oligo chip As an oligo DNA chip, 3D-Gene (registered trademark) Human miRNA Oligo chip (Toray Industries, Inc.) equipped with a probe having a sequence complementary to 2,565 kinds of miRNAs among miRNAs registered in miRBBase release 21 ), Hybridization of miRNA in total RNA with the probe on the DNA chip and washing after hybridization were performed under stringent conditions based on the protocol established by the company. The DNA chip was scanned using a 3D-Gene (registered trademark) scanner (Toray Industries, Inc.), an image was acquired, and the fluorescence intensity was digitized with 3D-Gene (registered trademark) Extraction (Toray Industries, Inc.).
  • 3D-Gene registered trademark Human miRNA Oligo chip
  • the digitized fluorescence intensity is converted into a logarithmic value with a base of 2 to obtain the gene expression level, and the blank value is subtracted.
  • the missing value is 0.1 from the logarithmic value of the minimum value of the gene expression level in each DNA chip. Replaced with the value obtained by subtracting.
  • R language 3.0.2 R Development Core Team (2013). R: A language and environment for static computing.
  • Example 1 Selection of genetic markers using samples from the learning sample group and evaluation method for brain tumor discrimination performance of single genetic markers using samples from the verification sample group>
  • gene markers for distinguishing malignant brain tumor patients from benign brain tumor patients and healthy subjects are selected from the learning sample group, and each selected gene marker is selected in the sample of the verification sample group independent of the learning sample group.
  • a method to evaluate the ability to discriminate a single malignant brain tumor was examined.
  • the miRNA expression levels of the learning sample group and the verification sample group obtained in Reference Example 1 were first normalized. Normalization is based on the average expression level and the reference value of the three endogenous miRNA controls (hsa-miR-2861, hsa-miR-149-3p, and hsa-miR-4463) on the DNA chip for each specimen. Pre-set value) was obtained, and the ratio was reflected in the detection values of all miRNAs for each sample. This technique is described in A.D. Shimomura et al., 2016, Cancer Sci, DOI: 10.1111.
  • a diagnostic gene was selected using a group of learning samples.
  • 50% or more of the specimens in the malignant brain tumor patient group of the learning specimen group and the group including the benign brain tumor patient and the healthy body are the second power of 2 Only genes having the above gene expression levels were selected.
  • the P value obtained by a two-sided t-test assuming equal variance for each gene expression level is Bonferroni-corrected genes that satisfy p ⁇ 0.01 were obtained as genetic markers used as explanatory variables in the discriminant, and are listed in Table 2.
  • Table 4 shows the discriminant coefficient a and the constant term b at that time.
  • the accuracy, sensitivity, and specificity in the verification sample group were calculated using the discriminant created above, and the discrimination performance of the selected polynucleotide was verified with an independent sample (Table 3).
  • Table 3 For example, when the measured expression level of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is compared between a malignant brain tumor patient (98 people), a benign brain tumor patient (14 people), and a healthy body (100 people) in the learning sample group It was shown that the gene expression level measurement value of the malignant brain tumor patient group was significantly lower than that of the benign brain tumor patient and the healthy body group (see the left side of FIG. 2). And benign brain tumor patients (7 people) and healthy subjects (50 people) (see FIG. 2 right).
  • the measured value of gene expression in the malignant brain tumor patient group was significantly lower ( ⁇ ) or higher (+) than the benign brain tumor patient and the healthy body group (Table 2) was obtained, and these results could be verified in the verification sample group.
  • the discriminant coefficient (3.058) and constant term (26.421) shown in Table 4 are used to discriminate the presence or absence of malignant brain tumor in the learning sample group.
  • Polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 11 have sensitivity of 84%, 84%, 84%, 80%, 76%, 84%, 74%, 76%, 84%, respectively, in the verification sample group. 71% was indicated (Table 3). These polynucleotides alone could prove malignant brain tumors with high sensitivity exceeding 70%.
  • Example 2 ⁇ Evaluation method of brain tumor discrimination performance by combination of multiple genetic markers using test sample group> In this example, a method for evaluating the ability to discriminate malignant brain tumors by combining the genetic markers selected in Example 1 was examined.
  • Example 2 the miRNA expression levels of the learning sample group and the verification sample group obtained in Reference Example 1 were normalized.
  • a combination 550 of expression level measurement values of 2 to 4 polynucleotides out of the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11 corresponding to 11 genes selected in Example 1 Fisher's discriminant analysis is performed on the learning sample group for the street, and a discriminant “z a1 ⁇ (expression amount of gene 1) + a2 ⁇ (expression amount of gene 2) + a3 ⁇ (gene 3) is determined to determine the presence or absence of malignant brain tumor.
  • Expression level + a4 ⁇ (expression level of gene 4) + b ”(Table 5).
  • Table 5 The calculated accuracy, sensitivity, and specificity are shown in Table 6.
  • the discrimination performance was verified with an independent sample by calculating the accuracy, sensitivity, and specificity in the verification sample group using the created discriminant.
  • the measured expression level of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is described in Table 5 based on the discriminant created to discriminate the presence or absence of malignant brain tumor in the learning sample group
  • the discriminant score is calculated using the discriminant coefficient (SEQ ID NO: 1.-1.952, SEQ ID NO: 2: -1.071) and the constant term (-30.844), and samples with a score greater than 0 are determined as malignant brain tumors.
  • the discrimination performance was calculated for all combinations of the expression level measurement values of 2 to 4 polynucleotides among the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11. Of all 550 combinations (Table 6), it was shown that there were 486 combinations showing sensitivity exceeding the discrimination performance with a single genetic marker.
  • SEQ ID NO: indicates a combination of a plurality of used polynucleotides by SEQ ID NO (the same applies to the tables described later in this application).
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 3, And SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 3,
  • a marker for detecting a brain tumor is obtained.
  • the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11 selected in Example 1 were ranked in descending order of P values indicating statistical significance, and one was added from the top miRNA.
  • the discrimination performance was calculated using a combination of one or a plurality of miRNAs.
  • the sensitivity in the verification sample group was 84% for one miRNA, 92% for two miRNAs, 94% for three miRNAs, and 94% for five miRNAs. Since the combination of a plurality of miRNAs is higher than the sensitivity of one miRNA, it was shown that a combination of a plurality of miRNAs can be an excellent marker for detecting a malignant brain tumor.
  • the combination of a plurality of miRNAs is not limited to the case of adding in the order of statistical significance as described above, and any combination of a plurality of miRNAs can be used for detection of a malignant brain tumor.
  • Example 3 ⁇ Evaluation method of discrimination performance of other malignant brain tumor specimens by combining multiple genetic markers using a specimen group>
  • a combination of expression level measurement values of 1 to 4 polynucleotides among the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11 in the learning group was used. Then, a threshold value or discriminant was constructed, and the discriminating performance was evaluated by the same method as described in Examples 1 and 2 for the verification sample group described in Reference Example 2.
  • the miRNA expression levels of the learning sample group obtained in Reference Example 1 and the verification sample group obtained in Reference Example 2 were first normalized. Normalization is based on the average expression level and the reference value of the three endogenous miRNA controls (hsa-miR-2861, hsa-miR-149-3p, and hsa-miR-4463) on the DNA chip for each specimen. Pre-set value) was obtained, and the ratio was reflected in the detection values of all miRNAs for each sample. This technique is described in A.D. Shimomura et al., 2016, Cancer Sci, DOI: 10.1111.
  • the measured expression level of the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 is described in Table 5 based on the discriminant created to discriminate the presence or absence of malignant brain tumor in the learning sample group
  • the discriminant score is calculated using the discriminant coefficient (SEQ ID NO: 1.-1.952, SEQ ID NO: 2: -1.071) and the constant term (-30.844), and samples with a score greater than 0 are determined as malignant brain tumors.
  • the correctness of malignant brain tumor detection was calculated using the discriminant constructed in the learning sample group, 43 true positives, 8 false negatives, From these values, a sensitivity of 84% was obtained as discrimination performance.
  • the sensitivity of the learning sample group was 87%.
  • the discrimination performance was calculated for all combinations of the expression level measurement values of 1 to 4 polynucleotides among the polynucleotides consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the combinations 561, 514 exceeded the sensitivity of the polynucleotide of SEQ ID NO: 11 alone showing the minimum discrimination performance in Examples 1 and 2 with a sensitivity of 71%, and malignant brain tumors (astrocytoma, It was shown that not only oligodendroglioma and oligodendroglial astrocytoma) but also central nervous system primary malignant lymphoma, ependymoma, ganglion glioma and ciliary cell astrocytoma can be detected (discriminated).
  • Examples of the number include, but are not limited to, 1, 2, 3, 4, 5, or more.
  • the combination of two or more of the above polynucleotides showed a discrimination accuracy of 90% or more.
  • any of the above malignant brain tumors other than glioma (astrocytoma, oligodendroma, oligodendroglioma) in the test sample group is a malignant brain tumor.
  • glioma astrocytoma, oligodendroma, oligodendroglioma
  • a malignant brain tumor patient can be discriminated not only from a healthy body but also from a benign brain tumor patient. This makes it possible to make an early clinical decision regarding the removal of the cancerous part by surgery, and as a result, it is possible to improve the 5-year survival rate and reduce the recurrence rate.
  • a malignant brain tumor can be effectively detected by a simple and inexpensive method, early detection, diagnosis and treatment of the malignant brain tumor can be performed. Further, according to the method of the present invention, a malignant brain tumor can be detected in a minimally invasive manner using patient blood, so that a malignant brain tumor can be detected easily and quickly.

Abstract

本発明は、悪性脳腫瘍の検出用キット又はデバイス、並びに、検出方法を提供する。本発明は、被験体の検体中の所定のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む、悪性脳腫瘍検出用キット又はデバイス、並びに、該ｍｉＲＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定することを含む、悪性脳腫瘍を検出する方法に関する。

Description

悪性脳腫瘍の検出キット又はデバイス及び検出方法
　本発明は、被験体において悪性脳腫瘍への罹患の有無の検査のために使用される、特定のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む悪性脳腫瘍の検出用キット又はデバイス、及び当該核酸を用いて当該ｍｉＲＮＡの発現量を測定することを含む悪性脳腫瘍の検出方法に関する。
　脳腫瘍は、脳組織自体から発生した原発性脳腫瘍と、他の臓器のがんが脳へ転移した転移性脳腫瘍に分けられる。原発性脳腫瘍は良性と悪性に分けられ、その起源となる細胞型によって細分類される。
　原発性脳腫瘍は主に、神経膠腫（悪性）、中枢神経系原発悪性リンパ腫（悪性）、髄膜腫（主に良性）、下垂体腺腫（良性）、神経鞘腫（良性）、先天性腫瘍などに分類され、神経膠腫が全体の28%を占める。神経膠腫は腫瘍を構成する細胞の形態からさらに、星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、上衣腫、神経節神経膠腫などに分類される。
　国立研究開発法人国立がん研究センターがん対策情報センター（日本）が報告する２０１４年の日本国内における部位別のがん死亡率の統計によると、脳・中枢神経系のがんの死亡数は２，３０２人であり、２０１３年の部位別がん死亡率では男性で２．０％、女性で１．５％を占める。このように脳腫瘍はがん全体で考えると、がんの患者１００人のうち５人以下と発生率は低いものの、子どものがん患者だけで考えると、脳腫瘍は白血病の次に多く、子どものがん患者の５人に１人と若年層での罹患が多くなっている。
　ＵＩＣＣ（国際対がん連合；Ｕｎｉｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｉｓ　Ｃｏｎｔｒａ　Ｃａｎｃｒｕｍ）「ＴＮＭ悪性腫瘍の分類」第６版においては、脳腫瘍の病期分類（ＴＮＭ）は規定されていない。脳腫瘍の悪性度は２００７年のＷＨＯ分類によりグレードＩ～ＩＶに分類される。
　脳腫瘍における有用な血液マーカーは存在しない。通常、脳腫瘍は、頭痛、嘔吐、麻痺、失語・構音障害、意識障害などの自覚症状を訴える患者や軽微な頭部外傷の画像検査、脳ドックのような健康診断における画像検査などにより発見される。画像診断では、ＣＴ、ＭＲＩ、脳血管造影などが利用される。画像診断によって脳腫瘍が発見された場合には、開頭手術により腫瘍を摘出し、摘出した組織を用いて、病理診断を行う。現時点では悪性脳腫瘍を血液中のマーカーで発見するための腫瘍マーカーは、臨床現場において普及していない。
　一方、また研究段階ではあるが血液をはじめとする生体サンプル中のｍｉＲＮＡの発現量を用いて脳腫瘍を治療・診断する方法が下記のようにあるが、実用化に至ってはいない。
　特許文献１では、ヒトの神経膠芽腫幹細胞と正常神経幹細胞間で発現量に差があるｍｉＲＮＡを用いて脳腫瘍を含むがんを治療・診断する方法が記載されている。しかしながら、特許文献１には、細胞でのｍｉＲＮＡ発現量の変化データが記載されているに留まっている。脳細胞を検体として入手することは患者に与える肉体的負担が重いため、脳細胞を検体とする検査方法は好ましくない。また、特許文献１に記載の診断方法に関しては、脳腫瘍を判別する具体的な精度、感度、特異度などの判別性能、手段についての記載が無く、産業的実用性に乏しい。
米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／００８８１７０
　本発明の課題は、新規な悪性脳腫瘍マーカー、及び悪性脳腫瘍を効果的に検出できる方法を提供することである。
　上記のように、悪性脳腫瘍の検出において、既存の腫瘍マーカーは存在せず、また研究段階のマーカーについては性能や検出の方法が具体的に示されていないため、これらを利用した場合には、健常体を悪性脳腫瘍患者と誤検出することによる無駄な追加検査の実施や、悪性脳腫瘍患者を見落とすことによる治療機会の逸失がおこる可能性がある。また、腫瘍マーカーを測定するための脳組織採取には開頭手術に伴うリスクがあり、患者に与える侵襲性が高く好ましくないため、低侵襲に採取できる血液を用いた簡便かつ精度の高い非侵襲的診断マーカーの開発は臨床的に重要である。特に、予後の悪い悪性脳腫瘍の早期発見・早期治療は治療成績向上のブレイクスルーとなることが期待される。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、低侵襲に採取できる血液から悪性脳腫瘍の検出マーカーに使用可能な複数の遺伝子（ｍｉＲＮＡ）を見出し、これに特異的に結合可能な核酸を用いることにより、悪性脳腫瘍を有意に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸を含む、悪性脳腫瘍の検出用キット。
（２）ｍｉＲ－１９０９－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐであり、ｍｉＲ－６８６９－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐであり、ｍｉＲ－３１７８がｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８であり、ｍｉＲ－４７８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐであり、ｍｉＲ－６５１０－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐであり、ｍｉＲ－４６９５－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐであり、ｍｉＲ－４６３４がｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４であり、ｍｉＲ－４４４９がｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９であり、ｍｉＲ－３１９５がｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５であり、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐである、（１）に記載のキット。
（３）前記核酸が、下記の（ａ）～（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（１）又は（２）に記載のキット。
（４）前記キットが、別の悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸をさらに含む、（１）～（３）のいずれかに記載のキット。
（５）ｍｉＲ－１８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐである、（４）に記載のキット。
（６）ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸が、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（４）又は（５）に記載のキット。
（７）悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸を含む、悪性脳腫瘍の検出用デバイス。
（８）ｍｉＲ－１９０９－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐであり、ｍｉＲ－６８６９－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐであり、ｍｉＲ－３１７８がｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８であり、ｍｉＲ－４７８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐであり、ｍｉＲ－６５１０－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐであり、ｍｉＲ－４６９５－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐであり、ｍｉＲ－４６３４がｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４であり、ｍｉＲ－４４４９がｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９であり、ｍｉＲ－３１９５がｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５であり、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐである、（７）に記載のデバイス。
（９）前記核酸が、下記の（ａ）～（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（７）又は（８）に記載のデバイス。
（１０）前記デバイスが、別の悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸をさらに含む、（７）～（９）のいずれかに記載のデバイス。
（１１）ｍｉＲ－１８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐである、（１０）に記載のデバイス。
（１２）ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸が、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（１０）又は（１１）に記載のデバイス。
（１３）前記デバイスが、ハイブリダイゼーション技術による測定のためのデバイスである、（７）～（１２）のいずれかに記載のデバイス。
（１４）前記ハイブリダイゼーション技術が、核酸アレイ技術である、（１３）に記載のデバイス。
（１５）（１）～（６）のいずれかに記載のキット又は（７）～（１４）のいずれかに記載のデバイスを用いて、被験体の検体における標的核酸の発現量を測定し、該測定された発現量と、同様に測定された健常体又は良性脳腫瘍患者の対照発現量とを用いて、被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かを評価し、被験体における悪性脳腫瘍の有無を検出することを含む、悪性脳腫瘍の検出方法。
（１６）（１）～（６）のいずれかに記載のキット又は（７）～（１４）のいずれかに記載のデバイスを用いて被験体の検体における標的遺伝子の発現量を測定し、悪性脳腫瘍を有することが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量と健常体又は良性脳腫瘍患者由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつ悪性脳腫瘍と健常又は良性脳腫瘍とを区別的に判別することが可能である判別式に、上記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、悪性脳腫瘍の存在又は不存在を評価することを含む、被験体における悪性脳腫瘍の検出方法。
（１７）前記被験体が、ヒトである、（１５）又は（１６）に記載の方法。
（１８）前記検体が、血液、血清又は血漿である、（１５）～（１７）のいずれかに記載の方法。
＜用語の定義＞
　本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
　本明細書において「悪性脳腫瘍」とは、脳において形成される任意の悪性腫瘍をいう。具体的には、悪性脳腫瘍には、神経膠腫及び中枢神経系原発悪性リンパ腫などが含まれる。
　本明細書において「脳の良性腫瘍」とは、脳において形成される任意の良性の腫瘍をいう。脳の良性腫瘍としては、特に限定されないが、典型例として良性の髄膜腫が挙げられる。
　ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用法に従うものとする。
　本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）のいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、非コーディング（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。本明細書において「合成ＤＮＡ」及び「合成ＲＮＡ」は、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい。）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製されたＤＮＡ及びＲＮＡをいう。本明細書において「非天然型配列」は、広義の意味に用いることを意図しており、天然型配列と異なる、例えば１以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加を含む配列（すなわち、変異配列）、１以上の修飾ヌクレオチドを含む配列（すなわち、修飾配列）、などを包含する。また、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」と互換的に使用される。
　本明細書において「断片」とは、ポリヌクレオチドの連続した一部分の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１９塩基以上の長さを有することが望ましい。
　本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
　従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）（例えばｃＤＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びこれらの断片、並びに転写産物のいずれも含む。また当該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ若しくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」を包含する。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１～３９のいずれかで表される塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる小胞に内包された状態にあってもよい。
　本明細書において「エキソソーム」（別称「エクソソーム」）とは、細胞から分泌される脂質二重膜に包まれた小胞である。エキソソームは多胞エンドソームに由来し、細胞外環境に放出される際にＲＮＡ、ＤＮＡ等の「遺伝子」やタンパク質などの生体物質を内部に含むことがある。エキソソームは血液、血清、血漿、血清、リンパ液等の体液に含まれることが知られている。
　本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３’末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端に至るまでの全配列が含まれる。本明細書における「転写産物」はまた、文脈上異なる場合を除き、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ前駆体）から生成されたＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）も含む。
　また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ　ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する、１５～２５塩基の非コーディングＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡ）を主として意図して用いられる。また本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は、文脈上、成熟ｍｉＲＮＡのみを指している場合を除き、特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、当該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、及びこれらと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ若しくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１～３９のいずれかで表される特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。さらにまた、本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子（ｍｉＲＮＡ前駆体をコードする遺伝子）の遺伝子産物であってもよく、そのような遺伝子産物は、成熟ｍｉＲＮＡ（例えば、上記のようなｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基、又は１９～２５塩基、の非コーディングＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ前駆体（例えば、前記のようなｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を包含する。
　本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
　本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
　ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１～３９のいずれかによって定義される塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチドの全長配列又はその部分配列に対して、Ａ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。また配列番号１～３９のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に「相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド」という記載も基本的に同様に理解される。
　本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、核酸プローブやプライマー等のポリヌクレオチドが他の配列に対するよりも大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、核酸プローブ等のポリヌクレオチドに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。「ストリンジェントな条件」の具体例は、後述する。
　本明細書において「Ｔｍ値」とは、ポリヌクレオチドの二本鎖部分が一本鎖へと変性し、二本鎖と一本鎖が１：１の比で存在する温度を意味する。
　本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、あるいは配列番号１～３９のいずれかの塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上（例えば１～数個）の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは当該塩基配列の全長配列又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す塩基配列からなるポリヌクレオチド変異体、あるいは当該塩基配列の全長配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。
　本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
　本明細書において、ポリヌクレオチドの変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用した突然変異導入法などの周知の技術を用いて作製可能である。
　本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｚｈｅｎｇ　Ｚｈａｎｇら、２０００年、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、７巻、ｐ２０３－２１４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ４０３－４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ２４４４－２４４８）。
　本明細書において「誘導体」とは、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、ｐ１４９７－５００）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら，１９９８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、３９巻、ｐ５４０１－５４０４）などを含む核酸を意味する。
　本明細書において、上記の悪性脳腫瘍マーカーであるｍｉＲＮＡの群から選択されるポリヌクレオチドと特異的に結合可能な「核酸」は、合成又は調製された核酸であり、具体的には「核酸プローブ」又は「プライマー」を含み、被験体中の悪性脳腫瘍の存在の有無を検出するために、又は悪性脳腫瘍の罹患の有無、罹患の程度、悪性脳腫瘍の改善の有無や改善の程度、悪性脳腫瘍の治療に対する感受性を診断するために、あるいは悪性脳腫瘍の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用される。これらには悪性脳腫瘍の罹患に関連して生体内、特に血液、尿等の体液等の検体において配列番号１～３９のいずれかで表される転写産物（ポリヌクレオチド）又はそのｃＤＮＡ合成核酸を特異的に認識し結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
　本明細書で使用する「検出」という用語は、検査、測定、検出、判別、又は、判定支援という用語で置換しうる。また、本明細書において「評価」という用語は、検査結果又は測定結果に基づいて診断又は評価を支援することを含む意味で使用される。
　本明細書で使用される「被験体」は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される動物などの哺乳動物を意味する。好ましい被験体は、ヒトである。悪性脳腫瘍又は良性脳腫瘍等の疾患に罹患した「被験体」を「患者」と称することがある。また、「健常体」もまた、このような哺乳動物であって、検出しようとするがんに罹患していない動物を意味する。好ましい健常体は、ヒトである。
　本明細書で使用される「Ｐ」又は「Ｐ値」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「Ｐ」又は「Ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。
　本明細書において、「感度」は、（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陰性の数）の割合を意味する。感度が高ければ悪性脳腫瘍を早期に発見することが可能となり、完全ながん部の切除や再発率の低下につながる。
　本明細書において、「特異度」は、（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陽性の数）の割合を意味する。特異度が高ければ健常体を悪性脳腫瘍患者と誤判別することによる無駄な追加検査の実施を防ぎ、患者の負担の軽減や医療費の削減につながる。
　本明細書において、「精度」は、（真陽性の数＋真陰性の数）／（全症例数）の割合を意味する。精度は全検体に対しての判別結果が正しかった割合を示しており、判別性能（検出性能）を評価する第一の指標となる。
　本明細書において判定、検出又は診断等の対象となる「検体」とは、悪性脳腫瘍の発生、悪性脳腫瘍の進行、又は悪性脳腫瘍に対する治療効果の発揮にともない本発明の遺伝子の発現が変化する組織及び生体材料を指す。具体的には脳組織及びその周辺の血管、髄膜、転移が疑われる臓器、皮膚、並びに血液、尿、髄液、唾液、汗、組織浸出液などの体液、血液から調製された血清、血漿、及びその他、便、毛髪などを指す。更にこれらの検体から抽出された生体試料、具体的にはＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの遺伝子を用いる場合も上記検体を用いた判定、検出又は診断等に含まれる。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ」という用語は、配列番号１に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００７８８３）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ遺伝子は、Ｂａｒ　Ｍら、２００８年、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、２６巻、ｐ２４９６－２５０５に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－１９０９」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ０００８３３０、配列番号１２）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ」という用語は、配列番号２に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２７６３８）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ遺伝子は、Ｌａｄｅｗｉｇ　Ｅら、２０１２年、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ、２２巻、ｐ１６３４－１６４５に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－６８６９」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００２２７１６、配列番号１３）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８」という用語は、配列番号３に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１５０５５）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８遺伝子は、Ｓｔａｒｋ　ＭＳら、２０１０年、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ、５巻、ｅ９６８５に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－３１７８」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１４２１２、配列番号１４）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ」という用語は、配列番号４に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９９５６）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ　Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８－８６に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－４７８７」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１７４３４、配列番号１５）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ」という用語は、配列番号５に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２５４７６）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ遺伝子は、Ｊｏｙｃｅ　ＣＥら、２０１１年、Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ、２０巻、ｐ４０２５－４０４０に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－６５１０」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００２２２２２、配列番号１６）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ」という用語は、配列番号６に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９７８８）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ　Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８－８６に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ」はの前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－４６９５」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１７３２８、配列番号１７）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４」という用語は、配列番号７に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９６９１）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ　Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８－８６に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－４６３４」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１７２６１、配列番号１８）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９」という用語は、配列番号８に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１８９６８）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９遺伝子は、Ｊｉｍａ　ＤＤら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１６巻、ｅ１１８－１２７に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－４４４９」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１６７９２、配列番号１９）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５」という用語は、配列番号９に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１５０７９）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５遺伝子は、Ｓｔａｒｋ　ＭＳら、２０１０年、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ、５巻、ｅ９６８５に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－３１９５」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００１４２４０、配列番号２０）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ」という用語は、配列番号１０に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２７５７５）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ遺伝子は、Ｌａｄｅｗｉｇ　Ｅら、２０１２年、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ、２２巻、ｐ１６３４－１６４５に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－６８３６」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００２２６８２、配列番号２１）が知られている。
　本明細書で使用される「ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ」という用語は、配列番号１１に記載のｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５６１）やその他生物種ホモログ若しくはオーソログなどを包含する。ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子は、Ｌｉｍ　ＬＰら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９巻、ｐ１５４０に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ」の前駆体として、ヘアピン様構造をとる「ｈｓａ－ｍｉｒ－１８７」（ｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＭＩ００００２７４、配列番号２２）が知られている。
　また、成熟型のｍｉＲＮＡは、ヘアピン様構造をとるＲＮＡ前駆体から成熟型ｍｉＲＮＡとして切出されるときに、配列の前後１～数塩基が短く、又は長く切出されることや、塩基の置換が生じて変異体となることがあり、ｉｓｏｍｉＲと称される（Ｍｏｒｉｎ　ＲＤ．ら、２００８年、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、ｐ．６１０－６２１）。ｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ２１では、配列番号１～９及び１１で表される塩基配列の他に、数々のｉｓｏｍｉＲと呼ばれる配列番号２３～３９で表されるポリヌクレオチド変異体及び断片も示されている。これらもまた、配列番号１～９及び１１のいずれかで表される塩基配列を有するｍｉＲＮＡの変異体又は断片として得ることができる。
　すなわち、本発明の配列番号１～９及び１１で表される塩基配列若しくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、の変異体のうち、例えばｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２１に登録されている最も長い変異体として、それぞれ配列番号２３～３２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、本発明の配列番号１、３、４、５、８、９、１１で表される塩基配列若しくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、の変異体のうち、例えばｍｉＲＢａｓｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　２１に登録されている最も短い変異体として、それぞれ配列番号３３～３９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。また、これらの変異体及び断片以外にも、ｍｉＲＢａｓｅに登録された、配列番号１、３、４、８、９、１１のｍｉＲＮＡに対する数々のｉｓｏｍｉＲであるポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの例としては、それぞれ前駆体である配列番号１２～２２のいずれかで表されるポリヌクレオチドが挙げられる。
　配列番号１～３９で表される遺伝子（ｍｉＲＮＡ）の名称とｍｉＲＢａｓｅ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．（登録番号）を表１に記載した。
　本明細書において「特異的に結合可能な」とは、本発明で使用する核酸、例えば核酸プローブ又はプライマーが、特定の標的核酸と結合し、他の核酸と実質的に結合できないことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-074717号の開示内容を包含する。
　本発明により、悪性脳腫瘍を容易にかつ高い精度で検出することが可能になった。
　例えば、患者の低侵襲性で採取できる検体（血液、血清など）中の上記ｍｉＲＮＡの測定値を指標とし、容易に患者が悪性脳腫瘍を有するか否かを検出（判別）することができる。
図１は、前駆体である配列番号１２で表されるｈｓａ－ｍｉｒ－１９０９から生成される配列番号１で表されるｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－５ｐの塩基配列の関係を示す。 左図：学習検体群（ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｃｏｈｏｒｔ）として選択した悪性脳腫瘍患者（９８人）、良性脳腫瘍患者（１４人）、及び健常体（１００人）のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）の測定値を縦軸として、それぞれ表したものである。右図：検証検体群（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｃｏｈｏｒｔ）として選択した悪性脳腫瘍患者（４９人）、良性脳腫瘍患者（７人）、及び健常体（５０人）のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）の測定値を縦軸として、それぞれ表したものである。 左図：学習検体群として選択した悪性脳腫瘍患者（９８人）、健常体（１００人）、及び良性脳腫瘍患者（１４人）のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ（配列番号２）の測定値からフィッシャーの判別分析を用いて判別式を作成し（ｚ＝－１．９５２×（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐの発現量）－１．０７１×（ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐの発現量）＋３０．８８４）、該判別式から得られた判別スコアを縦軸とし、検体群を横軸として表したものである。図中の点線は判別スコアが０となる両群を判別する判別境界を示す。右図：検証検体群として選択した悪性脳腫瘍患者（４９人）、健常体（５０人）、及び良性脳腫瘍患者（７人）のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ（配列番号２）の測定値に対して、学習検体群で作成した判別式から得られた判別スコアを縦軸とし、検体群を横軸として表したものである。図中の点線は判別スコアが０となる両群を判別する判別境界を示す。 左図（図３左図と同じ）：学習検体群として選択した悪性脳腫瘍患者（９８人）、健常体（１００人）、及び良性脳腫瘍患者（１４人）のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ（配列番号２）の測定値からフィッシャーの判別分析を用いて判別式を作成し（ｚ＝－１．９５２×（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐの発現量）－１．０７１×（ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐの発現量）＋３０．８８４）、該判別式から得られた判別スコアを縦軸とし、検体群を横軸として表したものである。図中の点線は判別スコアが０となる両群を判別する判別境界を示す。右図：検証検体群として選択した中枢神経系原発悪性リンパ腫患者３７人、上衣腫患者６人、神経節神経膠腫患者５人、毛様細胞性星細胞腫患者３人のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ（配列番号２）の測定値に対して、学習検体群で作成した判別式から得られた判別スコアを縦軸とし、検体群を横軸として表したものである。図中の点線は判別スコアが０となる両群を判別する判別境界を示す。
　以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．悪性脳腫瘍の標的核酸
　本発明の上記定義の悪性脳腫瘍検出用の核酸／ポリヌクレオチド（例えば核酸プローブ又はプライマー）を使用して、悪性脳腫瘍又は悪性脳腫瘍細胞の存在及び／又は不存在を検出するための、悪性脳腫瘍マーカーとしての主要な標的核酸には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、及び、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを用いることができる。さらにこれらのｍｉＲＮＡと組み合わせて使用することができる他の悪性脳腫瘍マーカーとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ　ｍｉＲＮＡも標的核酸として好ましく用いることができる。標的核酸とする上記のｍｉＲＮＡには、例えば、配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列を含むヒト遺伝子（例えば、それぞれ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ）、その同族体、その転写産物、並びにその変異体及び誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。
　ヒト検体における好ましい標的核酸は、配列番号１～３９のいずれかで表される塩基配列を含むヒト遺伝子、又はその転写産物であり、より好ましくは当該転写産物、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐのｍｉＲＮＡ、又はその前駆体ＲＮＡであるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ若しくはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである。
　第１の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第２の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第３の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第４の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第５の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第６の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第７の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第８の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第９の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第１０の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに本遺伝子又はその転写産物等の発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告は知られていない。
　第１１の標的遺伝子は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子、その同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。特許文献１においてｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ　ｍｉＲＮＡの発現の変化が悪性脳腫瘍のマーカーになりうるという報告がされている。
２．悪性脳腫瘍の検出用の核酸
　本発明においては、上記の悪性脳腫瘍マーカーとしての標的核酸に特異的に結合可能な核酸を、悪性脳腫瘍を検出（判別）又は診断するための核酸、例えば核酸プローブ又はプライマーとして用いることができる。
　本発明において、悪性脳腫瘍を検出するため、あるいは悪性脳腫瘍を診断するために使用可能な核酸、例えば核酸プローブ又はプライマーは、上記の悪性脳腫瘍マーカーとしての標的核酸、すなわちｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、若しくはｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子、例えばヒト由来のｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、若しくはｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子、又はそれらの同族体、それらの転写産物、それらの変異体若しくは誘導体、それらの前駆体、あるいはそれらの任意の組み合わせの、存在、発現量又は存在量を定性的及び／又は定量的に測定することを可能にする。
　上記の標的核酸は、健常体又は良性脳腫瘍患者と比べて、悪性脳腫瘍に罹患した被験体において、該標的核酸の種類に応じてそれらの発現量が増加するものもあれば、又は低下するものもある（以下、「増加／低下」と称する。）。それゆえ、上記の標的核酸に特異的に結合可能な本発明の核酸は、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体（例えばヒト）由来の検体（例えば血液等の体液）と健常体由来の検体について上記標的核酸の発現量を測定し、それらを比較することにより、悪性脳腫瘍を検出するために有効に使用することができる。また、本発明の核酸は、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体（例えばヒト）由来の検体（例えば血液等の体液）と、良性の脳腫瘍患者由来の検体について上記標的核酸の発現量を測定し、それらを比較することにより、良性の脳腫瘍患者から判別して悪性脳腫瘍を特異的に検出するために有効に使用することができる。
　本発明で使用可能な悪性脳腫瘍検出用の核酸プローブ又はプライマー等の核酸は、例えば、配列番号１～１０の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブ、又は、配列番号１～１０の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーである。
　本発明で使用可能な悪性脳腫瘍検出用の核酸プローブ又はプライマー等の核酸として、例えば、配列番号１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブ、又は、配列番号１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーをさらに用いることができる。
　具体的には、悪性脳腫瘍検出に用いる上記の核酸プローブ又はプライマー等の核酸は、配列番号１～３９のいずれかで表される塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）とストリンジェントな条件（後述）でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、並びにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列に含まれる１５以上、好ましくは１７以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた１又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸である上記悪性脳腫瘍マーカーを検出するための核酸プローブ及びプライマーとして使用できる。
　さらに具体的には、本発明で使用可能な悪性脳腫瘍検出用の核酸／ポリヌクレオチド、例えば核酸プローブ又はプライマーの例は、以下のポリヌクレオチド（ａ）～（ｅ）からなる群から選択される１又は複数のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
（ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
　本発明で使用可能な悪性脳腫瘍検出用の核酸、例えば核酸プローブ又はプライマーはさらに、上記のポリヌクレオチド（ａ）～（ｅ）からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドの他に、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことができる。
（ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
（ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
　上記のポリヌクレオチドの「１５以上の連続した塩基を含むその断片」は、各ポリヌクレオチドの塩基配列に含まれる、例えば、連続する１５からその配列の全塩基数未満、１７からその配列の全塩基数未満、１９からその配列の全塩基数未満、などの範囲の塩基数の配列を含むことができるが、これらに限定されないものとする。
　本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。なお所定の塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチドはＤＮＡである。
　本発明で使用可能な上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
　ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳ（１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＵＳ（１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
　配列番号１～１１で表されるヒト由来の、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、及び、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐは公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、この遺伝子をクローニングすることによって、本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを作製することができる。
　そのような悪性脳腫瘍検出用の核酸プローブ又はプライマー等の核酸は、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
　あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｗａｋｏなどを利用できる。
　ここで、配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体としては、生体内に存在していない。例えば、配列番号１で表されるｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐの塩基配列は、配列番号１２で表される前駆体ｈｓａ－ｍｉｒ－１９０９から生成されるが、この前駆体は図１に示すようなヘアピン様構造を有しており、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ（配列番号１）及びｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－５ｐの塩基配列は互いにミスマッチ配列を有している。このため、配列番号１で表されるｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドが生体内で自然に生成されることはない。同様に、配列番号２～１１のいずれかで表される塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドは、生体内に存在しない人工的な塩基配列を有する。ここで目的の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、目的の塩基配列の全長配列に相補的な塩基配列のみからなるポリヌクレオチドを意味する。
３．悪性脳腫瘍検出用キット又はデバイス
　本発明はまた、悪性脳腫瘍マーカーである標的核酸を測定するための、本発明において核酸プローブ又はプライマーとして使用可能なポリヌクレオチド（これには、変異体、断片、又は誘導体も含みうる。；以下、検出用ポリヌクレオチドと称することがある）の１つ又は複数を含む悪性脳腫瘍検出用キット又はデバイスを提供する。
　本発明における悪性脳腫瘍マーカーである標的核酸は、好ましくは、以下の群１から選択される１つ以上である：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及びｍｉＲ－６８３６－３ｐ。これらの悪性脳腫瘍マーカーと組み合わせて、ｍｉＲ－１８７－５ｐ等の別の悪性脳腫瘍マーカーを標的核酸としてさらに用いてもよい。
　本発明のキット又はデバイスは、上記の悪性脳腫瘍マーカーである標的核酸と特異的に結合可能な核酸、好ましくは、上記「２．悪性脳腫瘍の検出用の核酸」に記載の悪性脳腫瘍検出用の核酸プローブ又はプライマー等の核酸、具体的には上記２に記載したポリヌクレオチド類から選択される１又は複数のポリヌクレオチドを含む。
　具体的には、本発明のキット又はデバイスは、配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含む（若しくは、からなる）ポリヌクレオチド、それに相補的な塩基配列を含む（若しくは、からなる）ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドの変異体若しくは誘導体、それらのポリヌクレオチドの１５以上の連続した塩基を含む断片、及びそれらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むことができる。
　本発明のキット又はデバイスに含むことができる上記ポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）の群より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はそれに相補的な塩基配列に含まれる１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
　好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列、若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチド配列の１５以上、好ましくは１７以上、より好ましくは１９以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド断片である。
　本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列に対し、例えば、連続する１５からその配列の全塩基数未満、１７からその配列の全塩基数未満、１９からその配列の全塩基数未満などの範囲の塩基数である。
　本発明のキット又はデバイスを構成する上記のポリヌクレオチドの組み合わせは、例えば、後述の表１に示される配列番号（表１中の、ｍｉＲＮＡマーカーに対応する、配列番号１～１１）によって表される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列（相補配列）からなる上記のポリヌクレオチドの任意の組み合わせであってよい。例えば、表６に記載された組み合わせの配列番号で表されるポリヌクレオチドのそれぞれと特異的に結合可能な核酸の組み合わせが挙げられるが、それらはあくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
　例えば、本発明において悪性脳腫瘍と健常体を判別するためのキット又はデバイスを構成する上記のポリヌクレオチドの組み合わせとしては、表１に示される配列番号（標的核酸）の２個以上について、それぞれの配列番号で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列又はそれらの断片等からなる上記のポリヌクレオチドを組み合わせたものが望ましい。通常では表１に示される配列番号の２個の組み合わせで充分な判別性能を得ることができるが、３個以上を組み合わせてもよい。
　具体的には悪性脳腫瘍患者を、良性脳腫瘍患者及び健常体と判別するための標的核酸として用いる２個のポリヌクレオチドの組み合わせとして、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドから選択される２個の組み合わせのうち、悪性脳腫瘍マーカーとして新規に見出された配列番号１～１０から選択される１つ以上を含む組み合わせが好ましい。そのような組み合わせの標的核酸のそれぞれと特異的に結合可能な核酸の組み合わせを、悪性脳腫瘍と健常体を判別するためのキット又はデバイスにおいて用いることができる。
　上記のがん種特異性のあるポリヌクレオチド（標的核酸）の組み合わせの個数としては、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上の個数の組み合わせが可能であるが、より好ましくは４個以上の組み合わせであり、通常では４個の組み合わせで充分な判別性能を得ることができる。
　本発明で用いる標的核酸（悪性脳腫瘍マーカー）の組み合わせとして、非限定的に、配列番号１で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、上記のがん種特異性ポリヌクレオチド群１に含まれる他の配列番号（配列番号２～１０）及び配列番号１１（ｍｉＲ－１８７－５ｐ）から選択される３つの配列番号で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組み合わせを以下に例示する。
（１）配列番号１、３、４、６（マーカー：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ）の組み合わせ
（２）配列番号１、３、５、６（マーカー：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ）の組み合わせ
（３）配列番号１、３、７、８（マーカー：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９）の組み合わせ
（４）配列番号１、３、７、１０（マーカー：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－６８３６－３ｐ）の組み合わせ
（５）配列番号１、３、７、１１（マーカー：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
　本発明で用いる標的核酸（悪性脳腫瘍マーカー）の組み合わせとして、非限定的に、配列番号２で表される塩基配列もしくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、上記のがん種特異性ポリヌクレオチド群１に含まれる他の配列番号（配列番号１、３～１０）及び配列番号１１（ｍｉＲ－１８７－５ｐ）から選択される３つの配列番号で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組み合わせを以下に例示する。
（１）配列番号２、３、５、７（マーカー：ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４）の組み合わせ
（２）配列番号２、４、５、１１（マーカー：ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
（３）配列番号２、５、６、１１（マーカー：ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
（４）配列番号２、５、７、１１（マーカー：ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
（５）配列番号２、５、９、１１（マーカー：ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－３１９５、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
　本発明で用いる標的核酸（悪性脳腫瘍マーカー）の組み合わせとして、非限定的に、配列番号３で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、上記のがん種特異性ポリヌクレオチド群１に含まれる他の配列番号（配列番号１～２、４～１０）及び配列番号１１（ｍｉＲ－１８７－５ｐ）から選択される３つの配列番号で表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとの組み合わせを以下に例示する。
（１）配列番号３、４、５、９（マーカー：ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－３１９５）の組み合わせ
（２）配列番号３、４、５、１０（マーカー：ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－６８３６－３ｐ）の組み合わせ
（３）配列番号３、４、５、１１（マーカー：ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
（４）配列番号３、５、９、１０（マーカー：ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－３１９５、ｍｉＲ－６８３６－３ｐ）の組み合わせ
（５）配列番号３、５、９、１１（マーカー：ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－３１９５、ｍｉＲ－１８７－５ｐ）の組み合わせ
　上記で例示した組み合わせの標的核酸のそれぞれと特異的に結合可能な核酸を、本発明のキット若しくはデバイス、又は悪性脳腫瘍の検出（判別）方法において、悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチドのセットとして好適に用いることができる。
　本発明のキット又はデバイスには、上で説明した本発明における悪性脳腫瘍の検出用のポリヌクレオチド（これには、配列番号１～１０の少なくとも１つで表される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、断片又は誘導体を包含しうる。）に加えて、悪性脳腫瘍検出を可能とする既知のポリヌクレオチド又は将来見出されるであろうポリヌクレオチドも含めることができる。
　本発明のキットに含まれる上記ポリヌクレオチドは、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されうる。
　本発明のキットには、体液、細胞又は組織から核酸（例えばｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）を抽出するためのキット、標識用蛍光物質、核酸増幅用酵素及び培地、使用説明書、などをさらに含めることができる。
　本発明のデバイスは、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチドなどの核酸が、例えば、固相に結合又は付着された、がんマーカー測定のためのデバイスである。固相の材質の例は、プラスチック、紙、ガラス、シリコン、などであり、加工のしやすさの点では、好ましい固相の材質はプラスチックである。固相の形状は、任意であり、例えば方形、丸形、短冊形、フィルム形などである。本発明のデバイスには、例えば、ハイブリダイゼーション技術による測定のためのデバイスが含まれ、具体的にはブロッティングデバイス、核酸アレイ（例えばマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップなど）などが例示される。
　核酸アレイ技術は、必要に応じてＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理が施された固相の表面に、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて核酸をスポットする方法、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射するインクジェットを用いて核酸を固相に吹き付ける方法、固相上で順次ヌクレオチド合成を行う方法などの方法を用いて、上記の核酸を１つずつ結合又は付着させることによりチップなどのアレイを作製し、このアレイを用いてハイブリダイゼーションを利用して標的核酸を測定する技術である。
　本発明のキット又はデバイスは、上記の群１の悪性脳腫瘍マーカーであるｍｉＲＮＡの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも５つから全部のポリヌクレオチドのそれぞれと特異的に結合可能な核酸を含む。本発明のキット又はデバイスはさらに、場合により、既知の悪性脳腫瘍マーカーであるｍｉＲ－１８７－５ｐと特異的に結合可能な核酸を含むことができる。
　本発明のキット又はデバイスは、下記「４．悪性脳腫瘍の検出方法」の悪性脳腫瘍の検出のために使用することができる。
４．悪性脳腫瘍の検出方法
　本発明はさらに、上記「３．悪性脳腫瘍検出用キット又はデバイス」で説明した本発明のキット若しくはデバイス（本発明で使用可能な上記の核酸を含む。）又は悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチドを用いて、検体中の標的核酸の発現量、具体的には以下の群：ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及びｍｉＲ－６８３６－３ｐから選択される少なくとも１つの遺伝子、及び場合によりｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子の発現量（典型的には、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ前駆体の量）を測定する（好ましくはｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定する）ことを含む、悪性脳腫瘍の検出方法を提供する。本方法では、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体から採取した検体（例えば、血液、血清、血漿等）について、検体中の標的核酸の発現量を測定した後、さらに、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体の検体の上記標的核酸の発現量測定値と、非悪性対照群（健常体又は良性の脳腫瘍患者を含む）とから採取した同様の検体（例えば、血液、血清、血漿等）で得られた同じ標的核酸の発現量（対照発現量）とを用いた分析を行い、例えば両発現量を比較する。本方法は、両者の当該検体中の標的核酸の発現量に統計学的に有意に差がある場合、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体が、悪性脳腫瘍に罹患していると評価することを含んでもよい。本方法は、被験体由来の検体について測定した上記標的核酸の発現量と、非悪性対照群の発現量とを用いて（それらを比較して）、被験体が悪性脳腫瘍に罹患していること又は悪性脳腫瘍に罹患していないこと（悪性脳腫瘍に罹患しているか否か）を評価し、悪性脳腫瘍の有無を検出することを含み得る。被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かの評価は、悪性脳腫瘍への罹患の有無を示す指標を得ることであってよい。悪性脳腫瘍への罹患を示す指標値が得られた場合には、被験体における悪性脳腫瘍の存在が検出されたと判断し、悪性脳腫瘍に罹患していないことを示す指標値が得られた場合には、被験体における悪性脳腫瘍が検出されなかったと判断することができる。
　本発明の上記方法は、低侵襲的に、感度及び特異度の高い、がんの早期診断を可能とし、これにより、早期の治療及び予後の改善をもたらし、さらに、疾病憎悪のモニターや外科的、放射線療法的、及び化学療法的な治療の有効性のモニターを可能にする。
　本発明の上記方法では、本発明の血液、血清、血漿等の検体から、悪性脳腫瘍由来の標的核酸を含み得る核酸（典型的にはＲＮＡ）を抽出し、その核酸抽出物を、本発明のキット若しくはデバイス又は悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチドを用いた標的核酸検出アッセイに供してもよい。標的核酸検出アッセイに供する核酸を検体から抽出する方法として、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｋｉｔ　（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を加えて調製するのが特に好ましいが、一般的な酸性フェノール法（Ａｃｉｄ　Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法）を用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）やＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）などの酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を加えて調製してもよい。さらに、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）などのキットを利用できるが、これらの方法に限定されない。
　本発明はまた、本発明のキット若しくはデバイス、又はそれらに使用可能な悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチド（１個の上記標的核酸ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能なポリヌクレオチド、又は２個以上の上記標的核酸ｍｉＲＮＡのそれぞれと特異的に結合可能なポリヌクレオチドの組み合わせ）の、被験体由来の検体中の悪性脳腫瘍由来のｍｉＲ遺伝子の発現産物のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの検出のための使用を提供する。本発明はまた、本発明のキット又は若しくはデバイス、又は悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチド（１個の上記標的核酸ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能なポリヌクレオチド、又は２個以上の上記標的核酸ｍｉＲＮＡのそれぞれと特異的に結合可能なポリヌクレオチドの組み合わせ）の、被験体における悪性脳腫瘍の検出における使用を提供する。本発明はまた、被験体における悪性脳腫瘍の検出又は診断用の、本発明のキット又は若しくはデバイス、又は上記ポリヌクレオチド（１個の上記標的核酸ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能なポリヌクレオド、又は２個以上の上記標的核酸ｍｉＲＮＡのそれぞれと特異的に結合可能なポリヌクレオチドの組み合わせ）を提供する。本発明は、上記ポリヌクレオチド（１個の上記標的核酸ｍｉＲＮＡと特異的に結合可能なポリヌクレオチド、又は２個以上の上記標的核酸ｍｉＲＮＡのそれぞれと特異的に結合可能なポリヌクレオチドの組み合わせ）を含む、悪性脳腫瘍に対する診断薬も提供する。本発明の悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチド、キット及びデバイス等は、悪性脳腫瘍の診断に有用である。
　本発明の上記方法において、上記キット又はデバイスは、上で説明したような、本発明で使用可能な悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチドを単一であるいはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
　本発明の悪性脳腫瘍の検出又は（遺伝子）診断において、本発明のキット又はデバイスに含まれるポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍなどを利用できるが、これらの方法に限定されない。
　本発明のキット又はデバイスに含まれるポリヌクレオチドは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などのハイブリダイゼーション技術、定量ＲＴ－ＰＣＲ法などの定量増幅技術などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象検体としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を採取する。あるいは、そのような体液から上記の方法によって調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いてもよいし、さらに当該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
　本発明のキット又はデバイスは、悪性脳腫瘍の診断又は罹患の有無の検出のために有用である。具体的には、当該キット又はデバイスを使用した悪性脳腫瘍の検出は、悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体から、血液、血清、血漿、尿等の検体を用いて、当該キット又はデバイスに含まれる核酸プローブ又はプライマーで検出される遺伝子の発現量をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出することによって行うことができる。悪性脳腫瘍の罹患が疑われる被験体の血液、血清、血漿、尿等の検体中の標的核酸（ｍｉＲＮＡ等の悪性脳腫瘍マーカー）の量を、本発明のキット又はデバイスに含まれる、配列番号１～１１の少なくとも１つで表される塩基配列若しくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、それらの変異体若しくは誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片を用いて測定し、その発現量が、非悪性対照群（健常体又は良性脳腫瘍患者）の血液、血清、又は血漿、尿等の検体中のそれらの発現量と比べて統計学的に有意に差がある場合、例えば判別式を用いて、当該被験体は悪性脳腫瘍に罹患していると評価することができる。
　本発明の方法は、ＣＴスキャンやＭＲＩ（核磁気共鳴装置）、脳血管造影法などの画像診断法と組み合わせることができる。
　本発明のキット又はデバイスを利用した、検体中に悪性脳腫瘍由来の上記ｍｉＲ遺伝子の発現産物が含まれないこと、又は悪性脳腫瘍由来の上記ｍｉＲ遺伝子の発現産物が含まれること、の検出方法は、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を検体として採取して、そこに含まれる標的遺伝子（ｍｉＲ遺伝子）の発現量を、本発明の悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド（変異体、断片又は誘導体を包含する。）を用いて測定することにより、悪性脳腫瘍の有無を評価する又は悪性脳腫瘍を検出することを含む。また本発明の悪性脳腫瘍の検出方法を用いて、例えば悪性脳腫瘍患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における当該疾患の改善の有無又は改善の程度を評価又は診断することもできる。
　本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のステップ：
（ａ）被験体由来の検体を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、本発明のキット又はデバイス中のポリヌクレオチド、又は本発明の悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチドと接触させるステップ、
（ｂ）検体中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブ又はプライマーとして用いて測定するステップ、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、当該被験体中の悪性脳腫瘍（細胞）の存在又は不存在を評価するステップ、
を含むことができる。
　上記のステップ（ａ）では、好ましい検体として、血液、血清、又は血漿を使用することができる。
　上記のステップ（ｂ）では、発現量の測定を、核酸アレイ法などのハイブリダイゼーション技術、シーケンサーなどによりポリヌクレオチドの塩基配列を決定する技術、定量ＲＴ－ＰＣＲ法などの定量増幅技術、などの技術によって行うことができる。
　上記のステップ（ｃ）は、（ｂ）の結果をもとに、被験体が被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かを評価し、それによって当該被験体における悪性脳腫瘍（細胞）の存在又は不存在を検出するステップであってもよい。上記のステップ（ｃ）では、被験体由来の検体中の標的核酸の発現量が、健常体又は良性脳腫瘍患者（非悪性対照群）由来の検体中の標的核酸の発現量（「参照」（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）又は「対照」（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ともいう。）と比べて統計学的に有意な差がある場合、被験体由来の検体中の標的核酸の発現量と判別式から得られた判別スコアに基づいて、当該被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かを評価（判別）することができる。
　具体的には、本発明は、ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つ（１つ又は複数）、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はそれ以上の標的核酸ポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸を用いて、被験体の検体における標的核酸の発現量を測定し、該測定された発現量と、同様に測定された健常体又は良性脳腫瘍患者（非悪性対照群）の発現量（対照発現量）とを用いて、被験体が悪性脳腫瘍に罹患していること又は悪性脳腫瘍に罹患していないこと（悪性脳腫瘍に罹患しているか否か）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価し、被験体における悪性脳腫瘍の有無（存在又は不存在）を検出することを含む、悪性脳腫瘍の検出方法を提供する。
　本明細書において「評価」するとは、医師による判定ではなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの検査による結果に基づいた評価支援であってもよい。
　上記のとおり、本発明の方法の好ましい実施形態において、具体的には、ｍｉＲ－１９０９－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐであり、ｍｉＲ－６８６９－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐであり、ｍｉＲ－３１７８がｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８であり、ｍｉＲ－４７８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐであり、ｍｉＲ－６５１０－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐであり、ｍｉＲ－４６９５－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐであり、ｍｉＲ－４６３４がｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４であり、ｍｉＲ－４４４９がｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９であり、ｍｉＲ－３１９５がｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５であり、ｍｉＲ－６８３６－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐである。
　また、本発明の方法の好ましい実施形態において、具体的には、上記の標的核酸と特異的に結合可能な核酸（具体的には、通常はプローブ又はプライマー）が、下記の（ａ）～（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される。
　本発明の方法では、それらのポリヌクレオチドに加えて、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸をさらに用いることができる。
　好ましい実施形態では、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸について、具体的には、ｍｉＲ－１８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐである。
　さらに、好ましい実施形態では、具体的には、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸は、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される。
　本発明の方法で用いられる検体としては、被験体の生体組織、血液、血清、血漿、尿、髄液等の体液など、好ましくは血液、血清、又は血漿を挙げることができる。当該生体組織又は体液等の検体を直接発現量の測定に用いてもよいし、それらの検体から調製されるＲＮＡ含有核酸試料、それからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料を、測定のために用いてもよい。
　本明細書で被験体とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
　本発明の方法は、測定対象として用いる検体の種類に応じてステップを変更することができる。
　測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、被験体における悪性脳腫瘍（細胞）の検出は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験体の検体から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明のキット又はデバイス中のポリヌクレオチドと結合させるステップ、
（ｂ）当該ポリヌクレオチドに結合した検体由来のＲＮＡ又は当該ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブとして用いるハイブリダイゼーション技術によって、あるいは、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる定量ＲＴ－ＰＣＲによって、あるいは、シーケンサーでポリヌクレオチド（前記ＲＮＡ又はｃＤＮＡ）の塩基配列を決定することによって、定量的に又は定性的に測定するステップ、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、悪性脳腫瘍（又は悪性脳腫瘍由来の遺伝子発現量の変化）の存在又は不存在を検出するステップ、
を含むことができる。ステップ（ｃ）では、上記（ｂ）の測定結果に基づいて、健常体又は良性脳腫瘍患者（非悪性対照群）と比較して被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かを評価し、それによって被験体における悪性脳腫瘍（又は悪性脳腫瘍由来の遺伝子発現量の変化）の存在又は不存在を検出してもよい。ステップ（ａ）は、検体由来のＲＮＡ又はｃＤＮＡを結合させた後の本発明のキット又はデバイスを、緩衝液等の洗浄液により洗浄し、それによって本発明のキット又はデバイス中のポリヌクレオチドに未結合のポリヌクレオチドを除去することをさらに含むことも好ましい。
　本発明によって悪性脳腫瘍（又は悪性脳腫瘍由来の遺伝子発現量の変化）をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出、検査、評価又は診断するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。このようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法、シーケンサー等によりポリヌクレオチドの塩基配列を決定する技術などを使用することができる。
　ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明で使用可能な上記核酸プローブを用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその発現量を検出、測定することができる。具体的には、核酸プローブ（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被験体の生体組織又は体液（血液、血清、血漿等）などの検体由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成されたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ－１８００ＩＩ（富士写真フィルム株式会社）、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ　８６５（ＧＥヘルスケア社）、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
　定量ＲＴ－ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明で使用可能な上記プライマーを用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現量を検出、測定することができる。具体的には、被検体の生体組織又は体液（血液、血清、血漿等）などの検体由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせ、標識した核酸プローブとハイブリダイズさせて検出する方法を含むことができる。
　シーケンサーを利用する場合には、本発明で使用可能な上記プライマーを用いることによって、リード数からＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現量を検出又は測定することができる、具体的には、例えば、被験体の生体組織又は体液（血液、血清、血漿等）などの検体由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製し、これを鋳型として標的核酸であるｍｉＲ遺伝子発現産物の少なくとも一部の領域を増幅できるように設計されたプライマー対（各プライマーは上記ｃＤＮＡに結合する正鎖配列と逆鎖配列のそれぞれを含む）を、上記ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、常法によりＰＣＲ等の核酸増幅を行い、増幅したＤＮＡをシーケンサーで検出又は測定する方法を例示することができる。シーケンサーとしては、例えば、ＨｉＳｅｑ　２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）又はＩｏｎ　Ｐｒｏｔｏｎ（登録商標）　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いることができる。あるいは、被験体の生体組織又は体液（血液、血清、血漿等）などの検体を、検体中のＲＮＡを核酸増幅することなく、直接、ＰａｃＢｉｏ　ＲＳ　ＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等のシークエンサーにかけて、標的核酸を検出又は測定する方法も例示される。
　核酸アレイ技術（核酸アレイ解析）を利用する場合は、本発明の核酸プローブ（一本鎖又は二本鎖）を基板（固相）に貼り付けたＲＮＡチップ又はＤＮＡチップを用いる。核酸プローブを貼り付けた領域をプローブスポット、核酸プローブを貼り付けていない領域をブランクスポットと称する。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般に核酸チップ、核酸アレイ、マイクロアレイなどという名称があり、ＤＮＡ又はＲＮＡアレイには、ＤＮＡ又はＲＮＡマクロアレイとＤＮＡ又はＲＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではチップといった場合、それら全てを包含するものとする。ＤＮＡチップとしては３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用いることができるが、これに限られない。
　ＤＮＡチップの測定は、限定されないが、例えば核酸プローブの標識物に由来するシグナルを画像検出器（Ｔｙｐｈｏｏｎ　９４１０（ＧＥヘルスケア社）、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
　本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」とは、上述のように核酸プローブが他の配列に対するよりも大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件である。
　ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションとその後の洗浄の条件によって、規定される。そのハイブリダイゼーションの条件は、限定されないが、例えば３０℃～６０℃で、ＳＳＣ、界面活性剤、ホルムアミド、デキストラン硫酸塩、ブロッキング剤などを含む溶液中で１～２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．０）であり、界面活性剤はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｔｏｎ、又はＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３～１０×ＳＳＣ、０．１～１％　ＳＤＳを含む。ストリンジェントな条件を規定するもうひとつの条件である、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに当該鎖と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
　これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２～７．４５、第２巻８．９～８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
　本発明のキット中の悪性脳腫瘍検出用のポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際の条件の例としては、例えば１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣＬ、１～２ｍＭ　ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ値＋５～１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍ値の計算方法としてＴｍ値＝２×（アデニン残基数＋チミン残基数）＋４×（グアニン残基数＋シトシン残基数）などが挙げられる。
　また、定量ＲＴ－ＰＣＲ法を用いる場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）：ＬＮＡ（登録商標）－ｂａｓｅｄ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　ＰＣＲ（Ｅｘｉｑｏｎ社）：Ｎｃｏｄｅ（登録商標）　ｍｉＲＮＡ　ｑＲＴ－ＰＣＴ　キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの、ｍｉＲＮＡを定量的に測定するために特別に工夫された市販の測定用キットを用いてもよい。
　遺伝子発現量（例えば、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体の量）の算出には、限定されないが、例えばＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｄａｔａ（Ｓｐｅｅｄ　Ｔ．著、Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ／ＣＲＣ）、及びＡ　ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ　ｇｕｉｄｅ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃａｕｓｔｏｎ　Ｈ．Ｃ．ら著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）などに記載された統計学的処理を、本発明において利用できる。例えばＤＮＡチップ上のブランクスポットの測定値の平均値に、ブランクスポットの測定値の標準偏差の２倍、好ましくは３倍、より好ましくは６倍を加算し、その値以上のシグナル値を有するプローブスポットを検出スポットとみなすことができる。さらに、ブランクスポットの測定値の平均値をバックグラウンドとみなし、プローブスポットの測定値から減算し、遺伝子発現量とすることができる。遺伝子発現量の欠損値については、解析対象から除外するか、好ましくは各ＤＮＡチップにおける遺伝子発現量の最小値で置換するか、より好ましくは遺伝子発現量の最小値の対数値から０．１を減算した値、で置換することができる。さらに、低シグナルの遺伝子を除去するために、測定サンプル数の２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上において２の６乗、好ましくは２の８乗、より好ましくは２の１０乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを解析対象として選択することができる。遺伝子発現量の正規化（ノーマライゼーション）としては、限定されないが、例えばｇｌｏｂａｌ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎやｑｕａｎｔｉｌｅ　ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｂｏｌｓｔａｄ，Ｂ．Ｍ．ら、２００３年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１９巻、ｐ１８５－１９３）、のほか、あらゆる検体間で安定して発現している内因性コントロールｍｉＲＮＡの発現量測定値によって補正する方法（Ａ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２０１６年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ、ＤＯＩ：１０．１１１１）、などが挙げられる。
　本発明はまた、本発明の悪性脳腫瘍検出用ポリヌクレオチド、キット、デバイス（例えばチップ）、又はそれらの組み合わせを用いて、被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を測定し、悪性脳腫瘍を有することが既知である被験体（もしくは、患者）由来の検体の遺伝子発現量と健常体又は良性脳腫瘍患者由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつ悪性脳腫瘍と健常又は良性脳腫瘍とを区別的に判別することが可能である判別式（判別関数）に、上記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、悪性脳腫瘍の存在又は不存在を評価することを含む、被験体における悪性脳腫瘍を検出する（又は、検出を補助する）方法を提供する。
　本発明はさらに、本発明の検出用ポリヌクレオチド、キット、デバイス（例えばチップ）、又はそれらの組み合わせを用いて、被験体が悪性脳腫瘍を含むこと、及び／又は、悪性脳腫瘍を含まないことが既知の複数の検体中の標的遺伝子（標的核酸）の発現量をｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定する第１のステップ、前記第１のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を教師サンプルとした判別式を作成する第２のステップ、被験体由来の検体中の当該標的遺伝子の発現量を第１のステップと同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定する第３のステップ、前記第２のステップで得られた判別式に第３のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を代入し、当該判別式から得られた結果に基づいて、被験体が悪性脳腫瘍を含むこと、又は悪性脳腫瘍を含まないことを決定又は評価する第４のステップを含み、ここで、当該標的遺伝子が当該ポリヌクレオチド、キット又はデバイス（例えばチップ）に含まれる検出用ポリヌクレオチドによって検出可能なものである、方法を提供する。
　本明細書中、判別式は、悪性脳腫瘍と健常とを区別的に判別する判別式を作成することができる任意の判別分析法、例えばフィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ニューラルネットワーク、Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）などを用いて作成できるが、これらの具体例に限定されない。
　線形判別分析は群分けの境界が直線あるいは超平面である場合、式１を判別式として用いて群の所属を判別する方法である。ここで、ｘは説明変数、ｗは説明変数の係数、ｗ０は定数項とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　判別式で得られた値を判別スコアと呼び、新たに与えられたデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入し、判別スコアの符号で群分けを判別することができる。
　線形判別分析の一種であるフィッシャーの判別分析はクラス判別を行うのに適した次元を選択するための次元削減法であり、合成変数の分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）に着目して、同じラベルを持つデータの分散を最小化することで識別力の高い合成変数を構成する（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ．ら著　Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｗｉｔｈ　Ｓ．Ｆｏｕｒｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．、２００２年）。フィッシャーの判別分析では式２を最大にするような射影方向ｗを求める。ここで、μは入力の平均、ｎｇはクラスｇに属するデータ数、μｇはクラスｇに属するデータの入力の平均とする。分子・分母はそれぞれデータをベクトルｗの方向に射影したときのクラス間分散、クラス内分散となっており、この比を最大化することで判別式係数ｗｉを求める（金森敬文ら著、「パターン認識」、共立出版（２００９年）、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｏ．ら著、Ｐａｔｔｅｒｎ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　マハラノビス距離はデータの相関を考慮した式３で算出され、各群からのマハラノビス距離の近い群を所属群として判別する非線形判別分析として用いることができる。ここで、μは各群の中心ベクトル、Ｓ－１はその群の分散共分散行列の逆行列である。中心ベクトルは説明変数ｘから算出され、平均ベクトルや中央値ベクトルなどを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　ＳＶＭとはＶ．Ｖａｐｎｉｋが考案した判別分析法である（Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｌｅａｎｉｎｇ　Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年）。分類すべき群分けが既知のデータセットの特定のデータ項目を説明変数、分類すべき群分けを目的変数として、当該データセットを既知の群分けに正しく分類するための超平面と呼ばれる境界面を決定し、当該境界面を用いてデータを分類する判別式を決定する。そして当該判別式は、新たに与えられるデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入することにより、群分けを判別することができる。また、このときの判別結果は分類すべき群でも良く、分類すべき群に分類されうる確率でも良く、超平面からの距離でも良い。ＳＶＭでは非線形な問題に対応するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の識別を行う方法が知られている。非線形に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表現されるような式のことをカーネルと呼び、カーネルの一例としてリニアカーネル、ＲＢＦ（Ｒａｄｉａｌ　Ｂａｓｉｓ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）カーネル、ガウシアンカーネルを挙げることができる。カーネルによって高次元に写像しながら、実際には写像された空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な判別式、すなわち判別式を構成することができる（例えば、麻生英樹ら著、統計科学のフロンテイア６「パターン認識と学習の統計学　新しい概念と手法」、岩波書店（２００４年）、Ｎｅｌｌｏ　Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉら著、ＳＶＭ入門、共立出版（２００８年））。
　ＳＶＭ法の一種であるＣ－ｓｕｐｐｏｒｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｃ－ＳＶＣ）は、２群の説明変数で学習を行って超平面を作成し、未知のデータセットがどちらの群に分類されるかを判別する（Ｃ．Ｃｏｒｔｅｓら、１９９５年、Ｍａｃｈｉｎｅ　Ｌｅａｒｎｉｎｇ、２０巻、ｐ２７３－２９７）。
　本発明の方法で使用可能なＣ－ＳＶＣの判別式の算出例を以下に示す。まず全被験体を悪性脳腫瘍患者と健常体の２群に群分けする。被験体が悪性脳腫瘍患者である、又は健常体であると判断するには、例えば脳の画像検査を用いることができる。
　次に、分けられた２群の血清由来の検体の網羅的遺伝子発現量からなるデータセット（以下、学習検体群）を用意し、当該２群の間で遺伝子発現量に明確な差が見られる遺伝子を説明変数、当該群分けを目的変数（例えば－１と＋１）としたＣ－ＳＶＣによる判別式を決定する。式４は最適化する目的関数であり、ここで、ｅは全ての入力ベクトル、ｙは目的変数、ａはＬａｇｒａｎｇｅ未定乗数ベクトル、Ｑは正定値行列、Ｃは制約条件を調整するパラメータを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　式５は最終的に得られた判別式であり、判別式によって得られた値の符号で所属する群を決定できる。ここで、ｘはサポートベクトル、ｙは群の所属を示すラベル、ａは対応する係数、ｂは定数項、Ｋはカーネル関数である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　カーネル関数としては例えば式６で定義されるＲＢＦカーネルを用いることができる。ここで、ｘはサポートベクトル、γは超平面の複雑さを調整するカーネルパラメータを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　これらのほかにも被験体が悪性脳腫瘍を含むこと又は含まないことを決定又は評価する、あるいは被験体由来の検体における悪性脳腫瘍由来の標的遺伝子の発現量を健常体由来の対照と比較し評価する、方法として、ニューラルネットワーク、ｋ－近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を選択することができる。
　本発明の方法は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）悪性脳腫瘍患者由来であること、及び健常体又は悪性脳腫瘍を含まない良性脳腫瘍患者由来であることが既に知られている検体中の標的遺伝子（標的核酸）の発現量を、本発明による検出用ポリヌクレオチド、キット又はデバイス（例えばＤＮＡチップ）を用いて測定するステップ、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値から、上記の式１～３、５及び６の判別式を作成するステップ、
（ｃ）被験体由来の検体中の当該標的遺伝子の発現量を、本発明による検出用ポリヌクレオチド、キット又はデバイス（例えばＤＮＡチップ）を用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式に測定値を代入して、得られた結果に基づいて被験体が悪性脳腫瘍を含むこと又は含まないことを決定又は評価する、或いは悪性脳腫瘍由来の発現量を健常体又は良性脳腫瘍患者由来の対照発現量と比較し評価する、ステップ、
を含むことができる。
　ここで、式１～３、５及び６の式中のｘは説明変数であり、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片等を測定することによって得られる値を含み、具体的には本発明の悪性脳腫瘍患者と健常体又は良性脳腫瘍患者を判別するための説明変数は、例えば下記の（１）～（２）より選択される遺伝子発現量である。
（１）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列に含まれる１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドのいずれかによって測定される悪性脳腫瘍患者、健常体、及び良性脳腫瘍患者の血清における遺伝子発現量。
（２）配列番号１１で表される塩基配列又はそれに相補的な塩基配列に含まれる１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドのいずれかによって測定される悪性脳腫瘍患者、健常体、及び良性脳腫瘍患者の血清における遺伝子発現量。
　以上に示すように、被験体由来の検体について、該被験体が悪性脳腫瘍を有するか否かを決定又は評価する方法として、判別式の作成には、学習検体群から作成した判別式が必要であり、当該判別式の判別精度を上げるためには、学習検体群中の悪性脳腫瘍患者群と健常体群からなる２群間、又は、悪性脳腫瘍患者群と良性脳腫瘍患者群からなる２群間の発現量に明確な差がある遺伝子を判別式に用いることが必要である。
　また、判別式の説明変数に用いる遺伝子の決定は、次のように行うことが好ましい。まず、学習検体群である、悪性脳腫瘍患者群の網羅的遺伝子発現量と健常体群の網羅的遺伝子発現量をデータセットとし、パラメトリック解析であるｔ検定のＰ値、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定のＰ値、又はＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のＰ値などを利用して、当該２群間における各遺伝子の発現量の差の大きさを求める。
　検定によって得られたＰ値の危険率（有意水準）が例えば５％、１％又は０．０１％より小さい場合に統計学的に有意とみなすことができる。
　検定を繰り返し行うことに起因する第一種の過誤の確率の増大を補正するために公知の方法、例えばボンフェローニ、ホルムなどの方法によって補正することができる（例えば、永田靖ら著、「統計的多重比較法の基礎」、サイエンティスト社（２００７年））。ボンフェローニ補正を例示すると、例えば検定によって得られたＰ値を検定の繰り返し回数、即ち、解析に用いる遺伝子数で乗じ、所望の有意水準と比較することにより検定全体での第一種の過誤を生じる確率を抑制できる。
　また、検定ではなく悪性脳腫瘍患者群の遺伝子発現量と健常体群の遺伝子発現量の間で、各々の遺伝子発現量の中央値の発現比の絶対値（Ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ）を算出し、判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。また、悪性脳腫瘍患者群と健常体群の遺伝子発現量を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＲＯＣ値を基準にして判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。
　次に、ここで求めた遺伝子発現量の差が大きい任意の数の遺伝子を用いて、上記の種々の方法で算出することができる判別式を作成する。最大の判別精度を得る判別式を構築する方法として、例えばＰ値の有意水準を満たした遺伝子のあらゆる組み合わせで判別式を構築する方法や、判別式を作成するために使用する遺伝子を、遺伝子発現量の差の大きい順に一つずつ増やしながら繰り返して評価する方法などがある（Ｆｕｒｅｙ　ＴＳ．ら、２０００年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻、ｐ９０６－１４）。この判別式に対し、別の独立の悪性脳腫瘍患者若しくは健常体の遺伝子発現量を説明変数に代入して、この独立の悪性脳腫瘍患者若しくは健常体について所属する群の判別結果を算出する。すなわち、見出した診断用遺伝子セット及び診断用遺伝子セットを用いて構築した判別式を、独立の検体群で評価することにより、より普遍的な悪性脳腫瘍を検出することができる診断用遺伝子セット及び悪性脳腫瘍を判別する方法を見出すことができる。
　また、当該判別式の判別性能（汎化性）の評価には、Ｓｐｌｉｔ－ｓａｍｐｌｅ法を用いることが好ましい。すなわち、データセットを学習検体群と検証検体群に分割し、学習検体群で統計学的検定による遺伝子の選択と判別式作成を行い、該判別式で検証検体群を判別した結果と検証検体群が所属する真の群を用いて精度・感度・特異度を算出し、判別性能を評価する。一方、データセットを分割せずに、全検体を用いて統計学的検定による遺伝子の選択と判別式作成を行い、新規に用意した検体を該判別式で判別して精度・感度・特異度を算出し、判別性能を評価することもできる。
　例えば、上に記載したような配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくはその相補的配列に基づく１又は２以上の上記ポリヌクレオチド、及び場合により配列番号１１で表される塩基配列若しくはその相補的配列に基づく１又は２以上の上記ポリヌクレオチド、をさらに含む任意の組み合わせを診断用遺伝子セットとする。さらに、画像検査や組織診断の診断結果が悪性脳腫瘍である患者由来の検体と、良性の脳腫瘍患者若しくは健常体由来の検体における該診断用遺伝子セットの発現量を用いて判別式を構築する。その結果、未知の検体の該診断用遺伝子セットの発現量を測定することにより、未知の検体の由来する被験体が悪性脳腫瘍を含むこと又は悪性脳腫瘍を含まないことを高い精度及び感度で見分けることができる。
　本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
[参考例１]
＜脳腫瘍患者と健常体の検体の採取＞
　インフォームドコンセントを得た健常体１００人と脳腫瘍以外に原発がんが認められていない悪性脳腫瘍患者として神経膠腫（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）患者９８人（グレードＩＩが２３例、グレードＩＩＩが２５例、グレードＩＶが５０例）及び良性脳腫瘍患者として髄膜腫患者１４人からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いてそれぞれ採取した血清検体を、学習検体群とした。同様に、インフォームドコンセントを得た健常体５０人と脳以外に原発がんが認められていない悪性脳腫瘍患者として神経膠腫（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）患者４９人（グレードＩＩが７例、グレードＩＩＩが１３例、グレードＩＶが２９例）及び良性脳腫瘍患者として髄膜腫患者７人からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いてそれぞれ採取した血清検体を、検証検体群とした。
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出＞
　検体として上記学習検体群、検証検体群合わせて健常体１５０人と悪性脳腫瘍患者１４７人、良性脳腫瘍患者２１人の合計３１８人からそれぞれ得られた血清３００μＬから、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓａｍｐｌｅ　ｋｉｔ（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。
＜遺伝子発現量の測定＞
　検体として上記学習検体群、検証検体群合わせて健常体１５０人、悪性脳腫瘍患者１４７人、良性脳腫瘍患者２１人の合計３１８人の血清から得たｔｏｔａｌ　ＲＮＡに対して、３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコール（ｖｅｒ２．２０）に基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、ｍｉＲＢａｓｅ　ｒｅｌｅａｓｅ　２１に登録されているｍｉＲＮＡの中で、２，５６５種のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ｍｉＲＮＡ　Ｏｌｉｇｏ　ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件で、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡとＤＮＡチップ上のプローブとのハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行い、欠損値は各ＤＮＡチップにおける遺伝子発現量の最小値の対数値から０．１を減算した値で置換した。その結果、健常体１５０人、悪性脳腫瘍患者１４７人、良性脳腫瘍患者２１人の合計３１８人の血清に対する、網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。数値化されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を用いた計算及び統計解析は、Ｒ言語３．０．２（Ｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｅ　Ｔｅａｍ　（２０１３）．Ｒ：Ａ　ｌａｎｇｕａｇｅ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，ＵＲＬ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．）及びＭＡＳＳパッケージ７．３－３０（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ．＆Ｒｉｐｌｅｙ，Ｂ．Ｄ．（２００２）Ｍｏｄｅｒｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　ｗｉｔｈ　Ｓ．Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．ＩＳＢＮ　０－３８７－９５４５７－０）を用いて実施した。
[参考例２]
＜他の悪性脳腫瘍検体の採取＞
　インフォームドコンセントを得た脳腫瘍以外にがんが認められていない中枢神経系原発悪性リンパ腫患者３７人、上衣腫患者６人、神経節神経膠腫患者５人、毛様細胞性星細胞腫患者３人、計５１人からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ－ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いてそれぞれ血清を採取し、検証検体群とした。以降のｔｏｔａｌＲＮＡの抽出並びに遺伝子発現量の測定及び解析は参考例１と同様に行った。
[実施例１]
＜学習検体群の検体を用いた遺伝子マーカーの選定と検証検体群の検体を用いた単独の遺伝子マーカーの脳腫瘍判別性能の評価方法＞
　本実施例では、学習検体群から悪性脳腫瘍患者を良性脳腫瘍患者及び健常体と判別するための遺伝子マーカーを選定し、学習検体群とは独立した検証検体群の検体において、選定したそれぞれの遺伝子マーカー単独の悪性脳腫瘍判別性能を評価する方法を検討した。
　具体的には、まず参考例１で得た学習検体群と検証検体群のｍｉＲＮＡ発現量を正規化した。正規化は、各検体についてＤＮＡチップ上の３つの内因性ｍｉＲＮＡコントロール（ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４６３）の発現量測定値の平均と基準値（Ｐｒｅ－ｓｅｔ　ｖａｌｕｅ）との比を得、当該検体ごとの全てのｍｉＲＮＡの検出数値にその比を反映させる方法によって実施した。この手法は、Ａ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２０１６年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ、ＤＯＩ：１０．１１１１に記載されている。
　次に、学習検体群を用いて診断用遺伝子の選定を行った。ここで、より信頼性の高い診断マーカーを獲得するため、学習検体群の悪性脳腫瘍患者群と、良性脳腫瘍患者及び健常体を合わせた群のいずれかにおいて、５０％以上の検体で２の６乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを選択した。更に悪性脳腫瘍患者群と、良性脳腫瘍患者群及び健常体群を判別するための統計的有意性がある遺伝子として、各々の遺伝子発現量について等分散を仮定した両側ｔ検定で得られたＰ値をボンフェローニ補正し、ｐ＜０．０１を満たす遺伝子を、判別式の説明変数に用いる遺伝子マーカーとして獲得し、表２に記載した。
　このようにして、配列番号１～１１で表される、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐ遺伝子を、良性脳腫瘍患者及び健常体と比較した悪性脳腫瘍マーカーとして見出した。
　更に、これらの遺伝子の発現量を指標として、フィッシャーの判別分析により悪性脳腫瘍の有無を判別する判別式を作成した。すなわち、学習検体群において選択された１１種の遺伝子に相当する配列番号１～１１のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量測定値を式２に入力して判別式「ｚ＝ａ×（遺伝子の発現量）＋ｂ」を作成し、算出した精度・感度・特異度を表３に示した。またそのときの判別式係数ａと定数項ｂを表４に示した。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐ遺伝子（配列番号１）の判別式は、表４に記載の判別式係数ａ（３．０５８）と定数項ｂ（２６．４２１）から、「ｚ＝３．０５８×（ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐの発現量）－２６．４２１」となる。
　上記で作成した判別式を用いて検証検体群における精度・感度・特異度を算出し、選定されたポリヌクレオチドの判別性能を独立した検体で検証した（表３）。例えば、配列番号１で示される塩基配列の発現量測定値を学習検体群の悪性脳腫瘍患者（９８人）と、良性脳腫瘍患者（１４人）及び健常体（１００人）との間で比較した場合、良性脳腫瘍患者及び健常体群に対し悪性脳腫瘍患者群の遺伝子発現量測定値が有意に低いことが示され（図２左参照）、更にこの結果は検証検体群の悪性脳腫瘍患者（４９人）と、良性脳腫瘍患者（７人）及び健常体（５０人）との間でも再現できた（図２右参照）。同様に配列番号２～１１に示される他のポリヌクレオチドにおいても、良性脳腫瘍患者及び健常体群に対し悪性脳腫瘍患者群の遺伝子発現量測定値が有意に低い（－）又は高い（＋）結果（表２）が得られ、これらの結果は検証検体群で検証ができた。また、例えばこの配列番号１で示される塩基配列に関し、学習検体群で悪性脳腫瘍の有無を判別するため表４に記載の判別式係数（３．０５８）と定数項（２６．４２１）を用いて判別スコアを計算し、次いでスコアが０より大きい検体を悪性脳腫瘍、０より小さい検体を良性脳腫瘍患者又は健常体と判定する判別式を用いて、検証検体群での悪性脳腫瘍検出の的中率を算出したところ、真陽性４１例、真陰性５４例、偽陽性３例、偽陰性８例であり、これらの値から判別性能として、精度９０％、感度８４％、特異度９５％が得られた。このようにして配列番号１～１１に示される全てのポリヌクレオチドの判別性能を算出し表３に記載した。
　配列番号２～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、検証検体群においてそれぞれ感度８４％、８４％、８４％、８０％、７６％、８４％、７４％、７６％、８４％、７１％を示した（表３）。これらのポリヌクレオチドは、単独でも７０％を上回る高い感度で悪性脳腫瘍を判別することが証明できた。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
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[実施例２]
＜検証検体群検体を用いた複数の遺伝子マーカーの組み合わせによる脳腫瘍判別性能の評価方法＞
　本実施例では、実施例１で選定された遺伝子マーカーを組み合わせて悪性脳腫瘍判別性能を評価する方法を検討した。
　具体的には、実施例１に記載のようにして、参考例１で得た学習検体群と検証検体群のｍｉＲＮＡ発現量を正規化した。次に、実施例１において選択された１１種の遺伝子に相当する配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち２個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組合せ５５０通りについて学習検体群でフィッシャーの判別分析を行い、悪性脳腫瘍の存在の有無を判別する判別式「ｚ＝ａ１×（遺伝子１の発現量）＋ａ２×（遺伝子２の発現量）＋ａ３×（遺伝子３の発現量）＋ａ４×（遺伝子４の発現量）＋ｂ」を構築した（表５）。算出した精度・感度・特異度を表６に示した。
　次に、作成した判別式を用いて検証検体群における精度・感度・特異度を算出することにより、判別性能を独立した検体で検証した。
　配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち２個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせを用いて参考例１の検証検体群の脳腫瘍の有無の判別を実施した。例えば、配列番号１と配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量測定値について、学習検体群で悪性脳腫瘍の有無を判別するために作成した判別式に基づいて表５に記載の判別式係数（配列番号１：－１．９５２、配列番号２：－１．０７１）と定数項（－３０．８８４）を用いて判別スコアを計算し、スコアが０より大きい検体を悪性脳腫瘍、０より小さい検体を良性脳腫瘍患者又は健常体と判定することにより得られる判別結果を比較した結果、学習検体群では健常体群及び良性脳腫瘍患者群と悪性脳腫瘍患者群との間で発現量測定値が有意に分離する散布図が得られ（図３左参照）、更にこの結果は検証検体群でも再現ができた（図３右参照）。この配列番号１と配列番号２で示される塩基配列に関し、学習検体群で構築した判別式を用いて悪性脳腫瘍検出の的中率を算出したところ、真陽性４５例、真陰性５５例、偽陽性２例、偽陰性４例であり、これらの値から判別性能として精度９４％、感度９２％、特異度９７％が得られた。
　このようにして、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち２個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の全ての組み合わせについて判別性能を算出した。全ての組合せ５５０通り（表６）のうち、単独の遺伝子マーカーでの判別性能を上回る感度を示す組み合わせが４８６通りあることが示された。なお表５及び６において「配列番号」は使用した複数個のポリヌクレオチドの組み合わせを配列番号で示している（本願の後述の表でも同様）。
　例えば配列番号３と配列番号５、配列番号３と配列番号５と配列番号６、配列番号３と配列番号５と配列番号７、配列番号３と配列番号５と配列番号８、配列番号３と配列番号５と配列番号１０、配列番号３と配列番号５と配列番号１１、配列番号３と配列番号４と配列番号５と配列番号６、配列番号３と配列番号４と配列番号５と配列番号７、配列番号３と配列番号４と配列番号５と配列番号８、配列番号３と配列番号５と配列番号６と配列番号７、配列番号３と配列番号５と配列番号６と配列番号８、配列番号３と配列番号５と配列番号６と配列番号９、配列番号３と配列番号５と配列番号６と配列番号１０、配列番号３と配列番号５と配列番号６と配列番号１１、配列番号３と配列番号５と配列番号７と配列番号８、配列番号３と配列番号５と配列番号７と配列番号９、配列番号３と配列番号５と配列番号７と配列番号１０、配列番号３と配列番号５と配列番号７と配列番号１１、配列番号３と配列番号５と配列番号８と配列番号９、配列番号３と配列番号５と配列番号８と配列番号１１、配列番号３と配列番号５と配列番号１０と配列番号１１、配列番号４と配列番号５と配列番号６と配列番号１１、及び配列番号５と配列番号６と配列番号７と配列番号８、で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせを用いた場合、検証検体群において、単独の遺伝子マーカーで最高感度８４％を上回る、感度９８％を示した。
　これらの組み合わせにおいて実施例１で得られた表１に記載の配列番号１～１１のポリヌクレオチド全てが少なくとも１回は見出された。すなわち、検証検体群において、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を含む２個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせは、感度７０％を上回る高い感度で悪性脳腫瘍を判別することが証明できた。
　このように、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量測定値の２個、３個、４個、５又はそれ以上の個数を組み合わせても、優れた感度で悪性脳腫瘍を検出するマーカーが得られる。例えば、実施例１で選択された配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドについて、統計的有意性を示すＰ値の降順に順位付けし、上位のｍｉＲＮＡから１個ずつ加えた１個又は複数個のｍｉＲＮＡの組み合わせを用いて判別性能を算出した。その結果、検証検体群における感度は、１個のｍｉＲＮＡで８４％、２個のｍｉＲＮＡで９２％、３個のｍｉＲＮＡで９４％、５個のｍｉＲＮＡで９４％であった。複数のｍｉＲＮＡの組み合わせは１個のｍｉＲＮＡの感度よりも高いことから、複数のｍｉＲＮＡを組み合わせても悪性脳腫瘍を検出する優れたマーカーとなり得ることが示された。ここで、複数のｍｉＲＮＡの組み合わせは、上記のように統計的有意差の順に加算する場合に限らず、どのような複数個のｍｉＲＮＡの組み合わせでも悪性脳腫瘍の検出に用いることができる。
　これらの結果から配列番号１～１１で表される塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドは、悪性脳腫瘍の優れた診断マーカーであるといえる。
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[実施例３]
＜検証検体群を用いた複数の遺伝子マーカーの組み合わせによる他の悪性脳腫瘍検体の判別性能の評価方法＞
　本実施例では、実施例１、２と同様に学習群で配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせを用いて閾値又は判別式を構築し、参考例２に記載した検証検体群を対象として、実施例１、２に記載の方法と同様の方法で、判別性能を評価した。
　具体的には、まず参考例１で得た学習検体群と参考例２で得た検証検体群のｍｉＲＮＡ発現量を正規化した。正規化は、各検体についてＤＮＡチップ上の３つの内因性ｍｉＲＮＡコントロール（ｈｓａ－ｍｉＲ－２８６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９－３ｐ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４４６３）の発現量測定値の平均と基準値（Ｐｒｅ－ｓｅｔ　ｖａｌｕｅ）との比を得、当該検体ごとの全てのｍｉＲＮＡの検出数値にその比を反映させる方法によって実施した。この手法は、Ａ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、２０１６年、Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｃｉ、ＤＯＩ：１０．１１１１に記載されている。
　次に、参考例１で得た学習検体群について実施例１で選択された１１種の遺伝子の配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせについてフィッシャーの判別分析を行い、悪性脳腫瘍の存在の有無を判別する判別式を構築した。次に、中枢神経系原発悪性リンパ腫患者３７人、上衣腫患者６人、神経節神経膠腫患者５人、毛様細胞性星細胞腫患者３人、計５１人の検証検体群（参考例２）における感度を算出し（表７）、それにより、選定されたポリヌクレオチドの判別性能を独立した検体で検証した。
　配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の組み合わせを用いて参考例２の検証検体群の悪性脳腫瘍の有無の判別を実施した。例えば、配列番号１と配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量測定値について、学習検体群で悪性脳腫瘍の有無を判別するために作成した判別式に基づいて表５に記載の判別式係数（配列番号１：－１．９５２、配列番号２：－１．０７１）と定数項（－３０．８８４）を用いて判別スコアを計算し、スコアが０より大きい検体を悪性脳腫瘍、０より小さい検体を良性脳腫瘍患者又は健常体と判定することにより得られる学習検体群と検証検体群の判別結果を比較した結果、検証検体群である他の悪性脳腫瘍（中枢神経系原発悪性リンパ腫、上衣腫、神経節神経膠腫、毛様細胞性星細胞腫）も学習検体群の神経膠腫（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）と同様の散布図が得られた（図４右参照）。この配列番号１と配列番号２で示される塩基配列に関し、学習検体群で構築した判別式を用いて悪性脳腫瘍検出の的中率を算出したところ、真陽性４３例、偽陰性８例であり、これらの値から判別性能として感度８４％が得られた。なお、学習検体群の感度は８７％であった。
　このようにして、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個～４個のポリヌクレオチドの発現量測定値の全ての組み合わせについて判別性能を算出した。全ての組合せ５６１通り中、５１４通り（表７）は、実施例１、２の中で最小判別性能を示す配列番号１１のポリヌクレオチド単独での感度７１％を上回り、悪性脳腫瘍（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）だけでなく中枢神経系原発悪性リンパ腫、上衣腫、神経節神経膠腫、毛様細胞性星細胞腫も検出（判別）できることが示された。
　神経膠腫（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）以外の上記の悪性脳腫瘍も判別できる、配列番号１～１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの任意の組み合わせの個数としては、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上の個数が挙げられるが、これらに限定されない。単独で最高の判別性能を示す配列番号５のポリヌクレオチド単独での感度８６％と比較して、２個以上の上記ポリヌクレオチドの組み合わせにおいて判別精度９０％以上を示すことができた。
　このように、これらのポリヌクレオチドを用いて、検証検体群において神経膠腫（星細胞腫、乏突起膠腫、乏突起膠星細胞腫）以外の上記の悪性脳腫瘍のいずれについても悪性脳腫瘍であると正しく判別することができた。
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　以上の実施例に示すように、本発明のポリヌクレオチド、キット等及び方法を用いれば、悪性脳腫瘍患者を、健常体だけでなく良性脳腫瘍患者とも感度よく判別できる。これにより、外科手術によるがん部の切除実施などに関する早期の臨床的判断が可能となり、その結果、５年生存率の向上や、再発率を低くすることが可能となる。
　本発明により、簡易かつ安価な方法で、悪性脳腫瘍を効果的に検出することができるため、悪性脳腫瘍の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて悪性脳腫瘍を低侵襲的に検出できるため、悪性脳腫瘍を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (18)

  1. 　悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及びｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸を含む、悪性脳腫瘍の検出用キット。
  2. 　ｍｉＲ－１９０９－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐであり、ｍｉＲ－６８６９－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐであり、ｍｉＲ－３１７８がｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８であり、ｍｉＲ－４７８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐであり、ｍｉＲ－６５１０－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐであり、ｍｉＲ－４６９５－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐであり、ｍｉＲ－４６３４がｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４であり、ｍｉＲ－４４４９がｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９であり、ｍｉＲ－３１９５がｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５であり、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐである、請求項１に記載のキット。
  3. 　前記核酸が、下記の（ａ）～（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
    （ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
    （ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のキット。
  4. 　前記キットが、別の悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載のキット。
  5. 　ｍｉＲ－１８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐである、請求項４に記載のキット。
  6. 　ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸が、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
    （ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
    （ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項４又は５に記載のキット。
  7. 　悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１９０９－３ｐ、ｍｉＲ－６８６９－５ｐ、ｍｉＲ－３１７８、ｍｉＲ－４７８７－５ｐ、ｍｉＲ－６５１０－５ｐ、ｍｉＲ－４６９５－５ｐ、ｍｉＲ－４６３４、ｍｉＲ－４４４９、ｍｉＲ－３１９５、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸を含む、悪性脳腫瘍の検出用デバイス。
  8. 　ｍｉＲ－１９０９－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１９０９－３ｐであり、ｍｉＲ－６８６９－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８６９－５ｐであり、ｍｉＲ－３１７８がｈｓａ－ｍｉＲ－３１７８であり、ｍｉＲ－４７８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４７８７－５ｐであり、ｍｉＲ－６５１０－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６５１０－５ｐであり、ｍｉＲ－４６９５－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－４６９５－５ｐであり、ｍｉＲ－４６３４がｈｓａ－ｍｉＲ－４６３４であり、ｍｉＲ－４４４９がｈｓａ－ｍｉＲ－４４４９であり、ｍｉＲ－３１９５がｈｓａ－ｍｉＲ－３１９５であり、及び、ｍｉＲ－６８３６－３ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－６８３６－３ｐである、請求項７に記載のデバイス。
  9. 　前記核酸が、下記の（ａ）～（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
    （ａ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｂ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｄ）配列番号１～１０のいずれかで表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
    （ｅ）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項７又は８に記載のデバイス。
  10. 　前記デバイスが、別の悪性脳腫瘍マーカーである、ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸をさらに含む、請求項７～９のいずれかに記載のデバイス。
  11. 　ｍｉＲ－１８７－５ｐがｈｓａ－ｍｉＲ－１８７－５ｐである、請求項１０に記載のデバイス。
  12. 　ｍｉＲ－１８７－５ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸が、下記の（ｆ）～（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
    （ｆ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｇ）配列番号１１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｈ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｉ）配列番号１１で表される塩基配列若しくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
    （ｊ）前記（ｆ）～（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項１０又は１１に記載のデバイス。
  13. 　前記デバイスが、ハイブリダイゼーション技術による測定のためのデバイスである、請求項７～１２のいずれかに記載のデバイス。
  14. 　前記ハイブリダイゼーション技術が、核酸アレイ技術である、請求項１３に記載のデバイス。
  15. 　請求項１～６のいずれかに記載のキット又は請求項７～１４のいずれかに記載のデバイスを用いて、被験体の検体における標的核酸の発現量を測定し、該測定された発現量と、同様に測定された健常体又は良性脳腫瘍患者の対照発現量とを用いて、被験体が悪性脳腫瘍に罹患しているか否かを評価し、被験体における悪性脳腫瘍の有無を検出することを含む、悪性脳腫瘍の検出方法。
  16. 　請求項１～６のいずれか１項に記載のキット又は請求項７～１４のいずれか１項に記載のデバイスを用いて被験体の検体における標的遺伝子の発現量を測定し、悪性脳腫瘍を有することが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量と健常体又は良性脳腫瘍患者由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつ悪性脳腫瘍と健常又は良性脳腫瘍とを区別的に判別することが可能である判別式に、上記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、悪性脳腫瘍の存在又は不存在を評価することを含む、被験体における悪性脳腫瘍の検出方法。
  17. 　前記被験体が、ヒトである、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 　前記検体が、血液、血清又は血漿である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
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