KR20180132748A - 악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법 - Google Patents

악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20180132748A
KR20180132748A KR1020187031250A KR20187031250A KR20180132748A KR 20180132748 A KR20180132748 A KR 20180132748A KR 1020187031250 A KR1020187031250 A KR 1020187031250A KR 20187031250 A KR20187031250 A KR 20187031250A KR 20180132748 A KR20180132748 A KR 20180132748A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
nucleotide sequence
polynucleotide
seq
hsa
Prior art date
Application number
KR1020187031250A
Other languages
English (en)
Inventor
마키코 요시모토
사토코 코조노
준페이 카와우치
사토시 콘도우
히토시 노부마사
타카히로 오치야
요시타카 나리타
마코토 오노
Original Assignee
도레이 카부시키가이샤
국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도레이 카부시키가이샤, 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터 filed Critical 도레이 카부시키가이샤
Publication of KR20180132748A publication Critical patent/KR20180132748A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 악성 뇌종양의 검출용 키트 또는 디바이스, 및 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 피험체의 검체 중의 소정의 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양 검출용 키트 또는 디바이스, 및 상기 miRNA를 in vitro에서 측정하는 것을 포함하는 악성 뇌종양을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
본 발명은, 피험체에 있어서 악성 뇌종양에의 이환의 유무의 검사를 위해서 사용되는 특정의 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양의 검출용 키트 또는 디바이스, 및 상기 핵산을 이용하여 상기 miRNA의 발현량을 측정하는 것을 포함하는 악성 뇌종양의 검출 방법에 관한 것이다.
뇌종양은, 뇌조직 자체로부터 발생한 원발성 뇌종양과, 다른 장기의 암이 뇌에 전이한 전이성 뇌종양으로 나뉘어진다. 원발성 뇌종양은 양성과 악성으로 나뉘며, 그 기원이 되는 세포형에 의해 세분류된다.
원발성 뇌종양은 주로, 신경교종(악성), 중추신경계 원발악성 임파종(악성), 수막종(주로 양성), 하수체선종(양성), 신경초종(양성), 선천성 종양 등으로 분류되고, 신경교종이 전체의 28%를 차지한다. 신경교종은 종양을 구성하는 세포의 형태로부터 성세포종, 핍돌기교종, 핍돌기교성세포종, 모양세포성 성세포종, 상의종, 신경절신경교종 등으로 더 분류된다.
국립연구개발법인 국립암연구센터 암대책 정보센터(일본)가 보고하는 2014년의 일본국내에 있어서의 부위별의 암 사망율의 통계에 의하면, 뇌·중추신경계의 암의 사망수는 2,302명이며, 2013년의 부위별 암 사망율에서는 남성이 2.0%, 여성이 1.5%를 차지한다. 이렇게 뇌종양은 암 전체로 생각하면, 암환자 100명 중 5명 이하로 발생율은 낮지만, 어린이의 암 환자만으로 생각하면, 뇌종양은 백혈병 다음으로 많고, 어린이의 암 환자의 5명 중 1명으로 젊은층에서의 이환이 많아지고 있다.
UICC(국제대암연합;Unio Internationalis Contra Cancrum) 「TNM 악성 종양의 분류」 제6판에 있어서는 뇌종양의 병기분류(TNM)는 규정되어 있지 않다. 뇌종양의 악성도는 2007년의 WHO 분류에 의해 그레이드I∼IV로 분류된다.
뇌종양에 있어서의 유용한 혈액 마커는 존재하지 않는다. 통상, 뇌종양은, 두통, 구토, 마비, 실어·구음장해, 의식장해 등의 자각증상을 호소하는 환자나 경미한 두부외상의 화상검사, 뇌도크와 같은 건강진단에 있어서의 화상검사 등에 의해 발견된다. 화상진단에서는 CT, MRI, 뇌혈관조영 등이 이용된다. 화상진단에 의해 뇌종양이 발견된 경우에는, 개두수술에 의해 종양을 적출하고, 적출한 조직을 이용하여, 병리진단을 행한다. 현시점에서는 악성 뇌종양을 혈액 중의 마커로 발견하기 위한 종양 마커는 임상현장에 있어서 보급되어 있지 않다.
한편, 또 연구 단계이지만 혈액을 비롯한 생체 샘플 중의 miRNA의 발현량을 이용하여 뇌종양을 치료·진단하는 방법이 하기와 같이 있지만, 실용화에 이르지는 못했다.
특허문헌 1에서는, 인간의 신경교아종 간세포와 정상신경 간세포 사이에서 발현량에 차가 있는 miRNA를 이용하여 뇌종양을 포함하는 암을 치료·진단하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 특허문헌 1에는, 세포에서의 miRNA 발현량의 변화 데이터가 기재되어 있는 것에 그쳤다. 뇌세포를 검체로서 입수하는 것은 환자에게 주는 육체적 부담이 무겁기 때문에, 뇌세포를 검체로 하는 검사 방법은 바람직하지 못하다. 또한 특허문헌 1에 기재된 진단 방법에 관해서는, 뇌종양을 판별하는 구체적인 정밀도, 감도, 특이도 등의 판별 성능, 수단에 관한 기재가 없고, 산업적 실용성이 부족하다.
미국특허 출원공개 제US2014/00881700
본 발명의 과제는, 신규인 악성 뇌종양 마커, 및 악성 뇌종양을 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같이, 악성 뇌종양의 검출에 있어서, 기존의 종양 마커는 존재하지 않고, 또 연구 단계의 마커에 관해서는 성능이나 검출의 방법이 구체적으로 나타내어져 있지 않으므로, 이들을 이용했을 경우에는, 건상체를 악성 뇌종양 환자로 오검출하는 것에 의한 불필요한 추가 검사의 실시나, 악성 뇌종양 환자를 못보고 넘기는 것에 의한 치료 기회의 일실이 일어날 가능성이 있다. 또한 종양 마커를 측정하기 위한 뇌조직 채취에는 개두수술에 따르는 리스크가 있어 환자에게 주는 침습성이 높아 바람직하지 못하기 때문에, 저침습으로 채취할 수 있는 혈액을 사용한 간편하고 또한 정밀도 높은 비칩습적 진단 마커의 개발은 임상적으로 중요하다. 특히, 예후가 나쁜 악성 뇌종양의 조기발견·조기치료는 치료 성적 향상의 브레이크스루로 되는 것이 기대된다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 저침습으로 채취할 수 있는 혈액으로부터 악성 뇌종양의 검출 마커에 사용 가능한 복수의 유전자(miRNA)를 찾아내고, 이것에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 사용함으로써, 악성 뇌종양을 유의하게 검출할 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하의 특징을 갖는다.
(1)악성 뇌종양 마커인 miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및, miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양의 검출용 키트.
(2)miR-1909-3p가 hsa-miR-1909-3p이며, miR-6869-5p가 hsa-miR-6869-5p이며, miR-3178이 hsa-miR-3178이며, miR-4787-5p가 hsa-miR-4787-5p이며, miR-6510-5p가 hsa-miR-6510-5p이며, miR-4695-5p가 hsa-miR-4695-5p이며, miR-4634가 hsa-miR-4634이며, miR-4449가 hsa-miR-4449이며, miR-3195가 hsa-miR-3195이며, 및, miR-6836-3p가 hsa-miR-6836-3p인 (1)에 기재된 키트.
(3)상기 핵산이 하기의 (a)∼(e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 (1) 또는 (2)에 기재된 키트.
(4)상기 키트가 다른 악성 뇌종양 마커인 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 더 포함하는 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(5)miR-187-5p가 hsa-miR-187-5p인 (4)에 기재된 키트.
(6)miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산이 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 (4) 또는 (5)에 기재된 키트.
(7)악성 뇌종양 마커인 miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및, miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양 검출용 디바이스.
(8)miR-1909-3p가 hsa-miR-1909-3p이며, miR-6869-5p가 hsa-miR-6869-5p이며, miR-3178이 hsa-miR-3178이며, miR-4787-5p가 hsa-miR-4787-5p이며, miR-6510-5p가 hsa-miR-6510-5p이며, miR-4695-5p가 hsa-miR-4695-5p이며, miR-4634가 hsa-miR-4634이며, miR-4449가 hsa-miR-4449이며, miR-3195가 hsa-miR-3195이며, 및, miR-6836-3p가 hsa-miR-6836-3p인 (7)에 기재된 디바이스.
(9)상기 핵산이 하기의 (a)∼(e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 (7) 또는 (8)에 기재된 디바이스.
(10)상기 디바이스가 다른 악성 뇌종양 마커인 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 더 포함하는 (7)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 디바이스.
(11)miR-187-5p가 hsa-miR-187-5p인 (10)에 기재된 디바이스.
(12)miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산이 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 (10) 또는 (11)에 기재된 디바이스.
(13)상기 디바이스가 하이브리다이제이션 기술에 의한 측정을 위한 디바이스인 (7)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 디바이스.
(14)상기 하이브리다이제이션 기술이 핵산 어레이 기술인 (13)에 기재된 디바이스.
(15) (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 키트 또는 (7)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 디바이스를 이용하여, 피험체의 검체에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 상기 측정된 발현량과, 마찬가지로 측정된 건상체 또는 양성 뇌종양 환자의 대조 발현량을 이용하여, 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부를 평가하고, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 유무를 검출하는 것을 포함하는 악성 뇌종양의 검출 방법.
(16) (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 키트 또는 (7)∼(14) 중 어느 하나에 기재된 디바이스를 이용하여 피험체의 검체에 있어서의 표적 유전자의 발현량을 측정하고, 악성 뇌종양을 갖는 것이 기지인 피험체 유래의 검체의 유전자 발현량과 건상체 또는 양성 뇌종양 환자 유래의 검체의 유전자 발현량을 교사 샘플로서 작성 된, 또한 악성 뇌종양과 건상 또는 양성 뇌종양을 구별적으로 판별하는 것이 가능한 판별식에 상기 피험체 유래의 검체 중의 표적 유전자의 발현량을 대입하고, 그것에 의해 악성 뇌종양의 존재 또는 부존재를 평가하는 것을 포함하는 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 검출 방법.
(17)상기 피험체가 인간인 (15) 또는 (16)에 기재된 방법.
(18)상기 검체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 (15)∼(17) 중 어느 하나에 기재된 방법.
＜용어의 정의>
본 명세서 중에서 사용하는 용어는 이하의 정의를 갖는다.
본 명세서에 있어서 「악성 뇌종양」이란 뇌에 있어서 형성되는 임의의 악성 종양을 말한다. 구체적으로는, 악성 뇌종양에는 신경교종 및 중추신경계 원발 악성 임파종 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서 「뇌의 양성 종양」이란 뇌에 있어서 형성되는 임의의 양성의 종양을 말한다. 뇌의 양성 종양으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 전형예로서 양성의 수막종을 들 수 있다.
뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등의 약호에 의한 표시는, 「염기 서열 또는 아미노산 서열을 포함하는 명세서 등의 작성을 위한 가이드 라인」 (일본국 특허청편) 및 당기술분야에 있어서의 관용법을 따르는 것으로 한다.
본 명세서에 있어서 「폴리뉴클레오티드」란 RNA, DNA, 및 RNA/DNA(키메라) 모두 포함하는 핵산에 대하여 사용된다. 또, 상기 DNA에는, cDNA, 게놈DNA, 및 합성 DNA 모두가 포함된다. 또 상기 RNA에는, total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, 비코딩(non-coding) RNA 및 합성 RNA 모두가 포함된다. 본 명세서에 있어서 「합성 DNA」 및 「합성 RNA」는 소정의 염기 서열(천연형 서열 또는 비천연형 서열 어느 것이라도 좋다.)에 의거하여 예를 들면 자동 핵산 합성기를 이용하여, 인공적으로 제작된 DNA 및 RNA를 말한다. 본 명세서에 있어서 「비천연형 서열」은, 광의의 의미에 사용하는 것을 의도하고 있고, 천연형 서열과 다른, 예를 들면 1 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 서열(즉, 변이 서열), 1 이상의 수식 뉴클레오티드를 포함하는 서열(즉, 수식 서열) 등을 포함한다. 또한 본 명세서에서는 용어 「폴리뉴클레오티드」는 「핵산」과 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 있어서 「단편」이란 폴리뉴클레오티드의 연속된 일부분의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드이며, 15염기 이상, 바람직하게는 17염기 이상, 보다 바람직하게는 19염기 이상의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 「유전자」란, RNA, 및 2개쇄 DNA 뿐만 아니라, 그것을 구성하는 정쇄(또는 센스쇄) 또는 상보쇄(또는 안티센스쇄) 등의 각 단일쇄 DNA를 포함하는 것을 의도해서 사용된다. 또 그 길이에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
따라서, 본 명세서에 있어서 「유전자」는, 특별히 언급하지 않는 한, 인간 게놈 DNA를 포함하는 2개쇄 DNA, 단일쇄 DNA(정쇄), 상기 정쇄와 상보적인 서열을 갖는 단일쇄 DNA(상보쇄) (예를 들면 cDNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및 이들의 단편, 및 전사 산물 전부를 포함한다. 또 상기 「유전자」는 특정 염기 서열(또는 서열번호)로 나타내어지는 「유전자」 뿐만 아니라, 이들에 의해 코딩되는 RNA와 생물학적 기능이 동등한 RNA, 예를 들면 동족체(즉, 호모로그 또는 오솔로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체를 코딩하는 「핵산」을 포함한다. 이러한 동족체, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 「핵산」으로서는, 구체적으로는, 나중에 기재한 스트린젠트한 조건 하에서 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 「핵산」을 들 수 있다. 또, 「유전자」는, 기능 영역의 다름을 따지는 것은 아니고, 예를 들면 발현 제어 영역, 코드 영역, 엑손 또는 인트론을 포함할 수 있다. 또한 「유전자」는 세포에 포함되어 있어도 좋고, 세포밖으로 방출되어 단독으로 존재하고 있어도 좋고, 또 엑소솜이라고 불리는 소포에 내포된 상태에 있어도 좋다.
본 명세서에 있어서 「엑소솜」이란 세포로부터 분비되는 지질2중막에 포함된 소포이다. 엑소솜은 다포 엔드솜에 유래하고, 세포외 환경으로 방출될 때에 RNA, DNA 등의 「유전자」나 단백질 등의 생체물질을 내부에 포함하는 일이 있다. 엑소솜은 혈액, 혈청, 혈장, 혈청, 림프액 등의 체액에 포함되는 것이 알려져 있다.
본 명세서에 있어서 「전사 산물」이란 유전자의 DNA 서열을 주형으로 해서 합성된 RNA를 말한다. RNA 폴리메라아제가 유전자의 상류에 있는 프로모터라고 불리는 부위에 결합하고, DNA의 염기 서열에 상보적으로 되도록 3'말단에 보누클레오티드를 결합시켜 가는 형태로 RNA가 합성된다. 이 RNA에는 유전자 그 자체 뿐만 아니라, 발현 제어 영역, 코드 영역, 엑손 또는 인트론을 비롯한 전사 개시점으로부터 폴리A 서열의 말단에 이르기까지의 전체 서열이 포함된다. 본 명세서에 있어서의 「전사 산물」은 또한 문맥상 다른 경우를 제외하고, 유전자의 DNA 서열을 주형으로 해서 합성된 RNA(예를 들면 miRNA 전구체)로부터 생성된 RNA(예를 들면 miRNA)도 포함한다.
또한 본 명세서에 있어서 「마이크로 RNA(miRNA)」는, 특별히 언급하지 않는 한, 헤어핀 형상 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, RNase III 절단 활성을 갖는 dsRNA 절단 효소에 의해 절단되고, RISC라고 칭하는 단백질 복합체에 도입되고, mRNA의 번역 억제에 관여하는, 15∼25 염기의 비코딩 RNA(성숙 miRNA)를 주로 해서 의도해서 사용된다. 또 본 명세서에서 사용하는 「miRNA」는, 문맥상, 성숙 miRNA 만을 가리키고 있는 경우를 제외하고, 특정 염기 서열(또는 서열 번호)로 나타내어지는 「miRNA」 뿐만 아니라, 상기 「miRNA」의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 및 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호모로그 또는 오솔 로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는, 구체적으로는, miRBase release 21(http://www. mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 나중에 기재한 스트린젠트한 조건 하에서 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 특정 염기 서열의 상보 서열과 하이브리다이즈하는 염기 서열을 갖는 「miRNA」를 들 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용하는 「miRNA」는, miR 유전자(miRNA 전구체를 코딩하는 유전자)의 유전자 산물이어도 좋고, 그러한 유전자 산물은 성숙 miRNA(예를 들면 상기한 바와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15∼25염기, 또는 19∼25염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면 상기한 바와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.
본 명세서에 있어서 「프로브」란 유전자의 발현에 의해 발생한 RNA 또는 그것에 유래하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하기 위해서 사용되는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 있어서 「프라이머」란 유전자의 발현에 의해 생긴 RNA 또는 그것에 유래하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 인식하고, 증폭하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 그것에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
여기에서 상보적인 폴리뉴클레오티드(상보쇄, 역쇄)란, 서열번호 1∼39 중 어느 하나에 의해 정의되는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전체 길이 서열 또는 그 부분 서열에 대해서 A:T(U), G:C라는 염기대관계에 의거하여 염기적으로 상보적인 관계에 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 「상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드」라는 기재도 기본적으로 마찬가지로 이해된다.
본 명세서에 있어서 「스트린젠트한 조건」이란, 핵산 프로브나 프라이머 등의 폴리뉴클레오티드가 다른 서열에 대한 보다 큰 정도(예를 들면 백그라운드 측정값의 평균+백그라운드 측정값의 표준오차×2 이상의 측정값)이며, 그 표적 서열에 대하여 하이브리다이즈하는 조건을 말한다. 스트린젠트한 조건은 서열 의존성이며, 하이브리다이제이션이 행해지는 환경에 따라 다르다. 하이브리다이제이션 및/또는 세정 조건의 스트린젠시를 제어함으로써, 핵산 프로브 등의 폴리뉴클레오티드에 대하여 100% 상보적인 표적 서열이 동정될 수 있다. 「스트린젠트한 조건」의 구체예는 후술한다.
본 명세서에 있어서 「Tm값」이란 폴리뉴클레오티드의 이중쇄 부분이 단일쇄로 변성하고, 이중쇄와 단일쇄가 1:1의 비로 존재하는 온도를 의미한다.
본 명세서에 있어서 「변이체」란 핵산의 경우, 다형성, 돌연변이 등에 기인한 천연의 변이체, 또는 서열번호 1∼39 중 어느 하나의 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열, 또는 그 부분 서열에 있어서 1 또는 2 이상(예를 들면 1∼수개)의 염기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입을 포함하는 변이체, 또는 상기 염기 서열의 전체 길이 서열 또는 그 부분 서열과 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 %동일성을 나타내는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 변이체, 또는 상기 염기 서열의 전체 길이 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 상기 정의의 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 핵산을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「수개」란, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 정수를 의미한다.
본 명세서에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 변이체는 부위특이적 돌연변이 유발법, PCR법을 이용한 돌연변이 도입법 등의 주지의 기술을 이용하여 제작 가능하다.
본 명세서에 있어서 「%동일성」은, 상기 BLAST나 FASTA에 의한 단백질 또는 유전자의 검색 시스템을 이용하여 갭을 도입해서, 또는 갭을 도입하지 않고, 결정할 수 있다(Zheng Zhang 등, 2000년, J. Comput. Biol., 7권, p203-214; Altschul, S.F. 등, 1990년, Journal of Molecular Biology, 제 215권, p403-410;Pearson, W.R. 등, 1988년, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 제85권, p2444-2448).
본 명세서에 있어서 「유도체」란, 수식 핵산, 비한정적으로 예를 들면 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중결합의 포화, 탈아미노화, 산소분자의 유황분자로의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체, PNA(peptide nucleic acid; Nielsen, P.E. 등, 1991년, Science, 254권, p1497-500), LNA(locked nucleic acid; Obika, S. 등, 1998년, Tetrahedron Lett., 39권, p5401-5404) 등을 포함하는 핵산을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 상기 악성 뇌종양 마커인 miRNA의 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 「핵산」은 합성 또는 조제된 핵산이며, 구체적으로는 「핵산 프로브」 또는 「프라이머」를 포함하고, 피험체 중의 악성 뇌종양의 존재의 유무를 검출하기 위해서, 또는 악성 뇌종양의 이환의 유무, 이환의 정도, 악성 뇌종양의 개선의 유무나 개선의 정도, 악성 뇌종양의 치료에 대한 감수성을 진단하기 위해서, 또는 악성 뇌종양의 예방, 개선 또는 치료에 유용한 후보물질을 스크리닝 하기 위해서 직접 또는 간접적으로 이용된다. 이들에는 악성 뇌종양의 이환에 관련해서 생체내, 특히 혈액, 뇨 등의 체액 등의 검체에 있어서 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 전사 산물(폴리뉴클레오티드) 또는 그 cDNA 합성 핵산을 특이적으로 인식해서 결합할 수 있는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이들 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 상기 성질에 의거하여 생체내, 조직이나 세포내 등에서 발현된 상기 유전자를 검출하기 위한 프로브로서, 또 생체내에서 발현된 상기 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서 유효하게 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 「검출」이라고 하는 용어는 검사, 측정, 검출, 판별, 또는, 판정 지원이라고 하는 용어로 치환할 수 있다. 또한 본 명세서에 있어서 「평가」라고 하는 용어는, 검사 결과 또는 측정 결과에 의거하여 진단 또는 평가를 지원하는 것을 포함하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 「피험체」는, 인간, 침팬지를 포함하는 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류, 동물원에서 사육되는 동물 등의 포유 동물을 의미한다. 바람직한 피험체는 인간이다. 악성 뇌종양 또는 양성 뇌종양 등의 질환에 이환된 「피험체」를 「환자」라고 칭하는 일이 있다. 또한 「건상체」도 또한 이러한 포유 동물로서, 검출하려고 하는 암에 이환되지 않는 동물을 의미한다. 바람직한 건상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 「P」 또는 「P값」이란 통계학적 검정에 있어서, 귀무가설 하에서 실제로 데이터로부터 계산된 통계량보다 극단적인 통계량이 관측될 확률을 나타낸다. 따라서 「P」 또는 「P값」이 작을수록 비교대상간에 유의차가 있다고 간주할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「감도」는 (진양성의 수)/(진양성의 수+위음성의 수)의 비율을 의미한다. 감도가 높으면 악성 뇌종양을 조기에 발견하는 것이 가능해지고, 완전한 암부의 절제나 재발율의 저하로 이어진다.
본 명세서에 있어서, 「특이도」는 (진음성의 수)/ (진음성의 수+위양성의 수)의 비율을 의미한다. 특이도가 높으면 건상체를 악성 뇌종양 환자로 오판별하는 것에 의한 불필요한 추가 검사의 실시를 막고, 환자의 부담의 경감이나 의료비의 삭감에 연결된다.
본 명세서에 있어서, 「정밀도」는 (진양성의 수+진음성의 수)/(전체 증례수)의 비율을 의미한다. 정밀도는 전체 검체에 대한 판별 결과가 옳았던 비율을 나타내고 있고, 판별 성능(검출 성능)을 평가하는 제 1 지표가 된다.
본 명세서에 있어서 판정, 검출 또는 진단 등의 대상이 되는 「검체」란 악성 뇌종양의 발생, 악성 뇌종양의 진행, 또는 악성 뇌종양에 대한 치료 효과의 발휘에 따라 본 발명의 유전자의 발현이 변화되는 조직 및 생체재료를 가리킨다. 구체적으로는 뇌조직 및 그 주변의 혈관, 수막, 전이가 의심되는 장기, 피부, 및 혈액, 뇨, 수액, 타액, 땀, 조직 침출액 등의 체액, 혈액으로부터 조제된 혈청, 혈장, 및 기타, 변, 모발 등을 가리킨다. 또한 이들 검체로부터 추출된 생체시료, 구체적으로는 RNA나 miRNA 등의 유전자를 사용하는 경우도 상기 검체를 사용한 판정, 검출 또는 진단 등에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-1909-3p 유전자」 또는 「hsa-miR-1909-3p」라고 하는 용어는, 서열번호 1에 기재된 hsa-miR-1909-3p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0007883)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-1909-3p 유전자는 BarM 등, 2008년, Stem Cells, 26권, p2496-2505에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-1909-3p」의 전구체로서 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-1909」(miRBase Accession No.MI0008330, 서열번호 12)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-6869-5p 유전자」 또는 「hsa-miR-6869-5p」라고 하는 용어는, 서열번호 2에 기재된 hsa-miR-6869-5p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0027638)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-6869-5p 유전자는 Ladewig E 등, 2012년, Genome Res, 22권, p1634-1645에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-6869-5p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-6869」 (miRBase Accession No.MI 0022716, 서열번호 13)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-3178 유전자」 또는 「hsa-miR-3178」이라고 하는 용어는, 서열번호 3에 기재된 hsa-miR-3178 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0015055)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-3178 유전자는 Stark MS 등, 2010년, PLoS One, 5권, e9685에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-3178」의 전구체로서 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-3178」 (miRBase Accession No.MI 0014212, 서열번호 14)이 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-4787-5p 유전자」 또는 「hsa-miR-4787-5p」이라고 하는 용어는 서열번호 4에 기재된 hsa-miR-4787-5p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0019956)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-4787-5p 유전자는 Persson H 등, 2011년, Cancer Res, 71권, p78-86에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-4787-5p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-4787」 (miRBase Accession No.MI 0017434, 서열번호 15)이 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-6510-5p 유전자」 또는 「hsa-miR-6510-5p」라고 하는 용어는, 서열번호 5에 기재된 hsa-miR-6510-5p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0025476)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-6510-5p 유전자는 Joyce CE 등, 2011년, Hum Mol Genet, 20권, p4025-4040에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-6510-5p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-6510」 (miRBase Accession No.MI 0022222, 서열번호 16)이 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-4695-5p 유전자」 또는 「hsa-miR-4695-5p」라고 하는 용어는, 서열번호 6에 기재된 hsa-miR-4695-5p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0019788)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-4695-5p 유전자는 Persson H 등, 2011년, Cancer Res, 71권, p78-86에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-4695-5p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-4695」 (miRBase Accession No.MI 0017328, 서열번호 17)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-4634 유전자」 또는 「hsa-miR-4634」라고 하는 용어는, 서열번호 7에 기재된 hsa-miR-4634 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0019691)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-4634 유전자는 Persson H 등, 2011년, Cancer Res, 71권, p78-86에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-4634」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-4634」 (miRBase Accession No.MI 0017261, 서열번호 18)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-4449 유전자」 또는 「hsa-miR-4449」라고 하는 용어는, 서열번호 8에 기재된 hsa-miR-4449 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0018968)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-4449 유전자는 Jima DD 등, 2010년, Blood, 116권, e118-127에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-4449」의 전구체로서 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-4449」 (miRBase Accession No.MI 0016792, 서열번호 19)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-3195 유전자」 또는 「hsa-miR-3195」라고 하는 용어는, 서열번호 9에 기재된 hsa-miR-3195 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0015079)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-3195 유전자는 Stark MS 등, 2010년, PLoS One, 5권, e9685에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-3195」의 전구체로서 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-3195」 (miRBase Accession No.MI 0014240, 서열번호 20)가 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-6836-3p 유전자」 또는 「hsa-miR-6836-3p」라고 하는 용어는, 서열번호 10에 기재된 hsa-miR-6836-3p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0027575)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-6836-3p 유전자는 Ladewig E 등, 2012년, Genome Res, 22권, p1634-1645에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-6836-3p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-6836」 (miRBase Accession No.MI 0022682, 서열번호 21)이 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 「hsa-miR-187-5p 유전자」 또는 「hsa-miR-187-5p」라고 하는 용어는, 서열번호 11에 기재된 hsa-miR-187-5p 유전자(miRBase Accession No.MIMAT0004561)나 기타 생물종 호모로그 또는 오솔로그 등을 포함한다. hsa-miR-187-5p 유전자는 Lim LP 등, 2003년, Science, 299권, p1540에 기재되는 방법에 의해 얻을 수 있다. 또한 「hsa-miR-187-5p」의 전구체로서, 헤어핀 형상 구조를 취하는 「hsa-mir-187」 (miRBase Accession No.MI 0000274, 서열번호 22)이 알려져 있다.
또한 성숙형의 miRNA는 헤어핀 형상 구조를 취하는 RNA 전구체로부터 성숙형 miRNA로서 절출될 때에, 서열의 전후 1∼수염기가 짧고, 또는 길게 절출되는 것이나, 염기의 치환이 발생해서 변이체가 되는 일이 있고, isomiR이라고 칭해진다(Morin RD. 등, 2008년, Genome Research, 제 18권, p.610-621). miRBase Release21에서는 서열번호 1∼9 및 11로 나타내어지는 염기 서열 이외에, 수많은 isomiR이라고 불리는 서열번호 23∼39로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드 변이체 및 단편도 나타내어져 있다. 이들도 또한 서열번호 1∼9 및 11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 miRNA의 변이체 또는 단편으로서 얻을 수 있다.
즉, 본 발명의 서열번호 1∼9 및 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 변이체 중, 예를 들면 miRBase Release 21에 등록되어 있는 가장 긴 변이체로서, 각각 서열번호 23∼32로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한 본 발명의 서열번호 1, 3, 4, 5, 8, 9, 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 변이체 중, 예를 들면 miRBase Release 21에 등록되어 있는 가장 짧은 변이체로서, 각각 서열번호 33∼39로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한 이들의 변이체 및 단편 이외에도, miRBase에 등록된 서열번호 1, 3, 4, 8, 9, 11의 miRNA에 대한 수많은 isomiR인 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 또한, 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예로서는, 각각 전구체인 서열번호 12∼22 중 어느 하나로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
서열번호 1∼39로 나타내어지는 유전자(miRNA)의 명칭과 miRBase Accession No.(등록 번호)를 표 1에 기재했다.
본 명세서에 있어서 「특이적으로 결합 가능한」이란 본 발명에서 사용하는 핵산, 예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머가 특정 표적 핵산과 결합해서 다른 핵산과 실질적으로 결합할 수 없는 것을 의미한다.
Figure pct00001
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본국 특허출원번호 2016-074717호의 개시 내용을 포함한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의해, 악성 뇌종양을 용이하게 또한 높은 정밀도로 검출하는 것이 가능하게 되었다.
예를 들면 환자의 저침습성으로 채취할 수 있는 검체(혈액, 혈청 등) 중의 상기 miRNA의 측정값을 지표로 하고, 용이하게 환자가 악성 뇌종양을 갖는지 아닌지를 검출(판별)할 수 있다.
도 1은, 전구체인 서열번호 12로 나타내어지는 hsa-mir-1909로부터 생성되는 서열번호 1로 나타내어지는 hsa-miR-1909-3p, 및 hsa-miR-1909-5p의 염기 서열의 관계를 나타낸다.
도 2의 좌측 도면:학습 검체군(training cohort)으로서 선택한 악성 뇌종양 환자(98명), 양성 뇌종양 환자(14명), 및 건상체(100명)의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1)의 측정값을 세로축으로 해서 각각 나타낸 것이다. 우측 도면:검증 검체군(validation cohort)으로서 선택한 악성 뇌종양 환자(49명), 양성 뇌종양 환자(7명), 및 건상체(50명)의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1)의 측정값을 세로축으로 해서 각각 나타낸 것이다.
도 3의 좌측 도면:학습 검체군으로서 선택한 악성 뇌종양 환자(98명), 건상체(100명), 및 양성 뇌종양 환자(14명)의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1), hsa-miR-6869-5p(서열번호 2)의 측정값으로부터 피셔의 판별 분석을 이용하여 판별식을 작성하고(z=-1.952×(hsa-miR-1909-3p의 발현량)-1.071×(hsa-miR-6869-5p의 발현량)+30.884), 상기 판별식으로부터 얻어진 판별 스코어를 세로축으로 하고, 검체군을 가로축으로 해서 나타낸 것이다. 도면 중의 점선은 판별 스코어가 0이 되는 양 군을 판별하는 판별 경계를 나타낸다. 우측 도면:검증 검체군으로서 선택한 악성 뇌종양 환자(49명), 건상체(50명), 및 양성 뇌종양 환자(7명)의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1), hsa-miR-6869-5p(서열번호 2)의 측정값에 대하여, 학습 검체군으로 작성한 판별식으로부터 얻어진 판별 스코어를 세로축으로 하고, 검체군을 가로축으로 해서 나타낸 것이다. 도면 중의 점선은 판별 스코어가 0이 되는 양 군을 판별하는 판별 경계를 나타낸다.
도 4의 좌측 도면(도 3의 좌측 도면과 같다):학습 검체군으로서 선택한 악성 뇌종양 환자(98명), 건상체(100명), 및 양성 뇌종양 환자(14명)의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1), hsa-miR-6869-5p(서열번호 2)의 측정값으로부터 피셔의 판별 분석을 이용하여 판별식을 작성하고(z=-1.952×(hsa-miR-1909-3p의 발현량)-1.071×(hsa-miR-6869-5p의 발현량)+30.884), 상기 판별식으로부터 얻어진 판별 스코어를 세로축으로 하고, 검체군을 가로축으로 해서 나타낸 것이다. 도면 중의 점선은 판별 스코어가 0이 되는 양 군을 판별하는 판별 경계를 나타낸다. 우측 도면:검증 검체군으로서 선택한 중추신경계 원발악성 임파종 환자 37명, 상의종 환자 6명, 신경절신경교종 환자 5명, 모양 세포성 성세포종 환자 3명의 hsa-miR-1909-3p(서열번호 1), hsa-miR-6869-5p(서열번호 2)의 측정값에 대하여, 학습 검체군으로 작성한 판별식으로부터 얻어진 판별 스코어를 세로축으로 하고, 검체군을 가로축으로 해서 나타낸 것이다. 도면 중의 점선은 판별 스코어가 0이 되는 양 군을 판별하는 판별 경계를 나타낸다.
이하에 본 발명을 더 구체적으로 설명한다
1.악성 뇌종양의 표적 핵산
본 발명의 상기 정의의 악성 뇌종양 검출용 핵산/폴리뉴클레오티드(예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머)를 사용해서 악성 뇌종양 또는 악성 뇌종양 세포의 존재 및/또는 부존재를 검출하기 위한, 악성 뇌종양 마커로서의 주요한 표적 핵산에는 hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, 및, hsa-miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 miRNA를 사용할 수 있다. 또한 이들의 miRNA와 조합해서 사용할 수 있는 악성 뇌종양 마커로서 hsa-miR-187-5p miRNA도 표적 핵산으로서 바람직하게 사용할 수 있다. 표적 핵산으로 하는 상기 miRNA에는, 예를 들면 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 인간 유전자(예를 들면 각각, hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, 및 hsa-miR-187-5p), 그 동족체, 그 전사 산물, 및 그 변이체 및 유도체가 포함된다. 여기에서, 유전자, 동족체, 전사 산물, 변이체 및 유도체는 상기 정의 대로이다.
인간 검체에 있어서의 바람직한 표적 핵산은 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 인간 유전자, 또는 그 전사 산물이며, 보다 바람직하게는 상기 전사 산물, 예를 들면 hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, 및 hsa-miR-187-5p의 miRNA, 또는 그 전구체 RNA인 pri-miRNA 또는 pre-miRNA이다.
제 1 표적 유전자는 hsa-miR-1909-3p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 2 표적 유전자는 hsa-miR-6869-5p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 3 표적 유전자는 hsa-miR-3178 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 4 표적 유전자는 hsa-miR-4787-5p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 5 표적 유전자는 hsa-miR-6510-5p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 6 표적 유전자는 hsa-miR-4695-5p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 7 표적 유전자는 hsa-miR-4634 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 8 표적 유전자는 hsa-miR-4449 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 9 표적 유전자는 hsa-miR-3195 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 10 표적 유전자는 hsa-miR-6836-3p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 지금까지 본 유전자 또는 그 전사 산물 등의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고는 알려져 있지 않다.
제 11 표적 유전자는 hsa-miR-187-5p 유전자, 그 동족체, 이들의 전사 산물, 또는 이들의 변이체 또는 유도체이다. 특허문헌 1에 있어서 hsa-miR-187-5p miRNA의 발현의 변화가 악성 뇌종양의 마커가 될 수 있다고 하는 보고가 되어 있다.
2.악성 뇌종양의 검출용 핵산
본 발명에 있어서는, 상기 악성 뇌종양 마커로서의 표적 핵산에 특이적으로 결합 가능한 핵산을, 악성 뇌종양을 검출(판별) 또는 진단하기 위한 핵산, 예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 악성 뇌종양을 검출하기 위해서, 또는 악성 뇌종양을 진단하기 위해서 사용 가능한 핵산, 예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머는 상기 악성 뇌종양 마커로서의 표적 핵산, 즉 miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, miR-6836-3p, 또는 miR-187-5p 유전자, 예를 들면 인간 유래의 hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, 또는 hsa-miR-187-5p 유전자, 또는 이들의 동족체, 이들의 전사 산물, 이들의 변이체 또는 유도체, 이들의 전구체, 또는 이들의 임의인 조합의 존재, 발현량 또는 존재량을 정성적 및/또는 정량적으로 측정하는 것을 가능하게 한다.
상기 표적 핵산은 건상체 또는 양성 뇌종양 환자와 비교해서 악성 뇌종양에 이환한 피험체에 있어서, 상기 표적 핵산의 종류에 따라 이들의 발현량이 증가하는 것도 있으면, 또는 저하하는 것도 있다(이하, 「증가/저하」라고 칭한다.). 그 때문에, 상기 표적 핵산에 특이적으로 결합 가능한 본 발명의 핵산은 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체(예를 들면 인간) 유래의 검체(예를 들면 혈액 등의 체액)와 건상체 유래의 검체에 대해서 상기 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 이들을 비교함으로써, 악성 뇌종양을 검출하기 위해서 유효하게 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 핵산은 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체(예를 들면 인간) 유래의 검체(예를 들면 혈액 등의 체액)와, 양성의 뇌종양 환자 유래의 검체에 대해서 상기 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 이들을 비교함으로써, 양성의 뇌종양 환자로부터 판별해서 악성 뇌종양을 특이적으로 검출하기 위해서 유효하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 핵산 프로브 또는 프라이머 등의 핵산은, 예를 들면 서열번호 1∼10 중 적어도 하나로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산 프로브, 또는, 서열번호 1∼10 중 적어도 하나로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머이다.
본 발명에서 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 핵산 프로브 또는 프라이머 등의 핵산으로서, 예를 들면 서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산 프로브, 또는, 서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 더 사용할 수 있다.
구체적으로는, 악성 뇌종양 검출에 사용하는 상기 핵산 프로브 또는 프라이머 등의 핵산은 서열번호 1∼39 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드군 및 그 상보적 폴리뉴클레오티드군, 상기 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드(예를 들면 DNA)와 스트린젠트한 조건(후술)으로 각각 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드군 및 그 상보적 폴리뉴클레오티드군, 및 이들의 폴리뉴클레오티드군의 염기 서열에 포함되는 15 이상, 바람직하게는 17 이상의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드군으로부터 선택된 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 이들의 폴리뉴클레오티드는 표적 핵산인 상기 악성 뇌종양 마커를 검출하기 위한 핵산 프로브 및 프라이머로서 사용할 수 있다.
더 구체적으로는, 본 발명에서 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 핵산/폴리뉴클레오티드, 예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머의 예는, 이하의 폴리뉴클레오티드(a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드이다.
(a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명에서 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 핵산, 예를 들면 핵산 프로브 또는 프라이머는 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 이외에, 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
(f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드.
상기 폴리뉴클레오티드의 「15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편」은 각 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 포함된 예를 들면 연속하는 15로부터 그 서열의 전체 염기수 미만, 17로부터 그 서열의 전체 염기수 미만, 19로부터 그 서열의 전체 염기수 미만, 등의 범위의 염기수의 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는 것으로 한다.
본 발명에서 사용되는 상기 폴리뉴클레오티드류 또는 그 단편류는 모두 DNA이어도 좋고 RNA이어도 좋다. 또 소정의 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
본 발명에서 사용 가능한 상기 폴리뉴클레오티드는, DNA 재조합 기술, PCR법, DNA/RNA 자동 합성기에 의한 방법 등의 일반적인 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
DNA 재조합 기술 및 PCR법은, 예를 들면 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey&Sons, US(1993); Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989) 등에 기재되는 기술을 사용할 수 있다.
서열번호 1∼11로 나타내어지는 인간 유래의 hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, 및, hsa-miR-187-5p는 공지이며, 상기한 바와 같이 그 취득 방법도 알려져 있다. 이 때문에, 이 유전자를 클로닝함으로써, 본 발명에서 사용 가능한 핵산 프로브 또는 프라이머로서의 폴리뉴클레오티드를 제작할 수 있다.
그러한 악성 뇌종양 검출용 핵산 프로브 또는 프라이머 등의 핵산은 DNA 자동 합성 장치를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이 합성에는 일반적으로 포스포아미다이트법이 사용되고, 이 방법에 의해 약 100염기까지의 단일쇄 DNA를 자동 합성할 수 있다. DNA 자동 합성 장치는, 예를 들면 Polygen사, ABI사, Applied BioSystems사 등으로부터 시판되고 있다.
또는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 cDNA 클로닝법에 의해 제작할 수도 있다. cDNA 클로닝 기술은, 예를 들면 microRNA Cloning Kit Wako 등을 이용할 수 있다.
여기에서, 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 miRNA 또는 그 전구체로서는 생체내에 존재하지 않고 있다. 예를 들면 서열번호 1로 나타내어지는 hsa-miR-1909-3p의 염기 서열은 서열번호 12로 나타내어지는 전구체 hsa-mir-1909로부터 생성되지만, 이 전구체는 도 1에 나타내는 헤어핀 형상 구조를 갖고 있고, hsa-miR-1909-3p(서열번호 1) 및 hsa-miR-1909-5p의 염기 서열은 서로 미스매치 서열을 갖고 있다. 이 때문에, 서열번호 1로 나타내어지는 hsa-miR-1909-3p의 염기 서열에 대해서 완전하게 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 생체내에서 자연히 생성되는 일은 없다. 마찬가지로, 서열번호 2∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열에 완전하게 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 생체내에 존재하지 않는 인공적인 염기 서열을 갖는다. 여기에서 목적의 염기 서열에 대해서 완전하게 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드란, 목적의 염기 서열의 전체 길이 서열에 상보적인 염기 서열만으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
3.악성 뇌종양 검출용 키트 또는 디바이스
본 발명은 또한 악성 뇌종양 마커인 표적 핵산을 측정하기 위한, 본 발명에 있어서 핵산 프로브 또는 프라이머로서 사용 가능한 폴리뉴클레오티드(이것에는, 변이체, 단편, 또는 유도체도 포함할 수 있다.; 이하, 검출용 폴리뉴클레오티드라고 칭하는 일이 있다) 중 하나 또는 복수를 포함하는 악성 뇌종양 검출용 키트 또는 디바이스를 제공한다.
본 발명에 있어서의 악성 뇌종양 마커인 표적 핵산은, 바람직하게는, 이하의 군 1로부터 선택되는 1개 이상이다: miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및 miR-6836-3p. 이들의 악성 뇌종양 마커와 조합해서 miR-187-5p 등의 다른 악성 뇌종양 마커를 표적 핵산으로서 더 사용해도 된다.
본 발명의 키트 또는 디바이스는 상기 악성 뇌종양 마커인 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산, 바람직하게는, 상기 「2.악성 뇌종양의 검출용 핵산」에 기재된 악성 뇌종양 검출용 핵산 프로브 또는 프라이머 등의 핵산, 구체적으로는 상기 2에 기재한 폴리뉴클레오티드류로부터 선택되는 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구체적으로는, 본 발명의 키트 또는 디바이스는, 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열을 포함하는(또는, 로 이루어지는) 폴리뉴클레오티드, 그것에 상보적인 염기 서열을 포함하는(또는, 로 이루어지는) 폴리뉴클레오티드, 이들의 폴리뉴클레오티드의 변이체 또는 유도체, 이들의 폴리뉴클레오티드의 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 단편, 및 이들의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 디바이스에 포함할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드 단편은, 예를 들면 하기의 (1)의 군으로부터 선택되는 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드이다.
(1)서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열에 포함되는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
바람직한 실시형태에서는 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열, 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 상보적 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 이들의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 폴리뉴클레오티드 서열의 15 이상, 바람직하게는 17 이상, 보다 바람직하게는 19 이상의 연속된 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편이다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 단편의 사이즈는 각 폴리뉴클레오티드의 염기 서열에 대하여, 예를 들면 연속하는 15로부터 그 서열의 전체 염기수 미만, 17로부터 그 서열의 전체 염기수 미만, 19로부터 그 서열의 전체 염기수 미만 등의 범위의 염기수이다.
본 발명의 키트 또는 디바이스를 구성하는 상기 폴리뉴클레오티드의 조합은, 예를 들면 후술의 표 1에 나타내어지는 서열번호(표 1 중의 miRNA 마커에 대응하는 서열번호 1∼11)에 의해 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열(상보 서열)로 이루어지는 상기 폴리뉴클레오티드의 임의의 조합이어도 좋다. 예를 들면 표 6에 기재된 조합의 서열번호로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드의 각각과 특이적으로 결합 가능한 핵산의 조합을 들 수 있지만, 이들은 어디까지나 예시이며, 다른 여러가지 가능한 조합의 전부가 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
예를 들면 본 발명에 있어서 악성 뇌종양과 건상체를 판별하기 위한 키트 또는 디바이스를 구성하는 상기 폴리뉴클레오티드의 조합으로서는, 표 1에 나타내어지는 서열번호(표적 핵산)의 2개 이상에 대해서, 각각의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열 또는 이들의 단편 등으로 이루어지는 상기 폴리뉴클레오티드를 조합한 것이 바람직하다. 통상에서는 표 1에 나타내어지는 서열번호의 2개의 조합으로 충분한 판별 성능을 얻을 수 있지만, 3개 이상을 조합해도 좋다.
구체적으로는 악성 뇌종양 환자를 양성 뇌종양 환자 및 건상체와 판별하기 위한 표적 핵산으로서 사용하는 2개의 폴리뉴클레오티드의 조합으로서, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 2개의 조합 중, 악성 뇌종양 마커로서 신규로 발견된 서열번호 1∼10으로부터 선택되는 1개 이상을 포함하는 조합이 바람직하다. 그러한 조합의 표적 핵산의 각각과 특이적으로 결합 가능한 핵산의 조합을, 악성 뇌종양과 건상체를 판별하기 위한 키트 또는 디바이스에 있어서 사용할 수 있다.
상기 암종특이성이 있는 폴리뉴클레오티드(표적 핵산)의 조합의 개수로서는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 개수의 조합이 가능하지만, 보다 바람직하게는 4개 이상의 조합이며, 통상에서는 4개의 조합으로 충분한 판별 성능을 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용하는 표적 핵산(악성 뇌종양 마커)의 조합으로서, 비한정적으로, 서열번호 1로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와, 상기 암종특이성 폴리뉴클레오티드군 1에 포함되는 다른 서열번호(서열번호 2∼10) 및 서열번호 11(miR-187-5p)부터 선택되는 3개의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 조합을 이하에 예시한다.
(1)서열번호 1, 3, 4, 6(마커:miR-1909-3p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-4695-5p)의 조합
(2)서열번호 1, 3, 5, 6(마커:miR-1909-3p, miR-3178, miR-6510-5p, miR-4695-5p)의 조합
(3)서열번호 1, 3, 7, 8(마커:miR-1909-3p, miR-3178, miR-4634, miR-4449)의 조합
(4)서열번호 1, 3, 7, 10(마커:miR-1909-3p, miR-3178, miR-4634, miR-6836-3p)의 조합
(5)서열번호 1, 3, 7, 11(마커:miR-1909-3p, miR-3178, miR-4634, miR-187-5p)의 조합
본 발명에서 사용하는 표적 핵산(악성 뇌종양 마커)의 조합으로서, 비한정적으로, 서열번호 2로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와, 상기 암종특이성 폴리뉴클레오티드군 1에 포함되는 다른 서열번호(서열번호 1, 3∼10) 및 서열번호 11(miR-187-5p)부터 선택되는 3개의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 조합을 이하에 예시한다.
(1)서열번호 2, 3, 5, 7(마커:miR-6869-5p, miR-3178, miR-6510-5p, miR-4634)의 조합
(2)서열번호 2, 4, 5, 11(마커:miR-6869-5p, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-187-5p)의 조합
(3)서열번호 2, 5, 6, 11(마커:miR-6869-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-187-5p)의 조합
(4)서열번호 2, 5, 7, 11(마커:miR-6869-5p, miR-6510-5p, miR-4634, miR-187-5p)의 조합
(5)서열번호 2, 5, 9, 11(마커:miR-6869-5p, miR-6510-5p, miR-3195, miR-187-5p)의 조합
본 발명에서 사용하는 표적 핵산(악성 뇌종양 마커)의 조합으로서, 비한정적으로, 서열번호 3으로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와, 상기 암종특이성 폴리뉴클레오티드군 1에 포함되는 다른 서열번호(서열번호 1∼2, 4∼10) 및 서열번호 11(miR-187-5p)부터 선택되는 3개의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 조합을 이하에 예시한다.
(1)서열번호 3, 4, 5, 9(마커:miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-3195)의 조합
(2)서열번호 3, 4, 5, 10(마커:miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-6836-3p)의 조합
(3)서열번호 3, 4, 5, 11(마커:miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-187-5p)의 조합
(4)서열번호 3, 5, 9, 10(마커:miR-3178, miR-6510-5p, miR-3195, miR-6836-3p)의 조합
(5)서열번호 3, 5, 9, 11(마커:miR-3178, miR-6510-5p, miR-3195, miR-187-5p)의 조합
상기에서 예시한 조합의 표적 핵산의 각각과 특이적으로 결합 가능한 핵산을, 본 발명의 키트 또는 디바이스, 또는 악성 뇌종양의 검출(판별) 방법에 있어서, 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드의 셋트로서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 디바이스에는 위에서 설명한 본 발명에 있어서의 악성 뇌종양의 검출용 폴리뉴클레오티드(이것에는, 서열번호 1∼10 중 적어도 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 단편또는 유도체를 포함할 수 있다.)에 추가하여, 악성 뇌종양 검출을 가능하게 하는 기지의 폴리뉴클레오티드 또는 장래 발견될 폴리뉴클레오티드도 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 상기 폴리뉴클레오티드는 개별적으로 또는 임의로 조합해서 다른 용기에 포장될 수 있다.
본 발명의 키트에는, 체액, 세포 또는 조직으로부터 핵산(예를 들면 total RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 더 포함시킬 수 있다.
본 발명의 디바이스는, 위에서 설명한 본 발명에 있어서의 폴리뉴클레오티드 등의 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 암 마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는, 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이성의 점에서는, 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은, 임의이며, 예를 들면 방형, 환형, 직사각형, 필름형 등이다. 본 발명의 디바이스에는, 예를 들면 하이브리다이제이션 기술에 의한 측정을 위한 디바이스가 포함되고, 구체적으로는 블롯팅 디바이스, 핵산 어레이(예를 들면 마이크로 어레이, DNA칩, RNA칩 등) 등이 예시된다.
핵산 어레이 기술은 필요에 따라서 L리신 코팅이나 아미노기, 카르복실기 등의 관능기 도입 등의 표면처리가 실시된 고상의 표면에 스폿터 또는 어레이어라고 불리는 고밀도 분주기를 이용하여 핵산을 스폿하는 방법, 노즐로부터 미소한 액적을 압전소자 등에 의해 분사하는 잉크젯을 이용하여 핵산을 고상에 분사하는 방법, 고상 상에서 순차 뉴클레오티드 합성을 행하는 방법 등의 방법을 이용하여, 상기 핵산을 하나씩 결합 또는 부착시킴으로써 칩 등의 어레이를 제작하고, 이 어레이를 이용하여 하이브리다이제이션을 이용해서 표적 핵산을 측정하는 기술이다.
본 발명의 키트 또는 디바이스는 상기 군 1의 악성 뇌종양 마커인 miRNA의 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 더 바람직하게는 적어도 3개, 가장 바람직하게는 적어도 5개로부터 전부의 폴리뉴클레오티드의 각각과 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함한다. 본 발명의 키트 또는 디바이스는 또한, 경우에 따라, 기지의 악성 뇌종양 마커인 miR-187-5p와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트 또는 디바이스는 하기 「4.악성 뇌종양의 검출 방법」의 악성 뇌종양의 검출을 위해서 사용할 수 있다.
4.악성 뇌종양의 검출 방법
본 발명은 또한, 상기 「3.악성 뇌종양 검출용 키트 또는 디바이스」에서 설명한 본 발명의 키트 또는 디바이스(본 발명에서 사용 가능한 상기 핵산을 포함한다.) 또는 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드를 이용하여 검체 중의 표적 핵산의 발현량, 구체적으로는 이하의 군:miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및 miR-6836-3p로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 및 경우에 따라 miR-187-5p 유전자의 발현량(전형적으로는, miRNA 또는 miRNA 전구체의 양)을 측정하는(바람직하게는 in vitro에서 측정하는) 것을 포함하는 악성 뇌종양의 검출 방법을 제공한다. 본 방법에서는, 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체로부터 채취한 검체(예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 등)에 대해서, 검체 중의 표적 핵산의 발현량을 측정한 후, 또한, 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체의 검체의 상기 표적 핵산의 발현량 측정값과, 비악성 대조군(건상체 또는 양성의 뇌종양 환자를 포함한다)으로부터 채취한 같은 검체(예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 등)에서 얻어진 동일한 표적 핵산의 발현량(대조 발현량)을 사용한 분석을 행하고, 예를 들면 양 발현량을 비교한다. 본 방법은 양자의 상기 검체 중의 표적 핵산의 발현량에 통계학적으로 유의하게 차가 있는 경우, 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있다고 평가하는 것을 포함해도 좋다. 본 방법은 피험체 유래의 검체에 대해서 측정한 상기 표적 핵산의 발현량과, 비악성 대조군의 발현량을 이용하여(이들을 비교해서), 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는 것 또는 악성 뇌종양에 이환되어 있지 않은 것(악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부)을 평가하고, 악성 뇌종양의 유무를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부의 평가는 악성 뇌종양에의 이환의 유무를 나타내는 지표를 얻는 것이어도 좋다. 악성 뇌종양에의 이환을 나타내는 지표값이 얻어진 경우에는, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 존재가 검출되었다고 판단하고, 악성 뇌종양에 이환되어 있지 않은 것을 나타내는 지표값이 얻어진 경우에는, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양이 검출되지 않았다고 판단할 수 있다.
본 발명의 상기 방법은, 저칩습적으로 감도 및 특이도가 높은 암의 조기진단을 가능하게 하고, 이에 따라 조기의 치료 및 예후의 개선을 초래하고, 또한, 질병증오의 모니터나 외과적, 방사선요법적, 및 화학요법적인 치료의 유효성의 모니터를 가능하게 한다.
본 발명의 상기 방법에서는, 본 발명의 혈액, 혈청, 혈장 등의 검체로부터 악성 뇌종양 유래의 표적 핵산을 포함할 수 있는 핵산(전형적으로는 RNA)을 추출하고, 그 핵산 추출물을 본 발명의 키트 또는 디바이스 또는 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드를 사용한 표적 핵산 검출 분석에 제공해도 좋다. 표적 핵산 검출 분석에 제공하는 핵산을 검체로부터 추출하는 방법으로서 3D-Gene(등록상표) RNA extraction reagent from liquid sample kit(도레이 가부시키가이샤) 중의 RNA 추출용 시약을 첨가해서 조제하는 것이 특히 바람직하지만, 일반적인 산성 페놀법(Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform(AGPC)법)을 사용해도 좋고, Trizol(등록상표)(Life Technologies사)을 사용해도 좋고, Trizol(life technologies사)이나 Isogen(닛폰젠사) 등의 산성 페놀을 포함하는 RNA 추출용 시약을 첨가해서 조제해도 좋다. 또한, miRNeasy(등록상표) Mini Kit(Qiagen사) 등의 키트를 이용할 수 있지만, 이들의 방법에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 키트 또는 디바이스, 또는 이들에 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드(1개의 상기 표적 핵산 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 2개 이상의 상기 표적 핵산 miRNA의 각각과 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드의 조합)의 피험체 유래의 검체 중의 악성 뇌종양 유래의 miR 유전자의 발현산물의 in vitro에서의 검출을 위한 사용을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 키트 또는 또는 디바이스, 또는 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드(하나의 상기 표적 핵산 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 2개 이상의 상기 표적 핵산 miRNA의 각각과 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드의 조합)의 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 검출에 있어서의 사용을 제공한다. 본 발명은 또한 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 검출 또는 진단용의 본 발명의 키트 또는 또는 디바이스, 또는 상기 폴리뉴클레오티드(1개의 상기 표적 핵산 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 2개 이상의 상기 표적 핵산 miRNA의 각각과 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드의 조합)를 제공한다. 본 발명은, 상기 폴리뉴클레오티드(하나의 상기 표적 핵산 miRNA와 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드, 또는 2개 이상의 상기 표적 핵산 miRNA의 각각과 특이적으로 결합 가능한 폴리뉴클레오티드의 조합)를 포함하는 악성 뇌종양에 대한 진단약도 제공한다. 본 발명의 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드, 키트 및 디바이스 등은 악성 뇌종양의 진단에 유용하다.
본 발명의 상기 방법에 있어서, 상기 키트 또는 디바이스는 위에서 설명한 본 발명에서 사용 가능한 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드를 단일로 또는 모든 가능한 조합으로 포함하는 것이 사용된다.
본 발명의 악성 뇌종양의 검출 또는 (유전자) 진단에 있어서, 본 발명의 키트 또는 디바이스에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 프로브 또는 프라이머로서 사용할 수 있다. 프라이머로서 사용하는 경우에는, Life Technologies사의 TaqMan(등록상표) MicroRNA Assays, Qiagen사의 miScript PCR System 등을 이용할 수 있지만, 이들의 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 키트 또는 디바이스에 포함되는 폴리뉴클레오티드는, 노던 블로팅법, 서던 블로팅법, in situ 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법, 서던 하이브리다이제이션법 등의 하이브리다이제이션 기술, 정량 RT-PCR법 등의 정량 증폭 기술 등의 특정 유전자를 특이적으로 검출하는 공지의 방법에 있어서 정법에 따라서 프라이머 또는 프로브로서 이용할 수 있다. 측정 대상 검체로서는 사용하는 검출 방법의 종류에 따라, 피험체의 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등의 체액을 채취한다. 또는, 그러한 체액으로부터 상기 방법에 의해 조제한 total RNA를 사용해도 좋고, 또한 상기 RNA를 기초로 해서 조제되는 cDNA를 포함하는 각종 폴리뉴클레오티드를 사용해도 좋다.
본 발명의 키트 또는 디바이스는 악성 뇌종양의 진단 또는 이환의 유무의 검출을 위해서 유용하다. 구체적으로는, 상기 키트 또는 디바이스를 사용한 악성 뇌종양의 검출은 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체로부터, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등의 검체를 이용하여 상기 키트 또는 디바이스에 포함되는 핵산 프로브 또는 프라이머로 검출되는 유전자의 발현량을 in vitro에서 검출함으로써 행할 수 있다. 악성 뇌종양의 이환이 의심되는 피험체의 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등의 검체 중의 표적 핵산(miRNA 등의 악성 뇌종양 마커)의 양을 본 발명의 키트 또는 디바이스에 포함되는 서열번호 1∼11 중 적어도 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 이들의 변이체 또는 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 이들의 단편을 이용하여 측정하고, 그 발현량이 비악성 대조군(건상체 또는 양성 뇌종양 환자)의 혈액, 혈청, 또는 혈장, 뇨 등의 검체 중의 이들의 발현량과 비교해서 통계학적으로 유의하게 차가 있는 경우, 예를 들면 판별식을 이용하여 상기 피험체는 악성 뇌종양에 이환되어 있다고 평가할 수 있다.
본 발명의 방법은 CT 스캔이나 MRI(핵자기공명 장치), 뇌혈관 조영법 등의 화상진단법과 조합시킬 수 있다.
본 발명의 키트 또는 디바이스를 이용한 검체 중에 악성 뇌종양 유래의 상기 miR 유전자의 발현산물이 포함되지 않는 것, 또는 악성 뇌종양 유래의 상기 miR 유전자의 발현산물이 포함되는 것의 검출 방법은 피험체의 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등의 체액을 검체로서 채취하고, 그것에 포함되는 표적 유전자(miR 유전자)의 발현량을 본 발명의 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드군으로부터 선택된 단수 또는 복수의 폴리뉴클레오티드(변이체, 단편 또는 유도체를 포함한다.)를 이용하여 측정 함으로써, 악성 뇌종양의 유무를 평가하거나 또는 악성 뇌종양을 검출하는 것을 포함한다. 또 본 발명의 악성 뇌종양의 검출 방법을 이용하여, 예를 들면 악성 뇌종양 환자에 있어서, 상기 질환의 개선을 위해서 치료약을 투여한 경우에 있어서의 상기 질환의 개선의 유무 또는 개선의 정도를 평가 또는 진단할 수도 있다.
본 발명의 방법은, 예를 들면 이하의 (a), (b) 및 (c)의 스텝:
(a)피험체 유래의 검체를 in vitro에서 본 발명의 키트 또는 디바이스 중의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 스텝,
(b)검체 중의 표적 핵산의 발현량을 상기 폴리뉴클레오티드를 핵산 프로브 또는 프라이머로서 사용해서 측정하는 스텝,
(c) (b)의 결과를 기초로 상기 피험체 중의 악성 뇌종양(세포)의 존재 또는 부존재를 평가하는 스텝,
을 포함할 수 있다.
상기 스텝(a)에서는 바람직한 검체로서, 혈액, 혈청, 또는 혈장을 사용할 수 있다.
상기 스텝(b)에서는 발현량의 측정을 핵산 어레이법 등의 하이브리다이제이션 기술, 시퀀서 등에 의해 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 결정하는 기술, 정량 RT-PCR법 등의 정량 증폭 기술 등의 기술에 의해 행할 수 있다.
상기 스텝(c)는 (b)의 결과를 기초로, 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부를 평가하고, 그것에 의해서 상기 피험체에 있어서의 악성 뇌종양(세포)의 존재 또는 부존재를 검출하는 스텝이어도 좋다. 상기 스텝(c)에서는 피험체 유래의 검체 중의 표적 핵산의 발현량이 건상체 또는 양성 뇌종양 환자(비악성 대조군) 유래의 검체 중의 표적 핵산의 발현량(「참조」 (Reference) 또는 「대조」(Control)이라고도 한다.)과 비교해서 통계학적으로 유의한 차가 있는 경우, 피험체 유래의 검체 중의 표적 핵산의 발현량과 판별식으로부터 얻어진 판별 스코어에 의거하여 상기 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부를 평가(판별)할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명은, miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및, miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개(1개 또는 복수), 바람직하게는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 그 이상의 표적 핵산 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 이용하여 피험체의 검체에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 상기 측정된 발현량과 마찬가지로 측정된 건상체 또는 양성 뇌종양 환자(비악성 대조군)의 발현량(대조 발현량)을 이용하여, 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는 것 또는 악성 뇌종양에 이환되어 있지 않은 것(악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부)을 in vitro에서 평가하고, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 유무(존재 또는 부존재)를 검출하는 것을 포함하는 악성 뇌종양의 검출 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서 「평가」한다란, 의사에 의한 판정이 아닌 in vitro에서의 검사에 의한 결과에 근거한 평가 지원이어도 좋다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 구체적으로는, miR-1909-3p가 hsa-miR-1909-3p이며, miR-6869-5p가 hsa-miR-6869-5p이며, miR-3178이 hsa-miR-3178이며, miR-4787-5p가 hsa-miR-4787-5p이며, miR-6510-5p가 hsa-miR-6510-5p이며, miR-4695-5p가 hsa-miR-4695-5p이며, miR-4634가 hsa-miR-4634이며, miR-4449가 hsa-miR-4449이며, miR-3195가 hsa-miR-3195이며, miR-6836-3p가 hsa-miR-6836-3p이다.
또한 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에 있어서, 구체적으로는, 상기 표적 핵산과 특이적으로 결합 가능한 핵산(구체적으로는, 통상은 프로브 또는 프라이머)이 하기의 (a)∼(e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 방법에서는, 이들의 폴리뉴클레오티드에 추가해서 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 더 사용할 수 있다.
바람직한 실시형태에서는 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산에 대해서 구체적으로는 miR-187-5p가 hsa-miR-187-5p이다.
또한, 바람직한 실시형태에서는 구체적으로는, miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산은 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
(f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
(i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
(j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 검체로서는, 피험체의 생체조직, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 수액 등의 체액 등, 바람직하게는 혈액, 혈청, 또는 혈장을 들 수 있다. 상기 생체조직 또는 체액 등의 검체를 직접 발현량의 측정에 사용해도 좋고, 이들의 검체로부터 조제되는 RNA 함유 핵산시료, 그것으로부터 더 조제되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시료를 측정을 위해서 사용해도 좋다.
본 명세서에서 피험체란, 포유 동물, 예를 들면 비한정적으로 인간, 원숭이, 마우스, 래트 등을 가리키고, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 방법은, 측정 대상으로서 사용하는 검체의 종류에 따라 스텝을 변경할 수 있다.
측정 대상물로서 RNA를 이용할 경우, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양(세포)의 검출은, 예를 들면 하기의 스텝(a), (b) 및 (c):
(a)피험체의 검체로부터 조제된 RNA 또는 그것으로부터 전사된 상보적 폴리뉴클레오티드(cDNA)를 본 발명의 키트 또는 디바이스 중의 폴리뉴클레오티드와 결합시키는 스텝,
(b)상기 폴리뉴클레오티드에 결합한 검체 유래의 RNA 또는 상기 RNA로부터 합성된 cDNA를, 상기 폴리뉴클레오티드를 핵산 프로브로서 사용하는 하이브리다이제이션 기술에 의해, 또는, 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 정량 RT-PCR에 의해, 또는, 시퀀서로 폴리뉴클레오티드(상기 RNA 또는 cDNA)의 염기 서열을 결정함으로써, 정량적으로 또는 정성적으로 측정하는 스텝,
(c)상기 (b)의 측정 결과에 의거하여 악성 뇌종양(또는 악성 뇌종양 유래의 유전자 발현량의 변화)의 존재 또는 부존재를 검출하는 스텝,
을 포함할 수 있다. 스텝(c)에서는 상기 (b)의 측정 결과에 의거하여 건상체 또는 양성 뇌종양 환자(비악성 대조군)와 비교해서 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부를 평가하고, 그것에 의해서 피험체에 있어서의 악성 뇌종양(또는 악성 뇌종양 유래의 유전자 발현량의 변화)의 존재 또는 부존재를 검출해도 좋다. 스텝(a)은 검체 유래의 RNA 또는 cDNA를 결합시킨 후의 본 발명의 키트 또는 디바이스를 완충액 등의 세정액에 의해 세정하고, 그것에 의해서 본 발명의 키트 또는 디바이스 중의 폴리뉴클레오티드에 미결합의 폴리뉴클레오티드를 제거하는 것을 더 포함하는 것도 바람직하다.
본 발명에 의해 악성 뇌종양(또는 악성 뇌종양 유래의 유전자 발현량의 변화)을 in vitro에서 검출, 검사, 평가 또는 진단하기 위해서, 예를 들면 여러가지 하이브리다이제이션법을 사용할 수 있다. 이러한 하이브리다이제이션법에는, 예를 들면 노던 블로팅법, 서던 블로팅법, RT-PCR법, DNA칩 해석법, in situ 하이브리다이제이션법, 노던 하이브리다이제이션법, 서던 하이브리다이제이션법, 시퀀서 등에 의해 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 결정하는 기술 등을 사용할 수 있다.
노던 블롯법을 이용하는 경우에는, 본 발명에서 사용 가능한 상기 핵산 프로브를 사용함으로써, RNA 중의 각 유전자 발현의 유무나 그 발현량을 검출, 측정할 수 있다. 구체적으로는, 핵산 프로브(상보쇄)를 방사성 동위원소(32P, 33P, 35S 등)나 형광물질 등으로 표지하고, 그것을 상법에 따라서 나일론 멤브레인 등으로 트랜스퍼한 피험체의 생체조직 또는 체액(혈액, 혈청, 혈장 등) 등의 검체 유래의 RNA와 하이브리다이즈시킨 후, 형성된 DNA/RNA 2중쇄의 표지물(방사성 동위원소 또는 형광물질)에 유래하는 시그널을 방사선 검출기(BAS-1800II(후지샤신필름 가부시키가이샤) 등을 예시할 수 있다) 또는 형광 검출기(STORM 865(GE 헬스케어사) 등을 예시할 수 있다)로 검출, 측정하는 방법을 예시할 수 있다.
정량 RT-PCR법을 이용하는 경우에는, 본 발명에서 사용 가능한 상기 프라이머를 사용함으로써, RNA 중의 유전자 발현의 유무나 그 발현량을 검출, 측정할 수 있다. 구체적으로는, 피험체의 생체조직 또는 체액(혈액, 혈청, 혈장등) 등의 검체 유래의 RNA로부터 상법에 따라서 cDNA를 조제하고, 이것을 주형으로서 표적의 각 유전자의 영역을 증폭할 수 있도록, 본 발명의 1쌍의 프라이머(상기 cDNA에 결합하는 정쇄와 역쇄로 이루어진다)를 cDNA와 하이브리다이즈시켜서 상법에 의해 PCR법을 행하고, 얻어진 이중쇄 DNA를 검출하는 방법을 예시할 수 있다. 또, 이중쇄 DNA의 검출법으로서는, 상기 PCR을 미리 방사성 동위원소나 형광물질로 표지해 둔 프라이머를 이용하여 행하는 방법, PCR 산물을 아가로스겔로 전기영동하고, 에튬 브로마이드 등으로 이중쇄 DNA를 염색해서 검출하는 방법, 생산된 이중쇄 DNA를 상법에 따라서 나일론 멤브레인 등으로 트랜스퍼시켜서 표지한 핵산 프로브와 하이브리다이즈시켜서 검출하는 방법을 포함할 수 있다.
시퀀서를 이용할 경우에는, 본 발명에서 사용 가능한 상기 프라이머를 사용함으로써, 리드수로부터 RNA 중의 유전자 발현의 유무나 그 발현량을 검출 또는 측정할 수 있는, 구체적으로는, 예를 들면 피험체의 생체조직 또는 체액(혈액, 혈청, 혈장 등) 등의 검체 유래의 RNA로부터 상법에 따라서 cDNA를 조제하고, 이것을 주형으로서 표적 핵산인 miR 유전자 발현 산물의 적어도 일부의 영역을 증폭할 수 있게 설계된 프라이머쌍(각 프라이머는 상기 cDNA에 결합하는 정쇄서열과 역쇄서열의 각각을 포함한다)을 상기 cDNA와 하이브리다이즈시켜서 상법에 의해 PCR 등의 핵산증폭을 행하고, 증폭한 DNA를 시퀀서로 검출 또는 측정하는 방법을 예시할 수 있다. 시퀀서로서는, 예를 들면 HiSeq 2500(Illumina) 또는 Ion Proton(등록상표) System(Thermo Fisher Scientific)을 사용할 수 있다. 또는, 피험체의 생체조직 또는 체액(혈액, 혈청, 혈장 등) 등의 검체를, 검체 중의 RNA를 핵산 증폭하지 않고, 직접, PacBio RS II(Pacific Biosciences) 등의 시퀀서에 걸쳐서, 표적 핵산을 검출 또는 측정하는 방법도 예시된다.
핵산 어레이 기술(핵산 어레이 해석)을 이용하는 경우에는, 본 발명의 핵산 프로브(단일쇄 또는 이중쇄)를 기판(고상)에 붙인 RNA칩 또는 DNA칩을 사용한다. 핵산 프로브를 붙인 영역을 프로브 스폿, 핵산 프로브를 붙이지 않은 영역을 블랭크 스폿이라고 칭한다. 유전자군을 기판에 고상화한 것에는, 일반적으로 핵산 칩, 핵산 어레이, 마이크로 어레이 등이라고 하는 명칭이 있고, DNA 또는 RNA 어레이에는 DNA 또는 RNA 매크로 어레이와 DNA 또는 RNA 마이크로 어레이가 포함되지만, 본 명세서에서는 칩이라고 한 경우, 이들 모두를 포함하는 것으로 한다. DNA칩으로서는 3D-Gene(등록상표) Human miRNA Oligo chip(도레이 가부시키가이샤)을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
DNA칩의 측정은 한정되지 않지만, 예를 들면 핵산 프로브의 표지물에 유래하는 시그널을 화상 검출기(Typhoon 9410(GEhealth kea사), 3D-Gene(등록상표) 스캐너(도레이 가부시키가이샤) 등을 예시할 수 있다)로 검출, 측정하는 방법을 예시할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용하는 「스트린젠트한 조건」이란 전술한 바와 같이 핵산 프로브가 다른 서열에 대한 보다 큰 정도(예를 들면 백그라운드 측정값의 평균+백그라운드 측정값의 표준오차×2 이상의 측정값)로 그 표적서열에 대하여 하이브리다이즈하는 조건이다.
스트린젠트한 조건은 하이브리다이제이션과 그 후의 세정의 조건에 의해, 규정된다. 그 하이브리다이제이션의 조건은, 한정되지 않지만, 예를 들면 30℃∼60℃에서, SSC, 계면활성제, 포름아미드, 덱스트란 황산염, 블록킹제 등을 포함하는 용액 중에서 1∼24시간의 조건으로 한다. 여기에서, 1×SSC는 150mM 염화나트륨 및 15mM 시트르산 나트륨을 포함하는 수용액(pH7.0)이며, 계면활성제는 SDS(도데실 황산나트륨), Triton, 또는 Tween 등을 포함한다. 하이브리다이제이션 조건으로서는, 보다 바람직하게는 3∼10×SSC, 0.1∼1% SDS를 포함한다. 스트린젠트한 조건을 규정하는 또 하나의 조건인 하이브리다이제이션후의 세정 조건으로서는, 예를 들면 30℃의 0.5×SSC와 0.1% SDS를 포함하는 용액, 및 30℃의 0.2×SSC와 0.1% SDS를 포함하는 용액, 및 30℃의 0.05×SSC 용액에 의한 연속된 세정 등의 조건을 들 수 있다. 상보쇄는 이러한 조건으로 세정해도 대상으로 하는 정쇄와 하이브리다이즈 상태를 유지하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 이러한 상보쇄로서 대상의 정쇄의 염기 서열과 완전하게 상보적인 관계에 있는 염기 서열로 이루어지는 쇄, 및 상기 쇄와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 예를 들면 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지는 쇄를 예시할 수 있다.
이들의 하이브리다이제이션에 있어서의 「스트린젠트한 조건」의 다른 예에 대해서는, 예를 들면 Sambrook, J.& Russel, D.저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행,의 제 1 권 7.42∼7.45, 제 2 권 8.9∼8.17 등에 기재되어 있고, 본 발명에 있어서 이용할 수 있다.
본 발명의 키트 중의 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드 단편을 프라이머로서 PCR을 실시할 때의 조건의 예로서는, 예를 들면 10mM Tris-HCL(pH8.3), 50mM KCL, 1∼2mM MgCl2 등의 조성의 PCR 버퍼를 사용하고, 상기 프라이머의 서열로부터 계산된 Tm값+5∼10℃에 있어서 15초∼1분 정도 처리하는 것 등을 들 수 있다. 이러한 Tm값의 계산 방법으로서 Tm값=2×(아데닌 잔기수+티민 잔기수)+4×(구아닌 잔기수+시토신 잔기수) 등을 들 수 있다.
또한, 정량 RT－PCR법을 이용하는 경우에는, TaqMan(등록상표) MicroRNA Assays(Life Technologies사)：LNA(등록상표)-based MicroRNA PCR(exiqon사): Ncode(등록상표) miRNA qRT－PCT 키트(invitrogen사) 등의 miRNA를 정량적으로 측정하기 위해서 연구된 시판의 측정용 키트를 사용해도 좋다.
유전자 발현량(예를 들면, miRNA 또는 그 전구체의 양)의 산출에는 한정되지 않지만, 예를 들면 Statistical analysis of gene expression microarray data(Speed T.저, Chapman and Hall/CRC), 및 A beginner's guide Microarray gene expression data analysis(Causton H.C.등 저, Blackwell publishing) 등에 기재된 통계학적 처리를 본 발명에 있어서 이용할 수 있다. 예를 들면 DNA칩 상의 블랭크 스폿의 측정값의 평균값에 블랭크 스폿의 측정값의 표준편차의 2배, 바람직하게는 3배, 보다 바람직하게는 6배를 가산하고, 그 값 이상의 시그널값을 갖는 프로브 스폿을 검출 스폿이라고 간주할 수 있다. 또한, 블랭크 스폿의 측정값의 평균값을 백그라운드라고 간주하고, 프로브 스폿의 측정값으로부터 감산하고, 유전자 발현량으로 할 수 있다. 유전자 발현량의 결손값에 대해서는, 해석 대상으로부터 제외하거나, 바람직하게는 각 DNA칩에 있어서의 유전자 발현량의 최소값으로 치환하거나, 보다 바람직하게는 유전자 발현량의 최소값의 대수값으로부터 0.1을 감산한 값으로 치환할 수 있다. 또한, 저시그널의 유전자를 제거하기 위해서, 측정 샘플수의 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상에 있어서 2의 6승, 바람직하게는 2의 8승, 보다 바람직하게는 2의 10승 이상의 유전자 발현량을 갖는 유전자만을 해석 대상으로 해서 선택할 수 있다. 유전자 발현량의 정규화(노멀라이제이션)로서는 한정되지 않지만, 예를 들면 global normalization이나 quantile normalization(Bolstad, B.M. 등, 2003년, Bioinformatics, 19권, p185-193) 외에, 모든 검체간에서 안정되게 발현하고 있는 내인성 컨트롤 miRNA의 발현량 측정값에 의해 보정하는 방법(A.Shimomura 등, 2016년, Cancer Sci, DOI:10.1111) 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 악성 뇌종양 검출용 폴리뉴클레오티드, 키트, 디바이스(예를 들면 칩), 또는 이들의 조합을 이용하여, 피험체 유래의 검체 중의 표적 유전자의 발현량을 측정하고, 악성 뇌종양을 갖는 것이 기지인 피험체(또는, 환자) 유래의 검체의 유전자 발현량과 건상체 또는 양성 뇌종양 환자 유래의 검체의 유전자 발현량을 교사 샘플로서 작성된, 또한 악성 뇌종양과 건상 또는 양성 뇌종양을 구별적으로 판별하는 것이 가능한 판별식(판별 함수)에 상기 피험체 유래의 검체 중의 표적 유전자의 발현량을 대입하고, 그것에 의해 악성 뇌종양의 존재 또는 부존재를 평가하는 것을 포함하는 피험체에 있어서의 악성 뇌종양을 검출하는(또는, 검출을 보조하는) 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 검출용 폴리뉴클레오티드, 키트, 디바이스(예를 들면 칩), 또는 이들의 조합을 이용하여, 피험체가 악성 뇌종양을 포함하는 것, 및/또는, 악성 뇌종양을 포함하지 않는 것이 기지의 복수의 검체 중의 표적 유전자(표적 핵산)의 발현량을 in vitro에서 측정하는 제 1 스텝, 상기 제 1 스텝에서 얻어진 상기 표적 유전자의 발현량의 측정값을 교사 샘플로 한 판별식을 작성하는 제 2 스텝, 피험체 유래의 검체 중의 상기 표적 유전자의 발현량을 제 1 스텝과 마찬가지로, in vitro에서 측정하는 제 3 스텝, 상기 제 2 스텝에서 얻어진 판별식에 제 3 스텝에서 얻어진 상기 표적 유전자의 발현량의 측정값을 대입하고, 상기 판별식으로부터 얻어진 결과에 의거하여 피험체가 악성 뇌종양을 포함하는 것, 또는 악성 뇌종양을 포함하지 않는 것을 결정 또는 평가하는 제 4 스텝을 포함하고, 여기에서, 상기 표적 유전자가 상기 폴리뉴클레오티드, 키트 또는 디바이스(예를 들면 칩)에 포함되는 검출용 폴리뉴클레오티드에 의해 검출 가능한 것인 방법을 제공한다.
본 명세서중, 판별식은 악성 뇌종양과 건상을 구별적으로 판별하는 판별식을 작성할 수 있는 임의의 판별 분석법, 예를 들면 피셔의 판별 분석, 마하라노비스 거리에 의한 비선형 판별 분석, 뉴럴네트워크, Support Vector Machine(SVM) 등을 이용하여 작성할 수 있지만, 이들의 구체예에 한정되지 않는다.
선형 판별 분석은 군 나누기의 경계가 직선 또는 초평면일 경우, 식 1을 판별식으로서 사용해서 군의 소속을 판별하는 방법이다. 여기에서, x는 설명 변수, w는 설명 변수의 계수, w0는 정수항으로 한다.
Figure pct00002
판별식으로 얻어진 값을 판별 스코어라고 부르고, 새롭게 주어진 데이터 세트의 측정값을 설명 변수로서 상기 판별식에 대입하고, 판별 스코어의 부호로 군 나누기를 판별할 수 있다.
선형 판별 분석의 일종인 피셔의 판별 분석은 클래스 판별을 행하는데에 적합한 차원을 선택하기 위한 차원 삭감법이며, 합성 변수의 분산(variance)에 착안해서 같은 라벨을 갖는 데이터의 분산을 최소화함으로써 식별력이 높은 합성 변수를 구성한다(Venables, W.N.등 저 Modern Applied Statistics with S.Fourth edition.Springer., 2002년). 피셔의 판별 분석에서는 식 2를 최대로 하는 사영 방향(w)을 구한다. 여기에서, μ는 입력의 평균, ng는 클래스(g)에 속하는 데이터수, μg는 클래스(g)에 속하는 데이터의 입력의 평균으로 한다. 분자·분모는 각각 데이터를 벡터(w)의 방향으로 사영했을 때의 클래스간 분산, 클래스내 분산이 되어 있고, 이 비를 최대화함으로써 판별식 계수(wi)를 구한다(카나모리 타카후미 등 저, 「패턴인식」, 교리츠 출판(2009년), Richard O. 등 저, Pattern Classification Second Edition., Wiley-Interscience, 2000년).
Figure pct00003
마하라노비스 거리는 데이터의 상관을 고려한 식 3으로 산출되고, 각 군으로부터의 마하라노비스 거리의 가까운 군을 소속군으로서 판별하는 비선형 판별 분석으로서 사용할 수 있다. 여기에서, μ는 각 군의 중심 벡터, S-1은 그 군의 분산 공분산 행렬의 역행렬이다. 중심 벡터는 설명 변수(x)로부터 산출되고, 평균 벡터나 중앙값 벡터 등을 사용할 수 있다.
Figure pct00004
SVM이란 V. Vapnik이 고안한 판별 분석법이다(The Nature of Statistical Leaning Theory, Springer, 1995년). 분류해야 할 군 나누기가 기지의 데이터 세트의 특정 데이터 항목을 설명 변수, 분류해야 할 군 나누기를 목적 변수로 해서 상기 데이터 세트를 기지의 군 나누기에 바르게 분류하기 위한 초평면이라고 불리는 경계면을 결정하고, 상기 경계면을 이용하여 데이터를 분류하는 판별식을 결정한다. 그리고 상기 판별식은 새롭게 부여되는 데이터 세트의 측정값을 설명 변수로 해서 상기 판별식에 대입함으로써, 군 나누기를 판별할 수 있다. 또한 이 때의 판별 결과는 분류해야 할 군이어도 좋고, 분류해야 할 군으로 분류될 수 있는 확률이어도 좋고, 초평면으로부터의 거리이어도 좋다. SVM에서는 비선형인 문제에 대응하기 위한 방법으로서, 특징 벡터를 고차원으로 비선형 변환하고, 그 공간에서 선형의 식별을 행하는 방법이 알려져 있다. 비선형으로 전상한 공간에서의 두개의 요소의 내적이 각각의 하의 공간에서의 입력만으로 나타내어지는 식을 커널이라고 부르고, 커널의 일례로서 리니어 커널, RBF(Radial Basis Function) 커널, 가우시안 커널을 들 수 있다. 커널에 의해 고차원으로 사상하면서, 실제로는 사상된 공간에서의 특징의 계산을 피해서 커널의 계산만으로 최적인 판별식, 즉 판별식을 구성할 수 있다(예를 들면 아소우 히데키 등 저, 통계과학의 프론티아 6 「패턴인식과 학습의 통계학 새로운 개념과 방법」, 이와나미 서점(2004년), Nello Cristianini 등 저, SVM 입문, 교리츠 출판(2008년)).
SVM법의 일종인 C-support vector classification(C-SVC)은 2군의 설명 변수로 학습을 행해서 초평면을 작성하고, 미지의 데이터 세트가 어느 쪽의 군으로 분류되는지를 판별한다(C. Cortes 등, 1995년, Machine Learning, 20권, p273-297).
본 발명의 방법에서 사용 가능한 C-SVC의 판별식의 산출예를 이하에 나타낸다. 우선 전체 피험체를 악성 뇌종양 환자와 건상체의 2군으로 군 나누기한다. 피험체가 악성 뇌종양 환자인 또는 건상체라고 판단하기 위해서는, 예를 들면 뇌의 화상 검사를 사용할 수 있다.
다음으로, 나뉘어진 2군의 혈청 유래의 검체의 망라적 유전자 발현량으로 이루어지는 데이터 세트(이하, 학습 검체군)를 준비하고, 상기 2군의 사이에서 유전자 발현량에 명확한 차가 보여지는 유전자를 설명 변수, 상기 군 나누기를 목적 변수(예를 들면 -1과 +1)로 한 C-SVC에 의한 판별식을 결정한다. 식 4는 최적화하는 목적 함수이며, 여기에서, e는 모든 입력 벡터, y는 목적 변수, a는 Lagrange 미정 승수 벡터, Q는 정정값 행렬, C는 제약 조건을 조정하는 파라미터를 나타낸다.
Figure pct00005
식 5는 최종적으로 얻어진 판별식이며, 판별식에 의해 얻어진 값의 부호로 소속되는 군을 결정할 수 있다. 여기에서, x는 서포트 벡터, y는 군의 소속을 나타내는 라벨, a는 대응하는 계수, b는 정수항, K는 커널 함수이다.
Figure pct00006
커널 함수로서는 예를 들면 식 6으로 정의되는 RBF 커널을 사용할 수 있다. 여기에서, x는 서포트 벡터, γ는 초평면의 복잡함을 조정하는 커널 파라미터를 나타낸다.
Figure pct00007
이들 이외에도 피험체가 악성 뇌종양을 포함하는 것 또는 포함하지 않는 것을 결정 또는 평가하는, 또는 피험체 유래의 검체에 있어서의 악성 뇌종양 유래의 표적 유전자의 발현량을 건상체 유래의 대조와 비교해서 평가하는 방법으로서, 뉴럴네트워크, k-근방법, 결정목, 로지스틱 회귀 분석 등의 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은, 예를 들면 하기의 스텝(a), (b) 및 (c):
(a)악성 뇌종양 환자 유래인 것, 및 건상체 또는 악성 뇌종양을 포함하지 않는 양성 뇌종양 환자 유래인 것이 이미 알려져 있는 검체 중의 표적 유전자(표적 핵산)의 발현량을 본 발명에 의한 검출용 폴리뉴클레오티드, 키트 또는 디바이스(예를 들면 DNA칩)를 이용하여 측정하는 스텝,
(b)(a)에서 측정된 발현량의 측정값으로부터 상기 식 1∼3, 5 및 6의 판별식을 작성하는 스텝,
(c)피험체 유래의 검체 중의 상기 표적 유전자의 발현량을 본 발명에 의한 검출용 폴리뉴클레오티드, 키트 또는 디바이스(예를 들면 DNA칩)를 이용하여 측정하고, (b)에서 작성한 판별식에 측정값을 대입하고, 얻어진 결과에 의거하여 피험체가 악성 뇌종양을 포함하는 것 또는 포함하지 않는 것을 결정 또는 평가하는, 또는 악성 뇌종양 유래의 발현량을 건상체 또는 양성 뇌종양 환자 유래의 대조 발현량과 비교해서 평가하는 스텝,
을 포함할 수 있다.
여기에서, 식 1∼3, 5 및 6의 식 중의 x는 설명 변수이며, 상기 2절에 기재한 폴리뉴클레오티드류로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 그 단편 등을 측정 함으로써 얻어지는 값을 포함하고, 구체적으로는 본 발명의 악성 뇌종양 환자와 건상체 또는 양성 뇌종양 환자를 판별하기 위한 설명 변수는, 예를 들면 하기의 (1)∼(2)로부터 선택되는 유전자 발현량이다.
(1)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열에 포함되는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA 등의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 측정되는 악성 뇌종양 환자, 건상체, 및 양성 뇌종양 환자의 혈청에 있어서의 유전자 발현량.
(2)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 그것에 상보적인 염기 서열에 포함되는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 DNA 등의 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나에 의해 측정되는 악성 뇌종양 환자, 건상체, 및 양성 뇌종양 환자의 혈청에 있어서의 유전자 발현량.
이상에 나타내듯이, 피험체 유래의 검체에 대해서, 상기 피험체가 악성 뇌종양을 갖는지의 여부를 결정 또는 평가하는 방법으로서, 판별식의 작성에는 학습 검체군으로부터 작성한 판별식이 필요하며, 상기 판별식의 판별 정밀도를 높이기 위해서는 학습 검체군 중의 악성 뇌종양 환자군이 건상체군으로 이루어지는 2군 사이, 또는, 악성 뇌종양 환자군과 양성 뇌종양 환자군으로 이루어지는 2군 사이의 발현량에 명확한 차가 있는 유전자를 판별식에 사용하는 것이 필요하다.
또한 판별식의 설명 변수에 사용하는 유전자의 결정은 다음과 같이 행하는 것이 바람직하다. 우선, 학습 검체군인 악성 뇌종양 환자군의 망라적 유전자 발현량과 건상체군의 망라적 유전자 발현량을 데이터 세트로 하고, 파라메트릭 해석인 t검정의 P값, 논파라메트릭 해석인 Mann-Whitney의 U검정의 P값, 또는 Wilcoｘon 검정의 P값 등을 이용해서 상기 2군 사이에 있어서의 각 유전자의 발현량의 차의 크기를 구한다.
검정에 의해 얻어진 P값의 위험율(유의수준)이 예를 들면 5%, 1% 또는 0.01%보다 작은 경우에 통계학적으로 유의라고 간주할 수 있다.
검정을 반복해서 행하는 것에 기인하는 제 1 종의 과오의 확률의 증대를 보정하기 위해서 공지의 방법, 예를 들면 본페로니, 포름 등의 방법에 의해 보정할 수 있다(예를 들면 나가타 야스시 등 저, 「통계적 다중 비교법의 기초」, 사이엔티스트사(2007년)). 본페로니 보정을 예시하면, 예를 들면 검정에 의해 얻어진 P값을 검정의 반복 횟수, 즉 해석에 사용하는 유전자수로 곱하고, 소망의 유의수준과 비교함으로써 검정 전체에서의 제 1 종의 과오를 발생시키는 확률을 억제할 수 있다.
또한 검정이 아닌 악성 뇌종양 환자군의 유전자 발현량과 건상체군의 유전자 발현량의 사이에서, 각각의 유전자 발현량의 중앙값의 발현비의 절대값(Fold change)을 산출하고, 판별식의 설명 변수에 사용하는 유전자를 선택해도 좋다. 또한 악성 뇌종양 환자군과 건상체군의 유전자 발현량을 이용하여 ROC 곡선을 작성하고, AUROC값을 기준으로 해서 판별식의 설명 변수에 사용하는 유전자를 선택해도 좋다.
다음에 여기에서 구한 유전자 발현량의 차가 큰 임의의 수의 유전자를 이용하여, 상기 여러가지 방법으로 산출할 수 있는 판별식을 작성한다. 최대의 판별 정밀도를 얻는 판별식을 구축하는 방법으로서, 예를 들면 P값의 유의 수준을 만족시킨 유전자의 모든 조합으로 판별식을 구축하는 방법이나, 판별식을 작성하기 위해서 사용하는 유전자를 유전자 발현량의 차가 큰 순으로 하나씩 늘리면서 반복해서 평가하는 방법 등이 있다(Furey TS. 등, 2000년, Bioinformatics, 16권, p906-14). 이 판별식에 대하여, 다른 독립의 악성 뇌종양 환자 또는 건상체의 유전자 발현량을 설명 변수에 대입하고, 이 독립의 악성 뇌종양 환자 또는 건상체에 대해서 소속하는 군의 판별 결과를 산출한다. 즉, 찾아낸 진단용 유전자 셋트 및 진단용 유전자 셋트를 이용하여 구축한 판별식을 독립의 검체군으로 평가함으로써, 보다 보편적인 악성 뇌종양을 검출할 수 있는 진단용 유전자 셋트 및 악성 뇌종양을 판별하는 방법을 찾아낼 수 있다.
또한 상기 판별식의 판별 성능(범화성)의 평가에는 Split-sample법을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 데이터 세트를 학습 검체군과 검증 검체군으로 분할하고, 학습 검체군에서 통계학적 검정에 의한 유전자의 선택과 판별식 작성을 행하고, 상기 판별식으로 검증 검체군을 판별한 결과와 검증 검체군이 소속하는 참된 군을 이용하여 정밀도·감도·특이도를 산출하고, 판별 성능을 평가한다. 한편, 데이터 세트를 분할하지 않고, 전체 검체를 이용하여 통계학적 검정에 의한 유전자의 선택과 판별식 작성을 행하고, 신규로 준비한 검체를 상기 판별식으로 판별해서 정밀도·감도·특이도를 산출하고, 판별 성능을 평가할 수도 있다.
예를 들면 위에 기재한 서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 상보적 서열에 근거하는 1개 또는 2개 이상의 상기 폴리뉴클레오티드, 및 경우에 따라 서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 그 상보적 서열에 근거하는 1개 또는 2개 이상의 상기 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 임의의 조합을 진단용 유전자 셋트로 한다. 또한, 화상 검사나 조직 진단의 진단 결과가 악성 뇌종양인 환자 유래의 검체와, 양성의 뇌종양 환자 또는 건상체 유래의 검체에 있어서의 상기 진단용 유전자 셋트의 발현량을 이용하여 판별식을 구축한다. 그 결과, 미지의 검체의 상기 진단용 유전자 셋트의 발현량을 측정함으로써, 미지의 검체의 유래하는 피험체가 악성 뇌종양을 포함하는 것 또는 악성 뇌종양을 포함하지 않는 것을 높은 정밀도 및 감도로 구별할 수 있다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예에 의해 더 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위는, 이 실시예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.
[참고예 1]
＜뇌종양 환자와 건상체의 검체의 채취>
사전동의를 얻은 건상체 100명과 뇌종양 이외에 원발암이 확인되지 않은 악성 뇌종양 환자로서 신경교종(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종) 환자 98명(그레이드II가 23예, 그레이드III가 25예, 그레이드IV가 50예) 및 양성 뇌종양 환자로서 수막종 환자 14명으로부터 베노젝트II 진공 채혈관 VP-AS109K60(데루모 가부시키가이샤)을 이용하여 각각 채취한 혈청검체를 학습 검체군으로 했다. 마찬가지로, 사전동의를 얻은 건상체 50명과 뇌 이외에 원발암이 확인되지 않은 악성 뇌종양 환자로서 신경교종(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종) 환자 49명(그레이드II가 7예, 그레이드III가 13예, 그레이드IV가 29예) 및 양성 뇌종양 환자로서 수막종 환자 7명으로부터 베노젝트II 진공 채혈관 VP-AS109K 60(데루모 가부시키가이샤)을 이용하여 각각 채취한 혈청검체를 검증 검체군으로 했다.
＜totalRNA의 추출>
검체로서 상기 학습 검체군, 검증 검체군을 합쳐서 건상체 150명과 악성 뇌종양 환자 147명, 양성 뇌종양 환자 21명의 합계 318명으로부터 각각 얻어진 혈청 300μL로부터 3D-Gene(등록상표) RNA extraction reagent from liquid sample kit(도레이 가부시키가이샤) 중의 RNA 추출용 시약을 이용하여, 동사가 정하는 프로토콜에 따라서 total RNA를 얻었다.
＜유전자 발현량의 측정>
검체로서 상기 학습 검체군, 검증 검체군을 합쳐서 건상체 150명, 악성 뇌종양 환자 147명, 양성 뇌종양 환자 21명의 합계 318명의 혈청으로부터 얻은 total RNA에 대하여, 3D-Gene(등록상표) miRNA Labeling kit(도레이 가부시키가이샤)를 이용하여 동사가 규정하는 프로토콜(ver2.20)에 의거하여 miRNA를 형광 표지했다. 올리고 DNA칩으로서 miRBase release 21에 등록되어 있는 miRNA 중에서 2,565종의 miRNA와 상보적인 서열을 갖는 프로브를 탑재한 3D-Gene(등록상표) Human miRNA Oligo chip(도레이 가부시키가이샤)을 사용하고, 동사가 정하는 프로토콜에 의거하여 스트린젠트한 조건으로, total RNA 중의 miRNA와 DNA칩 상의 프로브의 하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션후의 세정을 행했다. DNA칩을 3D-Gene(등록상표) 스캐너(도레이 가부시키가이샤)를 이용하여 스캔하고, 화상을 취득해서 3D-Gene(등록상표) Extraction(도레이 가부시키가이샤)으로 형광강도를 수치화했다. 수치화된 형광강도를 바닥이 2인 대수값으로 변환해서 유전자 발현량으로 하고, 블랭크값의 감산을 행하고, 결손값은 각 DNA칩에 있어서의 유전자 발현량의 최소값의 대수값으로부터 0.1을 감산한 값으로 치환했다. 그 결과, 건상체 150명, 악성 뇌종양 환자 147명, 양성 뇌종양 환자 21명의 합계 318명의 혈청에 대한 망라적인 miRNA의 유전자 발현량을 얻었다. 수치화된 miRNA의 유전자 발현량을 사용한 계산 및 통계해석은 R언어 3.0.2(R Development Core Team(2013) .R:A language and environment for statistical computing.R Foundation for Statistical Computing, URL http://www.R-proｊect.org/.) 및 MASS 패키지 7.3-30(Venables, W. N. & Ripley, B.D.(2002) Modern Applied Statistics with S.Fourth Edition.Springer, New York. ISBN 0-387-95457-0)를 사용해서 실시했다.
[참고예 2]
＜다른 악성 뇌종양 검체의 채취>
사전동의를 얻은 뇌종양 이외에 암이 확인되어 있지 않은 중추신경계 원발악성 임파종환자 37명, 상의종 환자 6명, 신경절신경교종 환자 5명, 모양 세포성 성세포종 환자 3명, 계 51명으로부터 베노젝트II 진공 채혈관 VP-AS109K 60(데루모 가부시키가이샤)을 이용하여 각각 혈청을 채취하고, 검증 검체군으로 했다. 이후의 totalRNA의 추출 서열에 유전자 발현량의 측정 및 해석은 참고예 1과 같은 방법으로 행했다.
[실시예 1]
＜학습 검체군의 검체를 사용한 유전자 마커의 선정과 검증 검체군의 검체를 사용한 단독의 유전자 마커의 뇌종양 판별 성능의 평가 방법>
본 실시예에서는, 학습 검체군으로부터 악성 뇌종양 환자를 양성 뇌종양 환자 및 건상체와 판별하기 위한 유전자 마커를 선정하고, 학습 검체군과는 독립된 검증 검체군의 검체에 있어서, 선정한 각각의 유전자 마커 단독의 악성 뇌종양 판별 성능을 평가하는 방법을 검토했다.
구체적으로는, 우선 참고예 1에서 얻은 학습 검체군과 검증 검체군의 miRNA 발현량을 정규화했다. 정규화는 각 검체에 대해서 DNA칩 상의 3개의 내인성 miRNA 컨트롤(hsa-miR-2861, hsa-miR-149-3p, 및 hsa-miR-4463)의 발현량 측정값의 평균과 기준값(Pre-set value)의 비를 얻고, 상기 검체마다의 모든 miRNA의 검출 수치에 그 비를 반영시키는 방법에 의해 실시했다. 이 방법은 A.Shimomura 등, 2016년, Cancer Sci, DOI:10.1111에 기재되어 있다.
다음에 학습 검체군을 이용하여 진단용 유전자의 선정을 행했다. 여기에서, 보다 신뢰성이 높은 진단 마커를 획득하기 위해서, 학습 검체군의 악성 뇌종양 환자군과, 양성 뇌종양 환자 및 건상체를 합한 군 중 어느 하나에 있어서, 50% 이상의 검체에서 2의 6승 이상의 유전자 발현량을 갖는 유전자만을 선택했다. 또한 악성 뇌종양 환자군과, 양성 뇌종양 환자군 및 건상체군을 판별하기 위한 통계적 유의성이 있는 유전자로서 각각의 유전자 발현량에 대해서 등분산을 가정한 양측 t검정으로 얻어진 P값을 본페로니 보정하고, p＜0.01을 충족시키는 유전자를 판별식의 설명 변수에 사용하는 유전자 마커로서 획득하고, 표 2에 기재했다.
이렇게 해서, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-3178, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-6510-5p, hsa-miR-4695-5p, hsa-miR-4634, hsa-miR-4449, hsa-miR-3195, hsa-miR-6836-3p, hsa-miR-187-5p 유전자를 양성 뇌종양 환자 및 건상체와 비교한 악성 뇌종양 마커로서 찾아냈다.
또한 이들의 유전자의 발현량을 지표로 해서 피셔의 판별 분석에 의해 악성 뇌종양의 유무를 판별하는 판별식을 작성했다. 즉, 학습 검체군에 있어서 선택된 11종의 유전자에 해당되는 서열번호 1∼11 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값을 식 2에 입력해서 판별식 「z=a×(유전자의 발현량)+b」를 작성하고, 산출한 정밀도·감도·특이도를 표 3에 나타냈다. 또 그 때의 판별식 계수(a)와 정수항(b)을 표 4에 나타냈다. 예를 들면 hsa-miR-1909-3p 유전자(서열번호 1)의 판별식은 표 4에 기재된 판별식 계수(a) (3.058)와 정수항(b) (26.421)으로부터 「z=3.058×(hsa-miR-1909-3p의 발현량)-26.421」이 된다.
상기에서 작성한 판별식을 이용하여 검증 검체군에 있어서의 정밀도·감도·특이도를 산출하고, 선정된 폴리뉴클레오티드의 판별 성능을 독립된 검체로 검증했다(표 3). 예를 들면 서열번호 1로 나타내어지는 염기 서열의 발현량 측정값을 학습 검체군의 악성 뇌종양 환자(98명)와, 양성 뇌종양 환자(14명) 및 건상체(100명) 사이에서 비교했을 경우, 양성 뇌종양 환자 및 건상체군에 대하여 악성 뇌종양 환자군의 유전자 발현량 측정값이 유의하게 낮은 것이 나타내어지며(도 2 좌측 참조), 또한 이 결과는 검증 검체군의 악성 뇌종양 환자(49명)와, 양성 뇌종양 환자(7명) 및 건상체(50명) 사이에서도 재현할 수 있었다(도 2 우측 참조). 마찬가지로 서열번호 2∼11에 나타내어지는 다른 폴리뉴클레오티드에 있어서도, 양성 뇌종양 환자 및 건상체군에 대하여 악성 뇌종양 환자군의 유전자 발현량 측정값이 유의하게 낮거나(-) 또는 높은(+) 결과(표 2)가 얻어지며, 이들의 결과는 검증 검체군으로 검증할 수 있었다. 또한 예를 들면 이 서열번호 1로 나타내어지는 염기 서열에 관하여, 학습 검체군에서 악성 뇌종양의 유무를 판별하기 위해서 표 4에 기재된 판별식 계수(3.058)와 정수항(26.421)을 사용해서 판별 스코어를 계산하고, 이어서 스코어가 0보다 큰 검체를 악성 뇌종양, 0보다 작은 검체를 양성 뇌종양 환자 또는 건상체로 판정하는 판별식을 이용하여, 검증 검체군에서의 악성 뇌종양 검출의 적중율을 산출한 결과, 진양성 41예, 진음성 54예, 위양성 3예, 위음성 8예이며, 이들의 값으로부터 판별 성능으로서, 정밀도 90%, 감도 84%, 특이도 95%가 얻어졌다. 이렇게 하여 서열번호 1∼11에 나타내어지는 모든 폴리뉴클레오티드의 판별 성능을 산출해서 표 3에 기재했다.
서열번호 2∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 검증 검체군에 있어서 각각 감도 84%, 84%, 84%, 80%, 76%, 84%, 74%, 76%, 84%, 71%를 나타냈다(표 3). 이들 폴리뉴클레오티드는 단독으로도 70%를 상회하는 높은 감도로 악성 뇌종양을 판별하는 것을 증명할 수 있었다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
[실시예 2]
＜검증 검체군 검체를 사용한 복수의 유전자 마커의 조합에 의한 뇌종양 판별 성능의 평가 방법>
본 실시예에서는 실시예 1에서 선정된 유전자 마커를 조합해서 악성 뇌종양판별 성능을 평가하는 방법을 검토했다.
구체적으로는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 해서, 참고예 1에서 얻은 학습 검체군과 검증 검체군의 miRNA 발현량을 정규화했다. 다음에 실시예 1에 있어서 선택된 11종의 유전자에 해당되는 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 2개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합 550가지에 대해서 학습 검체군으로 피셔의 판별 분석을 행하고, 악성 뇌종양의 존재의 유무를 판별하는 판별식 「z=a1×(유전자 1의 발현량)+a2×(유전자 2의 발현량)+a3×(유전자 3의 발현량)+a4×(유전자 4의 발현량)+b」를 구축했다(표 5). 산출한 정밀도·감도·특이도를 표 6에 나타냈다.
다음에 작성한 판별식을 이용하여 검증 검체군에 있어서의 정밀도·감도·특이도를 산출함으로써, 판별 성능을 독립된 검체로 검증했다.
서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 2개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합을 이용하여 참고예 1의 검증 검체군의 뇌종양의 유무의 판별을 실시했다. 예를 들면 서열번호 1과 서열번호 2로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값에 대해서, 학습 검체군에서 악성 뇌종양의 유무를 판별하기 위해서 작성한 판별식에 의거하여 표 5에 기재된 판별식 계수(서열번호 1:-1.952, 서열번호 2:-1.071)와 정수항(-30.884)을 사용해서 판별 스코어를 계산하고, 스코어가 0보다 큰 검체를 악성 뇌종양, 0보다 작은 검체를 양성 뇌종양 환자 또는 건상체로 판정함으로써 얻어지는 판별 결과를 비교한 결과, 학습 검체군에서는 건상체군 및 양성 뇌종양 환자군과 악성 뇌종양 환자군 사이에서 발현량 측정값이 유의하게 분리되는 산포도가 얻어지고(도 3 좌측 참조), 또한 이 결과는 검증 검체군에서도 재현이 가능했다(도 3 우측 참조). 이 서열번호 1과 서열번호 2로 나타내어지는 염기 서열에 관하여, 학습 검체군에서 구축한 판별식을 이용하여 악성 뇌종양 검출의 적중율을 산출한 결과, 진양성 45예, 진음성 55예, 위양성 2예, 위음성 4예이며, 이들의 값으로부터 판별 성능으로서 정밀도 94%, 감도 92%, 특이도 97%가 얻어졌다.
이렇게 해서, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 2개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 모든 조합에 대해서 판별 성능을 산출했다. 모든 조합 550가지(표 6) 중, 단독의 유전자 마커에서의 판별 성능을 상회하는 감도를 나타내는 조합이 486가지 있는 것이 나타내어졌다. 또 표 5 및 6에 있어서 「서열번호」는 사용한 복수개의 폴리뉴클레오티드의 조합을 서열번호로 나타내고 있다(본원의 후술의 표에서도 동일).
예를 들면 서열번호 3과 서열번호 5, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 7, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 8, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 10, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 11, 서열번호 3과 서열번호 4와 서열번호 5와 서열번호 6, 서열번호 3과 서열번호 4와 서열번호 5와 서열번호 7, 서열번호 3과 서열번호 4와 서열번호 5와 서열번호 8, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 7, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 8, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 9, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 10, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 11, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 7과 서열번호 8, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 7과 서열번호 9, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 7과 서열번호 10, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 7과 서열번호 11, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 8과 서열번호 9, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 8과 서열번호 11, 서열번호 3과 서열번호 5와 서열번호 10과 서열번호 11, 서열번호 4와 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 11, 및 서열번호 5와 서열번호 6과 서열번호 7과 서열번호 8로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합을 사용한 경우, 검증 검체군에 있어서, 단독의 유전자 마커로 최고 감도 84%를 상회하는 감도 98%를 나타냈다.
이들의 조합에 있어서 실시예 1에서 얻어진 표 1에 기재된 서열번호 1∼11의 폴리뉴클레오티드 모두가 적어도 1회는 발견되었다. 즉, 검증 검체군에 있어서, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 1개 이상을 포함하는 2개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합은 감도 70%를 상회하는 높은 감도로 악성 뇌종양을 판별하는 것을 증명할 수 있었다.
이렇게, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 개수를 조합해도 우수한 감도로 악성 뇌종양을 검출하는 마커가 얻어진다. 예를 들면 실시예 1에서 선택된 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 대해서, 통계적 유의성을 나타내는 P값의 내림차순으로 순위가 매겨지며, 상위의 miRNA로부터 1개씩 추가한 1개 또는 복수개의 miRNA의 조합을 이용하여 판별 성능을 산출했다. 그 결과, 검증 검체군에 있어서의 감도는 1개의 miRNA에서 84%, 2개의 miRNA에서 92%, 3개의 miRNA에서 94%, 5개의 miRNA에서 94%였다. 복수의 miRNA의 조합은 1개의 miRNA의 감도보다 높은 점에서, 복수의 miRNA를 조합해도 악성 뇌종양을 검출하는 우수한 마커가 될 수 있는 것이 나타내어졌다. 여기에서, 복수의 miRNA의 조합은 상기와 같이 통계적 유의차의 순으로 가산하는 경우에 한정되지 않고, 어떤 복수개의 miRNA의 조합으로도 악성 뇌종양의 검출에 사용할 수 있다.
이들의 결과로부터 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 모든 폴리뉴클레오티드는 악성 뇌종양의 우수한 진단 마커라고 할 수 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
[실시예 3]
＜검증 검체군을 사용한 복수의 유전자 마커의 조합에 의한 다른 악성 뇌종양 검체의 판별 성능의 평가 방법>
본 실시예에서는, 실시예 1, 2와 마찬가지로 학습군에서 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 1개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합을 이용하여 역치 또는 판별식을 구축하고, 참고예 2에 기재한 검증 검체군을 대상으로 해서 실시예 1, 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 판별 성능을 평가했다.
구체적으로는, 우선 참고예 1에서 얻은 학습 검체군과 참고예 2에서 얻은 검증 검체군의 miRNA 발현량을 정규화했다. 정규화는 각 검체에 대해서 DNA칩 상의 3개의 내인성 miRNA 컨트롤(hsa-miR-2861, hsa-miR-149-3p, 및 hsa-miR-4463)의 발현량 측정값의 평균과 기준값(Pre-set value)의 비를 얻고, 상기 검체마다의 모든 miRNA의 검출 수치에 그 비를 반영시키는 방법에 의해 실시했다. 이 방법은 A. Shimomura 등, 2016년, Cancer Sci, DOI:10.1111에 기재되어 있다.
다음에 참고예 1에서 얻은 학습 검체군에 대해서 실시예 1에서 선택된 11종의 유전자의 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 1개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합에 대해서 피셔의 판별 분석을 행하고, 악성 뇌종양의 존재의 유무를 판별하는 판별식을 구축했다. 다음에 중추신경계 원발악성 임파종 환자 37명, 상의종 환자 6명, 신경절신경교종 환자 5명, 모양 세포성 성세포종 환자 3명, 총 51명의 검증 검체군(참고예 2)에 있어서의 감도를 산출하고(표 7), 그것에 의해 선정된 폴리뉴클레오티드의 판별 성능을 독립된 검체로 검증했다.
서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 1개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 조합을 이용하여 참고예 2의 검증 검체군의 악성 뇌종양의 유무의 판별을 실시했다. 예를 들면 서열번호 1과 서열번호 2로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값에 대해서, 학습 검체군에서 악성 뇌종양의 유무를 판별하기 위해서 작성한 판별식에 의거하여 표 5에 기재된 판별식 계수(서열번호 1:-1.952, 서열번호 2:-1.071)와 정수항(-30.884)을 사용해서 판별 스코어를 계산하고, 스코어가 0보다 큰 검체를 악성 뇌종양, 0보다 작은 검체를 양성 뇌종양 환자 또는 건상체로 판정함으로써 얻어지는 학습 검체군과 검증 검체군의 판별 결과를 비교한 결과, 검증 검체군인 다른 악성 뇌종양(중추신경계 원발악성 임파종, 상의종, 신경절신경교종, 모양 세포성 성세포종)도 학습 검체군의 신경교종(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종)과 같은 산포도가 얻어졌다(도 4 우측 참조). 이 서열번호 1과 서열번호 2로 나타내어지는 염기 서열에 관하여, 학습 검체군에서 구축한 판별식을 이용하여 악성 뇌종양 검출의 적중율을 산출한 결과, 진양성 43예, 위음성 8예이며, 이들의 값으로부터 판별 성능으로서 감도 84%가 얻어졌다. 또, 학습 검체군의 감도는 87%였다.
이렇게 해서, 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 중 1개∼4개의 폴리뉴클레오티드의 발현량 측정값의 모든 조합에 대해서 판별 성능을 산출했다. 모든 조합 561가지 중, 514가지(표 7)는 실시예 1, 2 중에서 최소 판별 성능을 나타내는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 단독으로의 감도 71%를 상회하고, 악성 뇌종양(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종) 뿐만 아니라 중추신경계 원발악성 임파종, 상의종, 신경절신경교종, 모양 세포성 성세포종도 검출(판별)할 수 있는 것이 나타내어졌다.
신경교종(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종) 이외의 상기 악성 뇌종양도 판별할 수 있는 서열번호 1∼11로 나타내어지는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 임의인 조합의 개수로서는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 개수를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 단독으로 최고의 판별 성능을 나타내는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 단독으로의 감도 86%와 비교해서 2개 이상의 상기 폴리뉴클레오티드의 조합에 있어서 판별 정밀도 90% 이상을 나타낼 수 있었다.
이렇게, 이들 폴리뉴클레오티드를 이용하여 검증 검체군에 있어서 신경교종(성세포종, 핍돌기 교종, 핍돌기 교성세포종) 이외의 상기 악성 뇌종양 어느 것에 대해서나 악성 뇌종양이다라고 정확하게 판별할 수 있었다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
이상의 실시예에 나타내듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 키트 등 및 방법을 사용하면, 악성 뇌종양 환자를 건상체 뿐만 아니라 양성 뇌종양 환자 모두 감도 좋게 판별할 수 있다. 이에 따라 외과수술에 의한 암부의 절제 실시 등에 관한 조기의 임상적 판단이 가능해지고, 그 결과, 5년 생존률의 향상이나, 재발율을 낮게 하는 것이 가능해진다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의해, 간이하고 또한 저렴한 방법으로, 악성 뇌종양을 효과적으로 검출할 수 있으므로, 악성 뇌종양의 조기발견, 진단 및 치료가 가능하게 된다. 또한 본 발명의 방법에 의해, 환자 혈액을 이용하여 악성 뇌종양을 저칩습적으로 검출할 수 있으므로, 악성 뇌종양을 간편하고 또한 신속하게 검출하는 것이 가능하게 된다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 있어서 도입하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. National Cancer Center <120> Kit or device and method for detecting malignant brain cancer <130> PH-6838-PCT <150> JP 2016-074717 <151> 2016-04-01 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cgcaggggcc gggugcucac cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gugaguagug gcgcgcggcg gc 22 <210> 3 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggggcgcggc cggaucg 17 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gcgggggugg cggcggcauc cc 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 cagcagggga gagagaggag uc 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 caggaggcag ugggcgagca gg 22 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 cggcgcgacc ggcccgggg 19 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgucccgggg cugcgcgagg ca 22 <210> 9 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 cgcgccgggc ccggguu 17 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 augccucccc cggccccgca g 21 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggcuacaaca caggacccgg gc 22 <210> 12 <211> 80 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 cauccaggac aauggugagu gccggugccu gcccuggggc cgucccugcg caggggccgg 60 gugcucaccg caucugcccc 80 <210> 13 <211> 62 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 gugaguagug gcgcgcggcg gcucggagua ccucugccgc cgcgcgcauc ggcucagcau 60 gc 62 <210> 14 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaggcugggc ggggcgcggc cggaucgguc gagagcgucc uggcugauga cggucucccg 60 ugcccacgcc ccaaacgcag ucuc 84 <210> 15 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 cgguccagac guggcggggg uggcggcggc aucccggacg gccugugagg gaugcgccgc 60 ccacugcccc gcgccgccug accg 84 <210> 16 <211> 54 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 agcagcaggg gagagagagg aguccucuag acaccgacuc ugucuccugc agau 54 <210> 17 <211> 74 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 ccugcaggag gcagugggcg agcaggcggg gcagcccaau gccaugggcc ugaucucacc 60 gcugccuccu uccc 74 <210> 18 <211> 54 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 ggacaagggc ggcgcgaccg gcccggggcu cuugggcggc cgcguuuccc cucc 54 <210> 19 <211> 66 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 agcagcccuc ggcggcccgg ggggcgggcg gcggugcccg ucccggggcu gcgcgaggca 60 caggcg 66 <210> 20 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 ccgcagccgc cgcgccgggc ccggguuggc cgcugacccc cgcggggccc ccggcggccg 60 gggcgggggc gggggcugcc ccgg 84 <210> 21 <211> 63 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 ggcuccgcag ggcccuggcg caggcaucca gacagcgggc gaaugccucc cccggccccg 60 cag 63 <210> 22 <211> 77 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 ggucgggcuc accaugacac agugugagac cucgggcuac aacacaggac ccgggcgcug 60 cucugacccc ucguguc 77 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ugcgcagggg ccgggugcuc acc 23 <210> 24 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 ggcgcgcggc ggcuc 15 <210> 25 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaucggucga gagcguccug gcug 24 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 ggcgggggug gcggcggcau c 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 cagcagggga gagagaggag u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 aggaggcagu gggcgagcag g 21 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 cggcgcgacc ggcccgggg 19 <210> 30 <211> 26 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 gucccggggc ugcgcgaggc acaggc 26 <210> 31 <211> 16 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 cgcgccgggc ccgggu 16 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 gggcuacaac acaggacccg gg 22 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 cgcaggggcc gggugcuca 19 <210> 34 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 gggcgcggcc ggauc 15 <210> 35 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 gguggcggcg gcauc 15 <210> 36 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 cagcagggga gagagaggag 20 <210> 37 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 ccggggcugc gcgaggc 17 <210> 38 <211> 15 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 gcgccgggcc cgggu 15 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 ggcuacaaca caggacccgg g 21

Claims (18)

  1. 악성 뇌종양 마커인 miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및 miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양의 검출용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    miR-1909-3p가 hsa-miR-1909-3p이며, miR-6869-5p가 hsa-miR-6869-5p이며, miR-3178이 hsa-miR-3178이며, miR-4787-5p가 hsa-miR-4787-5p이며, miR-6510-5p가 hsa-miR-6510-5p이며, miR-4695-5p가 hsa-miR-4695-5p이며, miR-4634가 hsa-miR-4634이며, miR-4449가 hsa-miR-4449이며, miR-3195가 hsa-miR-3195이며, 및, miR-6836-3p가 hsa-miR-6836-3p인 키트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산이 하기의 (a)∼(e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
    (a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 키트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트가 다른 악성 뇌종양 마커인 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 더 포함하는 키트.
  5. 제 4 항에 있어서,
    miR-187-5p가 hsa-miR-187-5p인 키트.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산이 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
    (f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 키트.
  7. 악성 뇌종양 마커인 miR-1909-3p, miR-6869-5p, miR-3178, miR-4787-5p, miR-6510-5p, miR-4695-5p, miR-4634, miR-4449, miR-3195, 및, miR-6836-3p로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함하는 악성 뇌종양 검출용 디바이스.
  8. 제 7 항에 있어서,
    miR-1909-3p가 hsa-miR-1909-3p이며, miR-6869-5p가 hsa-miR-6869-5p이며, miR-3178이 hsa-miR-3178이며, miR-4787-5p가 hsa-miR-4787-5p이며, miR-6510-5p가 hsa-miR-6510-5p이며, miR-4695-5p가 hsa-miR-4695-5p이며, miR-4634가 hsa-miR-4634이며, miR-4449가 hsa-miR-4449이며, miR-3195가 hsa-miR-3195이며, 및, miR-6836-3p가 hsa-miR-6836-3p인 디바이스.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 핵산이 하기의 (a)∼(e)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
    (a)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (b)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (c)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (d)서열번호 1∼10 중 어느 하나로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (e)상기 (a)∼(d) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 디바이스.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디바이스가 다른 악성 뇌종양 마커인 miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 더 포함하는 디바이스.
  11. 제 10 항에 있어서,
    miR-187-5p가 hsa-miR-187-5p인 디바이스.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    miR-187-5p의 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합 가능한 핵산이 하기의 (f)∼(j)에 나타내는 폴리뉴클레오티드:
    (f)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (g)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
    (h)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 그 유도체, 또는 15 이상의 연속된 염기를 포함하는 그 단편,
    (i)서열번호 11로 나타내어지는 염기 서열 또는 상기 염기 서열에 있어서 u가 t인 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및
    (j)상기 (f)∼(i) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드,
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드인 디바이스.
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디바이스가 하이브리다이제이션 기술에 의한 측정을 위한 디바이스인 디바이스.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 하이브리다이제이션 기술이 핵산 어레이 기술인 디바이스.
  15. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 키트 또는 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 디바이스를 이용하여 피험체의 검체에 있어서의 표적 핵산의 발현량을 측정하고, 상기 측정된 발현량과, 마찬가지로 측정된 건상체 또는 양성 뇌종양 환자의 대조 발현량을 이용하여 피험체가 악성 뇌종양에 이환되어 있는지의 여부를 평가하고, 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 유무를 검출하는 것을 포함하는 악성 뇌종양의 검출 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 키트 또는 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 디바이스를 이용하여 피험체의 검체에 있어서의 표적 유전자의 발현량을 측정하고, 악성 뇌종양을 갖는 것이 기지인 피험체 유래의 검체의 유전자 발현량과 건상체 또는 양성 뇌종양 환자 유래의 검체의 유전자 발현량을 교사 샘플로 해서 작성된, 또한 악성 뇌종양과 건상 또는 양성 뇌종양을 구별적으로 판별하는 것이 가능한 판별식에 상기 피험체 유래의 검체 중의 표적 유전자의 발현량을 대입하고, 그것에 의해 악성 뇌종양의 존재 또는 부존재를 평가하는 것을 포함하는 피험체에 있어서의 악성 뇌종양의 검출 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    상기 피험체가 인간인 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검체가 혈액, 혈청 또는 혈장인 방법.
KR1020187031250A 2016-04-01 2017-03-31 악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법 KR20180132748A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016074717 2016-04-01
JPJP-P-2016-074717 2016-04-01
PCT/JP2017/013708 WO2017171039A1 (ja) 2016-04-01 2017-03-31 悪性脳腫瘍の検出キット又はデバイス及び検出方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180132748A true KR20180132748A (ko) 2018-12-12

Family

ID=59966051

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187031250A KR20180132748A (ko) 2016-04-01 2017-03-31 악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20190112668A1 (ko)
EP (1) EP3438266A4 (ko)
JP (1) JPWO2017171039A1 (ko)
KR (1) KR20180132748A (ko)
CN (1) CN108884463A (ko)
CA (1) CA3019550A1 (ko)
WO (1) WO2017171039A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10745674B2 (en) * 2014-03-06 2020-08-18 Salk Institute For Biological Studies Polyketide synthase variants and uses thereof
CN118048460A (zh) * 2017-06-29 2024-05-17 东丽株式会社 用于检测肺癌的试剂盒、装置和方法
JP7394441B2 (ja) * 2019-09-27 2023-12-08 Ｃｒａｉｆ株式会社 脳腫瘍を検査する方法
CN116898868B (zh) * 2023-05-19 2024-02-06 青岛大学附属医院 MiR-1909-5p在制备治疗血管内皮细胞铁死亡和/或主动脉夹层产品中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005073621A (ja) * 2003-09-01 2005-03-24 Japan Science & Technology Agency 脳腫瘍マーカーと脳腫瘍の診断方法
JP2007082433A (ja) * 2005-09-20 2007-04-05 Niigata Univ 悪性脳腫瘍マーカー遺伝子およびその用途
EP2336353A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-22 febit holding GmbH miRNA fingerprints in the diagnosis of diseases
EP2341145A1 (en) * 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
CA2827894A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers
US9315809B2 (en) * 2012-08-29 2016-04-19 City Of Hope Differentially expressed microRNA molecules for the treatment and diagnosis of cancer
CN113151468A (zh) * 2014-06-13 2021-07-23 东丽株式会社 乳癌的检测试剂盒或装置以及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3438266A4 (en) 2020-02-26
EP3438266A1 (en) 2019-02-06
WO2017171039A1 (ja) 2017-10-05
CN108884463A (zh) 2018-11-23
CA3019550A1 (en) 2017-10-05
JPWO2017171039A1 (ja) 2019-02-14
US20190112668A1 (en) 2019-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7082380B2 (ja) 膵臓がんの検出キット又はデバイス及び検出方法
JP6970416B2 (ja) 肺がんの検出キット又はデバイス及び検出方法
CN106414774B (zh) 胆道癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
CN106661619B (zh) 大肠癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
CN106459964B (zh) 食道癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
CN106459963B (zh) 前列腺癌的检测试剂盒或装置以及检测方法
JP6925125B2 (ja) 胃がんの検出キット又はデバイス及び検出方法
KR20200019849A (ko) 폐암의 검출을 위한 키트, 디바이스 및 방법
KR20180132748A (ko) 악성 뇌종양의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
JP6611411B2 (ja) 膵臓がんの検出キット及び検出方法
JP2011211955A (ja) 肝ガン患者予後予測用組成物及び方法
JP6383541B2 (ja) 胆管がんの検出キット及び検出方法
JP7378739B2 (ja) 前立腺がんの検出のためのキット、デバイス及び方法
WO2020179895A1 (ja) 子宮平滑筋肉腫の検出のためのキット、デバイス及び方法
JP5897823B2 (ja) 膀胱ガン診断用組成物及び方法
JP2018074938A (ja) 悪性骨軟部腫瘍の検出用キット又はデバイス及び検出方法
WO2023068318A1 (ja) 卵巣がんと卵巣良性腫瘍とを判別するためのキット、デバイス及び方法
JP2023076054A (ja) がん患者の緩和ケア病棟入院の要否を予測するためのキット、デバイス及び方法
CN118119708A (zh) 用于判别卵巢癌与卵巢良性肿瘤的试剂盒、装置和方法
JP2020080773A (ja) ニボルマブ薬効予測のためのキット及び方法