JP6383541B2 - 胆管がんの検出キット及び検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、被験体において胆管がんへの罹患の有無の検査のために使用される、特定のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸を含む胆管がんの検出用キット、及び当該核酸を用いて当該ｍｉＲＮＡの発現量を測定することを含む胆管がんの検出方法に関する。

胆管は肝臓でつくられる胆汁を十二指腸乳頭部まで導く管であり、肝臓内の肝内胆管と、肝臓外の肝外胆管に大別される。肝外胆管は胆汁を保管して濃縮する胆嚢と胆嚢管でつながっており、肝外胆管と胆嚢管が合流した肝外胆管を特に総胆管と呼び、肝内胆管、肝外胆管、胆嚢を合わせて胆道と呼ぶ。

胆管がんの大部分は内腔を覆う胆管上皮細胞ががん化したものであり、化学療法や放射線治療は効果が薄く、早期発見による外科切除が唯一の根治治療である。しかし、初期の胆管がんに自覚症状はなく、肝外胆管がんでは、がんが進行して胆管が閉塞し、胆汁が血管に逆流して初めて黄疸やかゆみといった自覚症状が生じるため、進行がんの状態で発見されることが多い。また、肝内胆管がんは、肝外胆管を閉塞させることが少ないため、多くは黄疸症状が出ずに無症状のまま病気が進行してしまう。独立行政法人国立がん研究センターがん対策情報センターが開示する２０１１年の日本国内における部位別のがん死亡率の統計によると、胆嚢・胆管がんの死亡数は１８，１８６人にのぼり、２００３〜２００５年の部位別５年相対生存率は男性で２２．５％、女性で１９．９％と膵臓がんに次いで悪い。胆管は肝臓や膵臓といった重要な臓器と密接に関係しているため、これらの臓器にがんが転移して予後を悪化させる要因となっている。

胆管がんは発生した部位によって肝内胆管がんと肝外胆管がんに大別される。肝外胆管がんは、肝臓の入り口の肝門部（肝門部胆管がん）、肝門部から胆嚢までの上部（上部胆管がん）、胆嚢から膵臓までの中部（中部胆管がん）、膵臓から十二指腸乳頭部までの下部（下部胆管がん）の４つに分けられ、肝臓に近い胆管に生じたがんほど手術が困難であり、予後が悪いことが知られている。

日本における肝外胆管がんの進行度は、「胆道癌取扱い規約第５版」（日本胆道外科研究会編、金原出版株式会社、２００３年、ｐ２７）に定められており、リンパ節転移、腹腔外遠隔他臓器転移、肉眼的胆管周囲進展度などによってｓｔａｇｅ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶａ、ＩＶｂに分類される。

胆道がんの最初の診断には、一般に、低侵襲的な血液生化学検査と腹部超音波検査が用いられる（非特許文献１）。しかし、胆管閉塞例ではアルカリフォスファターゼ、γ−ＧＴＰ、ビリルビンなどが上昇するものの、これらの血液生化学検査は胆管がんに特異的なものではない。また、腹部超音波検査による胆管がんの描出率は２１〜９０％と幅があり、占拠部位が下部胆管では描出率が低下してしまう。

また、非特許文献１には、胆道がんの腫瘍マーカーとして、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＩＬ−６などが知られていることが記載されている。このうち、ＣＥＡは胆道がん患者の４０〜７０％で上昇すること、ＣＡ１９−９は５０〜７９％の胆道がん患者で上昇することが知られているが、胆管がんに特異的ではなく、早期診断に用いることは困難であると記載されている。また、ＤＵＰＡＮ−２、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＩＬ−６については、その臨床的有用性がはっきりとしていないと記載されている。

研究段階ではあるが、生体サンプル中のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現量によって、がんを判別するという報告がある。特許文献１には、ｍｉＲ−１３５ａ及びその前駆体と、その他の数十個のｍｉＲＮＡを組み合わせてがんの評価をすることが記載されており、がんの１例として胆管がんが示されている。

特表２００８−５００８３７号公報

胆道癌診療ガイドライン作成出版委員会編、「エビデンスに基づいた胆道癌診療ガイドライン」、医学図書出版株式会社、２００７年、３８−３９頁

特許文献１には、上記のとおり、ｍｉＲ−１３５ａ及びその前駆体と、その他の数十個のｍｉＲＮＡを組み合わせてがんの評価をすること、及び対象とするがんの１例として胆管がんが記載されているが、胆管がん患者の生体試料におけるｍｉＲ−１３５ａ及びその前駆体の具体的な精度、感度、特異度などの検出性能についての記載はなく、また、数個程度のマーカーを組み合わせることにより簡便に、かつ高精度に判別しようとすることについて記載もない。また、具体的にどのような検体を用いて胆管がんを診断できるのかについても記載されていない。

このように、既知の腫瘍マーカーは検出性能が検証されていないか、検証されていても精度及び／又は感度及び／又は特異度に乏しい。そのため、これらを用いて胆管がんを検出しようとしても、健常体を胆管がん患者と誤検出することによる無駄な追加検査が必要となり、また胆管がん患者を見落とすことによる治療機会の逸失がおこる可能性がある。また、数十個のｍｉＲＮＡを測定することは検査費用を増大させるため、健康診断のような大規模なスクリーニングには使用しづらい。また、ｍｉＲＮＡを測定するために胆管組織を採取することは患者に与える侵襲性が高く好ましくないため、低侵襲に採取できる、例えば血液を使用することが可能で、胆管がん患者を胆管がん患者と、健常体を健常体と正しく判別できる精度の高い胆管がんマーカーが求められる。特に、胆管がんは早期発見による切除が唯一の根治治療となるため、感度の高い胆管がんマーカーが切望されている。

本発明の課題は、精度、感度及び特異度のいずれも高い、新規な胆管がん腫瘍マーカーを提供し、当該マーカーに特異的に結合可能な核酸を用いて胆管がんを効果的に検出できる方法を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、胆管がんの検出マーカーに使用可能な新たな遺伝子を見出した。そして、これに特異的に結合可能な核酸を用いることにより、胆管がんを有意に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。

＜発明の概要＞
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐから選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを含む、胆管がんの検出用キット。
（２）ｍｉＲ−２０４−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０がｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５がｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｍｉＲ−５００１−５ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐである、（１）に記載のキット。
（３）前記核酸プローブが、下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、（１）又は（２）に記載のキット。
（４）前記核酸プローブに、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のキット。
（５）ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐである、（４）に記載のキット。
（６）前記のさらに含む核酸プローブが、下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（４）又は（５）に記載のキット。
（７）ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐから選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを用いて、被験体の生体試料における標的核酸の発現量を測定し、該発現量を用いて被験体が胆管がんに罹患していること、又は胆管がんに罹患していないことをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定することを含む、胆管がんの検出方法。
（８）ｍｉＲ−２０４−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０がｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５がｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｍｉＲ−５００１−５ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐである、（７）に記載の方法。
（９）前記核酸プローブが、下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜５で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）前記核酸プローブに、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐである、（１０）に記載の方法。
（１２）前記のさらに含む核酸プローブが、下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記被験体が、ヒトである、（７）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記生体試料が、血液、血清又は血漿である、（７）〜（１３）のいずれかに記載の方法。

＜用語の定義＞
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。

本明細書において「断片」とは、ポリヌクレオチドの連続した一部分の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、１５塩基以上の長さを有することが望ましい。

本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。

従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びこれらの断片、ヒトゲノム、及びそれらの転写産物のいずれも含む。また当該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１〜２２で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる小胞に内包された状態にあってもよい。

本明細書において「エキソソーム」又は「エクソソーム」とは、細胞から分泌される脂質二重膜に包まれた小胞である。エキソソームは多胞エンドソームに由来し、細胞外環境に放出される際にＲＮＡ、ＤＮＡ等の「遺伝子」やタンパク質などの生体物質を内部に含むことがある。エキソソームは血液、血清、血漿、リンパ液等の体液に含まれることが知られている。

本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。

また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基の非コーディングＲＮＡを意図して用いられる。また本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、当該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１〜２２で表されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。

本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。

本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。

ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１〜２２によって定義される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、核酸プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、核酸プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。

本明細書において「Ｔｍ値」とは、ポリヌクレオチドの二本鎖部分が一本鎖へと変性し、二本鎖と一本鎖が１：１の比で存在する温度を意味する。

本明細書において「断片」とは、配列番号で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、もしくはそれらに相補的な塩基配列からなる核酸を意味する。

本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、あるいは配列番号で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１、２もしくは３又はそれ以上の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは配列番号１〜２２の配列の前駆体ＲＮＡ（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ）の塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは当該塩基配列の各々又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは当該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。

本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。

本明細書において、変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用した突然変異導入法などの周知の技術を用いて作製可能である。

本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇら、２０００年、Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．、７巻、ｐ２０３−２１４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．、第８５巻、ｐ２４４４−２４４８）。

本明細書において「誘導体」とは、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ； Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、ｐ１４９７−５００）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ； Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら，１９９８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３９巻、ｐ５４０１−５４０４）などを含むことを意味する。

本明細書において「核酸プローブ」又は「プライマー」は、被験体中の胆管がんの有無を検出するために、又は胆管がんの罹患の有無、罹患の程度、胆管がんの改善の有無や改善の程度、胆管がんの治療に対する感受性を診断するために、あるいは胆管がんの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用される。これらには胆管がんの罹患に関連して生体内、特に血液、尿等の体液等の生体試料において配列番号１〜２２で表される転写産物又はそのｃＤＮＡ合成核酸を特異的に認識し結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。

本明細書で使用する「検出」という用語は、検査、測定、検出又は、判定支援という用語で置換しうる。

本明細書で使用される「被験体」は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳動物を意味する。また、「健常体」もまた、このような哺乳動物であって、検出しようとするがんに罹患していない動物を意味する。

本明細書で使用される「Ｐ」又は「Ｐ値」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「Ｐ」又は「Ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。

本明細書において、「感度」は、（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陰性の数）の値を意味する。感度が高ければ胆管がんを早期に発見することが可能となり、完全ながん部の切除や再発率の低下につながる。

本明細書において、「特異度」は、（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陽性の数）を意味する。特異度が高ければ健常体を胆管がん患者と誤判別することによる無駄な追加検査の実施を防ぎ、患者の負担の軽減や医療費の削減につながる。

本明細書において、「精度」は（真陽性の数＋真陰性の数）／（全症例数）の値を意味する。精度は全検体に対しての判別結果が正しかった割合を示しており、診断性能を評価する第一の指標となる。

本明細書において、「Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ」は遺伝子の発現値をｌｏｇ２−ｓｃａｌｅに変換した場合の、（胆管がん患者群の中央値−健常体群の中央値）で算出される。Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅの絶対値が大きいほど２群の中央値の差が大きいことを意味する。

本明細書において、「ＡＵＲＯＣ値」とは、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）下の面積を意味し、患者を陽性群と陰性群に分けるための予測、判定、検出又は診断の方法の精度を測る指標となる。これらの曲線では、評価対象となる方法が示す結果に関して、縦軸に陽性患者において陽性の結果がでる確率（感度）と、横軸に陰性患者において陰性の結果がでる確率（特異度）を１から減算した値（偽陽性率）がプロットされる。

本明細書において判定、検出又は診断の対象となる「試料」とは、胆管がんの発生、胆管がんの進行、及び胆管がんに対する治療効果の発揮にともない本発明の遺伝子が発現変化する組織及び生体材料を指す。具体的には胆管組織及びその周辺の脈管、リンパ節及び臓器、また転移が疑われる臓器、皮膚、及び血液、尿、唾液、汗、組織浸出液などの体液、血液から調整された血清、血漿、その他、便、毛髪などを指す。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ」という用語は、配列番号１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２２６９３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ遺伝子は、Ｌａｎｄｇｒａｆ Ｐら、２００７年、Ｃｅｌｌ．、第１２９号、ｐ．１４０１−１４１４に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−２０４」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００００２８４、配列番号７）が知られている。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ」という用語は、配列番号２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１８１０３）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ遺伝子は、Ｖａｚ Ｃら、２０１０年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第１１巻、ｐ．２８８に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−３６７８」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１６０７９、配列番号８）が知られている。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０」という用語は、配列番号３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−７６０遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４９５７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０遺伝子は、Ｌａｎｄｇｒａｆ Ｐ．ら、２００７年、Ｃｅｌｌ．、第１２９巻、ｐ．１４０１−１４１４に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−７６０」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ０００５５６７、配列番号９）が知られている。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５」という用語は、配列番号４に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９７５７）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第７１巻、ｐ．７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−４６７５」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１７３０６、配列番号１０）が知られている。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ」という用語は、配列番号５に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２１０２１）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ遺伝子は、Ｃｕｍｍｉｎｓ ＪＭ．ら、２００６年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．、第１０３巻、ｐ．３６８７−３６９２に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−５００１」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００１７８６７、配列番号１１）が知られている。

本明細書で使用される「ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ遺伝子」又は「ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ」という用語は、配列番号６に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００４５９５）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ遺伝子は、Ｌａｎｄｇｒａｆ Ｐ．ら、２００７年、Ｃｅｌｌ．、第１２９巻、ｐ．１４０１−１４１４に記載される方法によって得ることができる。また、「ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「ｈｓａ−ｍｉｒ−１３５ａ−１」（ｍｉＲＢａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩ００００４５２、配列番号１２）が知られている。

また、成熟型のｍｉＲＮＡは、ヘアピン様構造をとるＲＮＡ前駆体から成熟型ｍｉＲＮＡとして切出されるときに、配列の前後１〜数塩基が短く、又は長く切出されることや、塩基の置換が生じて変異体となることがあり、ｉｓｏｍｉＲと称される（Ｍｏｒｉｎ ＲＤ．ら、２００８年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、第１８巻、ｐ．６１０−６２１）。ｍｉＲＢａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ２０では、配列番号１〜６で表される塩基配列のほかに、数々のｉｓｏｍｉｒと呼ばれる配列番号１４〜２２で表される塩基配列の変異体及び断片も示されている。これらの変異体もまた、配列番号１〜６で表される塩基配列のｍｉＲＮＡとして得ることができる。

すなわち、本発明の配列番号１〜３及び５〜６で表される塩基配列もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、の変異体の例としては、それぞれ配列番号１３、１５、１７、１９、２１で表されるポリヌクレオチド、及びｍｉＲＢａｓｅに登録された、配列番号１３、１５、１７、１９、２１の数々のｉｓｏｍｉｒであるポリヌクレオチドが挙げられる。また、本発明の配列番号１〜３及び５〜６で表される塩基配列もしくは該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、の断片の例としては、それぞれ配列番号１４、１６、１８、２０、２２で表される配列のポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、配列番号１〜６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの例としては、それぞれ前駆体である配列番号７〜１２で表されるポリヌクレオチドが挙げられる。

本明細書において「特異的に結合可能な」とは、本発明で使用する核酸プローブ又はプライマーが、特定の標的核酸と結合し、他の核酸と実質的に結合できないことを意味する。

本発明により、胆管がんを容易にかつ高い精度、感度及び特異度で検出することが可能になった。

特に、本発明によれば、低侵襲的に採取できる患者の血液、血清及び／又は血漿のサンプルを使用することが可能であり、このサンプル中の数個のｍｉＲＮＡ測定値を指標とすることで、容易かつ高い精度、感度及び特異度にて胆管がんの有無を検出することができる。

この図は、前駆体である配列番号８で表されるｈｓａ−ｍｉｒ−３６７８と、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６７８から生成される配列番号２で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐの塩基配列の関係を示す。 この図は、ＤＮＡチップによる健常体（Ｎ＝１０）、胆管がん患者（Ｎ＝１３）由来血清中の配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５の測定値（ｌｏｇ２−ｓｃａｌｅ）を用いた場合のフィッシャーの判別分析結果を示す。 この図は、ＤＮＡチップによる健常体（Ｎ＝１０）、胆管がん患者（Ｎ＝１３）由来血清中の配列番号２で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐと配列番号５で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐの測定値（ｌｏｇ２−ｓｃａｌｅ）を用いた場合のフィッシャーの判別分析結果を示す。 この図は、ＤＮＡチップによる健常体（Ｎ＝１０）、胆管がん患者（Ｎ＝１３）由来血清中の配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐと配列番号３で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−７６０の測定値（ｌｏｇ２−ｓｃａｌｅ）を用いた場合のマハラノビス距離による判別分析結果を示す。 この図は、ＤＮＡチップによる健常体（Ｎ＝１０）、胆管がん患者（Ｎ＝１３）由来血清中の配列番号４で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５の測定値（ｌｏｇ２−ｓｃａｌｅ）を用いた場合のマハラノビス距離による判別分析結果を示す。

以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．胆管がんの標的核酸
本発明の上記定義の胆管がん検出用の核酸プローブ又はプライマーを使用して、胆管がん又は胆管がん細胞の存在及び／又は不存在を検出するための、胆管がんマーカーとしての主要な標的核酸には、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡが含まれる。さらにこれらのｍｉＲＮＡと組み合わせることができる他の胆管がんマーカー、すなわち、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのｍｉＲＮＡも標的核酸として好ましく用いることができる。

上記のｍｉＲＮＡには、例えば、配列番号１〜６で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ）、その同族体、その転写産物、あるいは及びその変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。

好ましい標的核酸は、配列番号１〜２２で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、その転写産物、より好ましくは当該転写産物、すなわちｍｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。

本発明において胆管がんの標的となる上記遺伝子はいずれも、健常体と比べて胆管がんに罹患した被験体において発現量が変化しているものである（後述の実施例１を参照）。

第１の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告は知られていない。

第２の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告は知られていない。

第３の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告は知られていない。

第４の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告は知られていない。

第５の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告は知られていない。

第６の標的遺伝子は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化が胆管がんのマーカーになりうるという報告が知られている（上記の特許文献１）。

２．胆管がんの検出用の核酸プローブ又はプライマー
本発明において、胆管がんを検出するための、あるいは胆管がんを診断するために使用可能な核酸プローブ又はプライマーは、胆管がんの標的核酸としての、ヒト由来の、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ、あるいはそれらの組み合わせ、並びに、それらと場合により組み合わせることができる、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、あるいはそれらの組み合わせ、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現量又は存在量を定性的及び／又は定量的に測定することを可能にする。

上記の標的核酸は、健常体と比べて胆管がんに罹患した被験体において、該標的核酸の種類に応じてそれらの発現量が増加するものもあれば、又は低下するものもある（以下、「増加／低下」と称する。）。それゆえ、本発明の組成物は、胆管がんの罹患が疑われる被験体（例えばヒト）由来の体液と健常体由来の体液について上記標的核酸の発現量を測定し、それらを比較して、胆管がんを検出するために有効に使用することができる。

本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーは、配列番号１〜５の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブ、あるいは、配列番号１〜５の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーである。

本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーはさらに、配列番号６の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブ、あるいは、配列番号６の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含むことができる。

具体的には、上記の核酸プローブ又はプライマーは、配列番号１〜２２で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件（後述）でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、並びにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは１７以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた１又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸である上記胆管がんマーカーを検出するための核酸プローブ及びプライマーとして使用できる。

さらに具体的には、本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーの例は、以下のポリヌクレオチド（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される１又は複数のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜５のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーはさらに、上記のポリヌクレオチド（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドの他に、下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチドを含むことができる。
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。

上記のポリヌクレオチドにおいて「１５以上の連続した塩基を含むそのポリヌクレオチド」は、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１５〜１７塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。

本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。

本発明で使用可能な上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。

ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＵＳ （１９９３）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳ （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。

配列番号１〜６で表されるヒト由来の、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐは公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、この遺伝子をクローニングすることによって、本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを作製することができる。

そのような核酸プローブ又はプライマーは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。

あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｗａｋｏ（和光純薬工業）などを利用できる。

ここで、配列番号１〜６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを検出するための核酸プローブ及びプライマーの配列は、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体としては生体内に存在していない。例えば、配列番号２で表される塩基配列は、配列番号８で表される前駆体から生成されるが、この前駆体は図１に示すようなヘアピン様構造を有しており、配列番号２で表される塩基配列は相補鎖に対してミスマッチ配列を有している。このため、配列番号２で表される塩基配列に対する、完全に相補的な塩基配列が生体内で自然に生成されることはない。このため、配列番号１〜６で表される塩基配列を検出するための核酸プローブ及びプライマーは生体内に存在しない人工的な塩基配列を有することになる。

３．胆管がん検出用キット
本発明はまた、本発明において核酸プローブ又はプライマーとして使用可能なポリヌクレオチド（これには、変異体、断片、又は誘導体を含みうる。）の１つ又は複数を含む胆管がん検出用キットを提供する。

本発明のキットは、好ましくは、上記２に記載したポリヌクレオチド類から選択される１又は複数のポリヌクレオチド又はその変異体を含む。

具体的には、本発明のキットは、配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、その相補的配列を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチド配列の１５以上の連続した塩基を含む変異体又は断片、を少なくとも１つ以上含むことができる。

本発明のキットはさらに、配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、その相補的配列を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチド配列の１５以上の連続した塩基を含む変異体又は断片、を１つ以上含むことができる。

本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）〜（２）からなる群より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のＤＮＡである：
（１）配列番号１〜５で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（２）配列番号６で表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。

好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上、より好ましくは１７以上の連続した塩基を含む変異体である。

また、好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上、より好ましくは１７以上の連続した塩基を含む変異体である。

好ましい実施形態では、前記断片は、１５以上、より好ましくは１７以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドであることができる。

本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、１７〜配列の全塩基数、１７〜１９塩基などの範囲の塩基数である。

本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、具体的には後述の表２、表４又は表５に示されるような配列番号の組み合わせに関する上記のポリヌクレオチドを挙げることができるが、それらはあくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。

本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド（これには、変異体、断片又は誘導体を包含しうる。）に加えて、胆管がん検出を可能とする既知のポリヌクレオチド又は将来見出されるであろうポリヌクレオチドも包含させることができる。

本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、及びその変異体又はその断片に加えて、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＩＬ−６などの公知の胆管がん検査用マーカーを測定するための抗体も包含させることができる。

本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、及びその変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されうる。

４．胆管がんの検出方法
本発明はさらに、上記３．で説明した本発明のキット（本発明で使用可能な上記の核酸プローブ及び／又はプライマーを含む。）を用いて、生体試料（検体試料）中の、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐで表される胆管がん由来の遺伝子の発現量、並びに場合により、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐで表される胆管がん由来の遺伝子の発現量、をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定し、さらに、胆管がんの罹患が疑われる被験体と、健常体（非胆管がん患者を含む）とから採取した血液、血清、血漿等の生体試料を用いて、試料中の上記遺伝子の発現量を比較して、当該生体試料中の標的核酸の発現量に差がある場合、被験体が胆管がんに罹患していると評価することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胆管がんの検出方法を提供する。

本明細書中、胆管がんの検出方法は、胆管がんの検査方法又は胆管がんの検出の支援（若しくは、補助）方法と置換することも可能である。

本発明の上記方法は、低侵襲的に、感度及び特異度の高い、がんの早期診断を可能とし、これにより、早期の治療及び予後の改善をもたらし、さらに、疾病憎悪のモニターや外科的、放射線療法的、及び化学療法的な治療の有効性のモニターを可能にする。

本発明の血液、血清、血漿等の生体試料から胆管がん由来の遺伝子を抽出する方法としては、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ ｋｉｔ （東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を加えて調整するのが特に好ましいが、一般的な酸性フェノール法（Ａｃｉｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法）を用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）やＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）などの酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を加えて調製してもよい。さらに、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）などのキットを利用できるが、これらの方法に限定されない。

本発明はまた、本発明のキットの、被験体由来の生体試料中の胆管がん由来のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現産物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出のための使用を提供する。

本発明の上記方法において、上記キットは、上で説明したような、本発明で使用可能なポリヌクレオチドを単一であるいはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。

本発明の胆管がんの検出又は（遺伝子）診断において、本発明のキットに含まれるポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーとしてとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍなどを利用できるが、これらの方法に限定されない。

本発明のキットに含まれるポリヌクレオチドは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などのハイブリダイゼーション技術、定量ＲＴ−ＰＣＲ法などの定量増幅技術などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を採取する。あるいは、そのような体液から上記の方法によって調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに当該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。

本発明のキットは、胆管がんの診断又は罹患の有無の検出のために有用である。具体的には、当該キットを使用した胆管がんの検出は、胆管がんの罹患が疑われる被験体から、血液、血清、血漿、尿等の試料を用いて、当該キットに含まれる核酸プローブ又はプライマーで検出される遺伝子の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することによって行うことができる。胆管がんの罹患が疑われる被験体の血液、血清、血漿、尿等の試料中の、配列番号１〜５の少なくとも１つ以上で表される塩基配列、並びに場合により配列番号６で表される塩基配列、からなるポリヌクレオチドの発現量が、健常体の血液、血清、又は血漿、尿等の試料中のそれらの発現量と比べて統計学的に有意に高い場合、当該被験体は胆管がんに罹患していると評価することができる。

本発明のキットを利用した生体試料中に胆管がん由来の遺伝子の発現産物が含まれないこと、又は胆管がん由来の遺伝子の発現産物が含まれること、の検出方法は、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を採取して、そこに含まれる標的遺伝子の発現量を、本発明のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド（変異体、断片又は誘導体を包含する。）を用いて測定することにより、胆管がんの有無を評価する又は胆管がんを検出することを含む。また本発明の胆管がんの検出方法を通して、例えば胆管がん患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における当該疾患の改善の有無又は改善の程度を評価又は診断することもできる。

本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のステップ：
（ａ）被験体由来の生体試料を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明のキットのポリヌクレオチドと接触させるステップ、
（ｂ）生体試料中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブ又はプライマーとして用いて測定するステップ、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、当該被験体中の胆管がん（細胞）の存在又は不存在を評価するステップ、
を含むことができる。

具体的には、本発明は、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐから選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを用いて、被験体の生体試料における標的核酸の発現量を測定し、該発現量を用いて被験体が胆管がんに罹患していること、又は胆管がんに罹患していないことをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することを含む、胆管がんの検出方法を提供する。

本明細書において「評価」するとは、医師による判定ではなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの検査による結果に基づいた評価支援である。

上記のとおり、本方法において、具体的には、ｍｉＲ−２０４−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐであり、ｍｉＲ−３６７８−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐであり、ｍｉＲ−７６０がｈｓａ−ｍｉＲ−７６０であり、ｍｉＲ−４６７５がｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５であり、及び、ｍｉＲ−５００１−５ｐがｈｓａ−５００１−５ｐである。

また、本方法において、具体的には、核酸プローブが、下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される。

核酸プローブにはさらに、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを含むことができる。
具体的には、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐである。

さらに、具体的には、核酸プローブが、下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｇ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｉ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。

本発明方法で用いられる生体試料は、被験体の生体組織（好ましくは、胆管組織）、血液、血清、血漿、尿等の体液など、から調製される試料を挙げることができる。具体的には、当該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、それからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、血液、血清、血漿、尿等の体液、被験体の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、手術によって摘出した生体組織、などであり、これらから、測定のための試料を調製することができる。

本明細書で被験体とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じてステップを変更することができる。

測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、胆管がん（細胞）の検出は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験体の生体試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明のキットのポリヌクレオチドと結合させるステップ、
（ｂ）当該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のＲＮＡ又は当該ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、あるいは、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定するステップ、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、胆管がん（由来の遺伝子）の存在又は不存在を評価するステップ、
を含むことができる。

本発明によって胆管がん（由来の遺伝子）をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出、検査、評価又は診断するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。このようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。

ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明で使用可能な上記核酸プローブを用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその発現量を検出又は測定することができる。具体的には、核酸プローブ（相補鎖）を放射性同位元素（^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被検者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成されたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ（富士写真フィルム株式会社）、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ ８６５（ＧＥヘルスケア社）、などを例示できる）で検出又は測定する方法を例示することができる。

定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明で使用可能な上記プライマーを用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現量を検出又は測定することができる。具体的には、被検体の生体組織由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の検出用組成物から調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせ、標識した核酸プローブとハイブリダイズさせて検出する方法を含むことができる。

ＤＮＡアレイ解析を利用する場合は、本発明の上記検出用組成物を核酸プローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けたＤＮＡチップを用いる。核酸プローブを貼り付けた領域をプローブスポット、核酸プローブを貼り付けていない領域をブランクスポットと称する。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡアレイにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、当該ＤＮＡアレイを含むものとする。ＤＮＡチップとしては３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用いることができるが、これに限られない。

ＤＮＡチップの測定は、限定されないが、例えば検出用組成物の標識物に由来するシグナルを画像検出器（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０（ＧＥヘルスケア社）、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）などを例示できる）で検出又は測定する方法を例示することができる。

本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」とは、上述のように核酸プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件である。

ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションとその後の洗浄によって、規定される。そのハイブリダイゼーションの条件は、限定されないが、例えば３０℃〜６０℃で、ＳＳＣ、界面活性剤、ホルムアミド、デキストラン硫酸塩、ブロッキング剤などを含む溶液中で１〜２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．０）であり、界面活性剤はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｔｏｎ、もしくはＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３〜１０×ＳＳＣ、０．１〜１％ ＳＤＳを含む。ストリンジェントな条件を規定するもうひとつの条件である、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに当該鎖と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。

これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ＆ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。

本発明のキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際の条件の例としては、例えば１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣＬ、１〜２ｍＭ ＭｇＣｌ_２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ値＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍ値の計算方法としてＴｍ値＝２×（アデニン残基数＋チミン残基数）＋４×（グアニン残基数＋シトシン残基数）などが挙げられる。

また、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）：ＬＮＡ（登録商標）−ｂａｓｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ＰＣＲ（Ｅｘｉｑｏｎ社）：Ｎｃｏｄｅ（登録商標） ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＴ キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの、ｍｉＲＮＡを定量的に測定するために特別に工夫された市販の測定用キットを用いてもよい。

遺伝子発現量の算出としては、限定されないが、例えばＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ（Ｓｐｅｅｄ Ｔ．著、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ／ＣＲＣ）、及びＡ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）などに記載された統計学的処理を、本発明において利用できる。例えばＤＮＡチップ上のブランクスポットの測定値の平均値に、ブランクスポットの測定値の標準偏差の２倍、好ましくは３倍、より好ましくは６倍を加算し、その値以上のシグナル値を有するプローブスポットを検出スポットとみなすことができる。さらに、ブランクスポットの測定値の平均値をバックグラウンドとみなし、プローブスポットの測定値から減算し、遺伝子発現量とすることができる。遺伝子発現量の欠損値については、解析対象から除外するか、好ましくは各ＤＮＡチップにおける遺伝子発現量の最小値で置換するか、より好ましくは遺伝子発現量の最小値の対数値から０．１を減算した値、で置換することができる。さらに、低シグナルの遺伝子を除去するために、測定サンプル数の２０％以上、好ましくは５０％、より好ましくは８０％以上において２の６乗、好ましくは２の８乗、より好ましくは２の１０乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを解析対象として選択することができる。遺伝子発現量の正規化（ノーマライゼーション）としては、限定されないが、例えばｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎやｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｂｏｌｓｔａｄ， Ｂ． Ｍ．ら、２００３年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１９巻、ｐ１８５−１９３）、などが挙げられる。

本発明はまた、本発明の診断用ポリヌクレオチド、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験体由来の生体試料中の標的遺伝子又は遺伝子の発現量を測定し、胆管がん患者由来の生体試料と健常体由来の生体試料の遺伝子発現量を教師サンプルとして判別式（判別関数）を作成し、生体試料が胆管がん由来の遺伝子を含むこと及び／又は含まないことを決定又は評価する方法を提供する。

すなわち、本発明はさらに、本発明の診断用ポリヌクレオチド、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、生体試料が胆管がん由来の遺伝子を含むこと／又は胆管がん由来の遺伝子を含まないことを決定又は評価することが既知の複数の生体試料中の標的遺伝子の発現量をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第１のステップ、前記第１のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を教師サンプルとした判別式を作成する第２のステップ、被験体由来の生体試料中の当該標的遺伝子の発現量を第１のステップと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する第３のステップ、前記第２のステップで得られた判別式に第３のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を代入し、当該判別式から得られた結果に基づいて、生体試料が胆管がん由来の遺伝子を含むこと／又は胆管がん由来の遺伝子を含まないことを決定又は評価する第４のステップを含む、ここで、当該標的遺伝子が当該ポリヌクレオチド、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、及びその変異体又はその断片によって検出可能なものである、前記方法を提供する。ここで、フィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）などを用いて判別式を作成できるが、これらに限定されない。

線形判別分析は群分けの境界が直線あるいは超平面である場合、式１を判別式として用いて群の所属を判別する方法である。式中、ｘは説明変数、ｗは説明変数の係数、ｗ_０は定数項を表す。

判別式で得られた値を判別得点と呼び、新たに与えられたデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入し、判別得点の符号で群分けを判別することができる。

線形判別分析の一種であるフィッシャーの判別分析は群判別を行うのに適した次元を選択するための次元削減法であり、合成変数の分散に着目して、同じラベルを持つデータの分散を最小化することで識別力の高い合成変数を構成する（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ． Ｎ．ら著 Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｓ． Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．、２００２年）。フィッシャーの判別分析では式２を最大にするような射影方向ｗを求める。ここで、μは入力の平均、ｎ_ｇはｇ群に属するデータ数、μ_ｇはｇ群に属するデータの入力の平均とする。分子・分母はそれぞれデータをベクトルｗの方向に射影したときの群間分散、群内分散となっており、この比を最大化することで判別式係数ｗ_ｉを求める。（金森敬文ら著、「パターン認識」、共立出版（２００９年）、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｏ．ら著、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）。

マハラノビス距離はデータの相関を考慮した式３で算出され、各群からのマハラノビス距離の近い群を所属群として判別する非線形判別分析として用いることができる。ここで、μは各群の中心ベクトル、Ｓ^−１はその群の分散共分散行列の逆行列である。中心ベクトルは説明変数ｘから算出され、平均ベクトルや中央値ベクトルなどを用いることができる。

ＳＶＭとはＶ．Ｖａｐｎｉｋが考案した判別分析法である（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｎｉｎｇ Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年）。分類すべき群分けが既知のデータセットの特定のデータ項目を説明変数、分類すべき群分けを目的変数として、当該データセットを既知の群分けに正しく分類するための超平面と呼ばれる境界面を決定し、当該境界面を用いてデータを分類する判別式を決定する。そして当該判別式は、新たに与えられるデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入することにより、群分けを判別することができる。また、このときの判別結果は分類すべき群でも良く、分類すべき群に分類されうる確率でも良く、超平面からの距離でも良い。ＳＶＭでは非線形な問題に対応するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の識別を行う方法が知られている。非線形に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表現されるような式のことをカーネルと呼び、カーネルの一例としてリニアカーネル、ＲＢＦ（Ｒａｄｉａｌ Ｂａｓｉｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）カーネル、ガウシアンカーネルを挙げることができる。カーネルによって高次元に写像しながら、実際には写像された空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な判別式、すなわち判別式を構成することができる。（例えば、麻生英樹ら著、統計科学のフロンテイア６「パターン認識と学習の統計学 新しい概念と手法」、岩波書店（２００４年）、Ｎｅｌｌｏ Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉら著、ＳＶＭ入門、共立出版（２００８年））。

ＳＶＭ法の一種であるＣ−ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｃ−ＳＶＣ）は、２群の説明変数で学習を行って超平面を作成し、未知のデータセットがどちらの群に分類されるかを判別する（Ｃ． Ｃｏｒｔｅｓら、１９９５年、Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ、２０巻、ｐ２７３−２９７）。

本発明の方法で使用可能なＣ−ＳＶＣの判別式の算出例を以下に示す。まず全被験体を胆管がん患者と健常体の２群に群分けする。被験体が胆管がん患者である、もしくは健常体であると判断する基準としては、例えば胆管組織検査を用いることができる。

次に、分けられた２群の血清由来の生体試料の網羅的遺伝子発現量からなるデータセット（以下、学習セット）を用意し、当該２群の間で遺伝子発現量に明確な差が見られる遺伝子を説明変数、当該群分けを目的変数（例えば−１と＋１）としたＣ−ＳＶＣによる判別式を決定する。式４は最適化する目的関数であり、式中、ｅは全ての入力ベクトル、ｙは目的変数、ａはＬａｇｒａｎｇｅ未定乗数ベクトル、Ｑは正定値行列、Ｃは制約条件を調整するパラメータを表す。

式５は最終的に得られた判別式であり、判別式によって得られた値の符号で所属する群を決定できる。ここで、ｘはサポートベクトル、ｙは群の所属を示すラベル、ａは対応する係数、ｂは定数項、Ｋはカーネル関数である。

カーネル関数としては例えば式６で定義されるＲＢＦカーネルを用いることができる。ここで、ｘはサポートベクトル、γは超平面の複雑さを調整するカーネルパラメータを表す。

そして、未知の胆管がん患者もしくは健常体については、当該胆管がん患者もしくは当該胆管がん患者の血清における、当該判別式で使用する遺伝子の発現量を測定し、それらを当該判別式のｘに代入することによって、胆管がん患者又は健常体のいずれに所属するかを判別することができる。

これらのほかにも被験体由来の生体試料が胆管がん由来の遺伝子を含むこと及び／又は含まないことを決定又は評価する方法として、ニューラルネットワーク、ｋ−近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を選択することができる。

本発明の方法は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）胆管がん患者由来の胆管がん由来遺伝子を含む組織及び／又は健常体由来の胆管がん由来遺伝子を含まない組織であることが既に知られている生体試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による検出用ポリヌクレオチド、キット又はＤＮＡチップを用いて測定するステップ、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値から、上記の式１〜３、５及び６の判別式を作成するステップ、
（ｃ）被験体由来の生体試料中の当該標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用ポリヌクレオチド、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて生体試料が胆管がん由来遺伝子を含むこと及び／又は含まないことを決定又は評価するステップ、
を含むことができる。ここで、式１〜３、５及び６の式中のｘは説明変数であり、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を測定することによって得られる値を含み、具体的には本発明の胆管がん患者と健常体を判別するための説明変数は、例えば下記の（１）又は（２）より選択される遺伝子発現量である。
（１）配列番号１〜５で表される塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される胆管がん患者もしくは健常体の血清における遺伝子発現量。
（２）配列番号６で表される塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される胆管がん患者もしくは健常体の血清における遺伝子発現量。

以上に示すように、被験体由来の生体試料が胆管がん由来の遺伝子を含むこと及び／又は含まないことを決定又は評価する方法として、判別式の作成には、学習セットから作成した判別式が必要であり、当該判別式の判別精度を上げるためには、学習セット中の２群間に明確な差がある遺伝子を判別式に用いることが必要である。

また、判別式の説明変数に用いる遺伝子の決定は、次のように行うことが好ましい。まず、学習セットである、胆管がん患者群の網羅的遺伝子発現量と健常体群の網羅的遺伝子発現量をデータセットとし、パラメトリック解析であるｔ検定のＰ値、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定のＰ値、又はＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のＰ値などを利用して、当該２群間における各遺伝子の発現量の差の大きさを求める。

検定によって得られたＰ値の危険率（有意水準）が例えば５％、１％又は０．０１％より小さい場合に統計学的に有意とみなすことができる。

検定を繰り返し行うことに起因する第一種の過誤の確率の増大を補正するために公知の方法、例えばボンフェローニ、ホルムなどの方法によって補正することができる（例えば、永田靖ら著、「統計的多重比較法の基礎」、サイエンティスト社（２００７年））。ボンフェローニ補正を例示すると、例えば検定によって得られたＰ値を検定の繰り返し回数、即ち、解析に用いる遺伝子数で乗じ、所望の有意水準と比較することにより検定全体での第一種の過誤を生じる確率を抑制できる。

また、検定ではなく胆管がん患者群の遺伝子発現量と健常体群の遺伝子発現量の間で、各々の遺伝子発現量の中央値の発現比の絶対値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を算出し、判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。また、胆管がん患者群と健常体群の遺伝子発現量を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＲＯＣ値を基準にして判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。

次に、ここで求めた遺伝子発現量の差が大きい任意の数の遺伝子を用いた判別式を作成し、この判別式に対し、別の独立の胆管がん患者もしくは健常体の遺伝子発現量を説明変数に代入して、この独立の胆管がん患者もしくは健常体について所属する群の判別結果を算出する。最大の判別精度を得る判別式を構築する方法として、例えばＰ値の有意水準を満たした遺伝子のあらゆる組み合わせで判別式を構築する方法や、判別式を作成するために使用する遺伝子を、遺伝子発現量の差の大きい順に一つずつ増やしながら繰り返して評価する方法などがある（Ｆｕｒｅｙ ＴＳ．ら、２０００年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．、１６巻、ｐ９０６−１４）。

また、当該判別式の判別性能（汎化性）の評価には、交差検証を用いることが望ましい。交差検証の一種である「Ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ ｃｒｏｓｓ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＯＣＶ）」（Ｒｏｎ Ｋｏｈａｖｉ、１９９５年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １４ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｉｎｔ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ − Ｖｏｌｕｍｅ ２、ｐ １１３７−１１４３）は、まず全データセットから１つのサンプルのデータをテストセットとして抜き出し、残りを学習セットとする。そして、学習セットを用いて判別式を作成し、当該判別式を用いてテストセットが所属する群を判別する。そして、すべてのサンプルのデータが１回ずつテストデータとして用いられるように反復し、精度・感度・特異度などを算出して判別性能を評価する。

本発明は、胆管がんの診断及び治療に有用な疾患診断用（又は検査用）ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを用いた胆管がんの検出方法、及び当該ポリヌクレオチドを含む胆管がんの検出キットを提供する。特に、既存の腫瘍マーカーＣＥＡ及びＣＡ１９−９による胆管がん診断法を超える精度を示す診断用（又は検査用）遺伝子の選定と診断用（又は検査用）判別式の作成を実施するため、本発明の方法において、例えば、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９によって陰性と判断されたにもかかわらず、造影剤を用いたコンピュータ断層撮影等の精密検査によって最終的に胆管がんが存在することが明らかとなった患者由来の血清中の発現遺伝子と、胆管がんが存在しない患者由来の血清中の発現遺伝子を比較することによって、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９を超える精度を示す、診断用（又は検査用）遺伝子セット及び診断用（又は検査用）判別式を構築できる。

具体的には、以下のようにして、診断用（又は検査用）遺伝子セット及び診断用（又は検査用）判別式を構築することができる。まず、標的核酸となる診断用（又は検査用）遺伝子セット（ポリヌクレオチドのセット）を選択する。配列番号１〜５で表される塩基配列に基づく上記（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドから選択される１〜５種の任意の組み合わせを診断用（又は検査用）遺伝子セットとして用いることができる。または、この１〜５種の任意の組み合わせに、配列番号６で表される塩基配列に基づく上記（ｆ）〜（ｊ）から選択される１種のポリヌクレオチドを更に加えた２〜６種のポリヌクレオチドの組み合わせを診断用（又は検査用）遺伝子セットとすることもできる。次に、選択した診断用（又は検査用）遺伝子セットにおけるポリヌクレオチドの発現量を、胆管がん患者由来であることが予め判明している生体試料と、健常体由来であることが予め判明している生体試料との２群に分けて測定する。ここで得られた発現量の各測定値に対して、上記した統計的手法を適用することにより、診断用（又は検査用）判別式を得ることができる。

以上のようにして得た、特定の診断用（又は検査用）遺伝子セットにおける診断用（又は検査用）判別式を用いて、胆管がんの罹患の有無を診断又は検査したい被験体について、当該診断用（又は検査用）遺伝子セットにおけるポリヌクレオチドの発現量を測定し、その結果を当該診断用（又は検査用）判別式に適用することにより、当該被験体における胆管がん罹患の有無を診断又は検査することができる。診断用（又は検査用）遺伝子セットとして、配列番号１〜５で表される塩基配列に基づく上記１〜５種のポリヌクレオチドの組み合わせ、またはこの１〜５種の任意の組み合わせに、配列番号６で表される塩基配列に基づく１種のポリヌクレオチドを更に加えた２〜６種のポリヌクレオチドの組み合わせを用いた場合、最高９５．７％の精度で診断又は検査することができる。

本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。

[実施例１]
＜試料の採取＞
インフォームドコンセントを得た健常体（Ｎ＝１０）、胆管がん患者（Ｎ＝１３）からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ−ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社）を用いてそれぞれ血清を採取した。

[実施例２]
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出＞
試料として上記の実施例１で得た、計２３検体から得られた血清、それぞれ９００μＬから、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｓａｍｐｌｅ ｋｉｔ（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。

[実施例３]
＜遺伝子発現量の測定＞
試料として上記の実施例２で得た計２３検体に対応するｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） ｍｉＲＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコール（ｖｅｒ２．２０）に基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標） Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行い、欠損値は各ＤＮＡチップにおける遺伝子発現量の最小値の対数値から０．１を減算した値で置換した。その結果、胆管がん患者１３例及び健常体１０例に対する、網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。

[実施例４]
＜判別式作成に用いる遺伝子の選定と判別性能の評価方法＞
上記の実施例３で得た胆管がん患者１３検体、もしくは健常体１０検体の合計２３検体の血清由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡから検出されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を、Ｒ言語３．０．１（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ （２０１３）． Ｒ： Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ． Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．）及びｅ１０７１パッケージ１．６−１（Ｅｖｇｅｎｉａ Ｄｉｍｉｔｒｉａｄｏｕ， Ｋｕｒｔ Ｈｏｒｎｉｋ， Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ Ｌｅｉｓｃｈ， Ｄａｖｉｄ Ｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｒｅａｓ Ｗｅｉｎｇｅｓｓｅｌ （２０１１）．， ＴＵ Ｗｉｅｎ． Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．６．）を用いて胆管がん患者群と健常体群で比較して、胆管がん判別用遺伝子を決定し、その遺伝子を用いた場合の胆管がん患者もしくは健常体の判別結果を算出した。すなわち、まず上記の実施例３で得た１３検体の胆管がん患者群と１０検体の健常体群を、ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎで正規化し、１３検体の胆管がん患者群と１０検体の健常体群のいずれかにおいて８０％以上の検体で２の６乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを選択した。胆管がん患者群と健常体群の各々の遺伝子発現量について、等分散を仮定した両側ｔ検定によってＰ値を算出し、ボンフェローニ補正を行い、ｐ＜０．０１を満たす遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した。また、胆管がん患者群と健常体群の各々の遺伝子発現量について、中央値の発現比の絶対値（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を算出し、ｌｏｇ２−ｓｃａｌｅで２群の差が１．５以上の遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した。また、ＡＵＲＯＣ値が０．８以上の遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した（表１）。このようにして、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ遺伝子、これらに関連する配列番号１〜６の塩基配列を見出した。次に、これらの遺伝子の発現量を指標として、胆管がんの有無を判別する判別式を作成して判別性能を評価した。すなわち、選択された６種の遺伝子の中で、配列番号１〜５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ以上含む組み合わせを式１〜３、５、６に入力し、ＬＯＯＣＶによってそれぞれの診断用判別式の精度、感度及び特異度を算出した。

[実施例５]
＜判別分析の結果（１） フィッシャーの判別分析＞
胆管がん患者１３検体の血清と健常体１０検体の血清の配列番号１〜６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号１〜５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ以上含む測定値の組み合わせで、胆管がんの存在の有無をフィッシャーの判別分析によって判別し、ＬＯＯＣＶで汎化性の評価を行った。「配列番号４」又は「配列番号２＋５」又は「配列番号４＋５」又は「配列番号４＋６」又は「配列番号１＋２＋５」又は「配列番号１＋４＋５」又は「配列番号２＋４＋５」又は「配列番号２＋５＋６」又は「配列番号４＋５＋６」又は「配列番号１＋２＋４＋５」又は「配列番号２＋３＋４＋５」又は「配列番号２＋４＋５＋６」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が９１．３％、感度が９２．３％、特異度が９０％となり、精度及び感度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した（表２）。一方、「配列番号３」又は「配列番号２＋３」又は「配列番号３＋４」又は「配列番号３＋５」又は「配列番号３＋６」又は「配列番号１＋３＋５」又は「配列番号２＋３＋４」又は「配列番号３＋４＋６」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が９１．３％、感度が８４．６％、特異度が１００％となり、精度及び特異度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した（表２）。

また、全検体を用いて同様の解析を行った場合の判別式係数と定数項の計算結果を表３に示した。この結果を元にして、ｘ軸に健常体と胆管がん患者を群ごとに分け、ｙ軸に「配列番号４」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値をプロットし、判別式を２次元平面上に図示すると図２のようになる。同様に、ｘ軸に配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値、ｙ軸に配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値をプロットし、「配列番号２＋５」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせについて発現量を測定した時の判別式を２次元平面上に図示すると図３のようになる。これらの判別式は未知検体を判別する際の判別式として用いることができ、高い判別性能を示すことが期待される。

[実施例６]
＜判別分析の結果（２） マハラノビス距離の判別分析＞
胆管がん患者１３検体の血清と健常体１０検体の血清の配列番号１〜６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号１〜５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ以上含む測定値の組み合わせで、マハラノビス距離の判別分析を行い、ＬＯＯＣＶで汎化性の評価を行った。

「配列番号１＋３」又は「配列番号４＋６」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に、精度が９１．３％、感度が１００％、特異度が８０％となり、精度と感度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した。一方、「配列番号４」又は「配列番号２＋５」又は「配列番号３＋６」又は「配列番号２＋４＋５」又は「配列番号２＋４＋６」又は「配列番号２＋５＋６」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が９１．３％、感度が９２．３％、特異度が９０％となり、精度と特異度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した（表４）。

「配列番号１＋３」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせで全検体に対してマハラノビス距離の判別分析を行い、ｘ軸に配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値、ｙ軸に配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値をプロットし、判別式を２次元平面上に図示すると図４のようになる。同様に、ｘ軸に健常体と胆管がん患者を群ごとに分け、ｙ軸に「配列番号４」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの測定値をプロットし、全検体に対してマハラノビス距離の判別分析を行い、判別式を２次元平面上に図示すると図５のようになる。これらの判別式は未知検体を判別する際の判別式として用いることができ、高い判別性能を示すことが期待される。

[実施例７]
＜判別分析の結果（３） ＳＶＭの判別分析＞
ＳＶＭはＡ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｈ−Ｗｅｉ Ｈｓｕら、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｉｅ．ｎｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／〜ｃｊｌｉｎ／ｐａｐｅｒｓ／ｇｕｉｄｅ／ｇｕｉｄｅ．ｐｄｆ）に従いＣ−ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｃ−ＳＶＣ）及びＲＢＦ ｋｅｒｎｅｌを使用した。胆管がん患者１３検体の血清と健常体１０検体の血清の配列番号１〜６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号１〜５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ以上含む測定値の組み合わせでＳＶＭを行い、ＬＯＯＣＶで汎化性の評価を行ったところ、「配列番号１＋３」又は「配列番号３＋４」又は「配列番号１＋２＋３」又は「配列番号１＋２＋６」又は「配列番号１＋３＋４」又は「配列番号１＋３＋５」又は「配列番号２＋３＋４」又は「配列番号３＋４＋５」又は「配列番号１＋２＋３＋４」又は「配列番号１＋２＋３＋５」又は「配列番号１＋３＋４＋５」又は「配列番号１＋３＋４＋６」又は「配列番号１＋３＋５＋６」又は「配列番号１＋３＋４＋５＋６」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が９５．７％、感度が９２．３％、特異度が１００％となり、精度と感度と特異度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した（表５）。

「配列番号１＋３」又は「配列番号３＋４」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの組み合わせについて、全検体を用いて判別式を作成した場合の式５の係数及び変数を表６−１及び表６−２にまとめた。これらの数値は未知検体を判別する際の判別式として用いることができ、高い判別性能を示すことが期待される。

[比較例１]
＜既存の胆管がんマーカーとの比較＞
臨床現場で一般的に異常値とみなされるＣＥＡ ５ｎｇ／ｍＬ以上又はＣＡ１９−９ ３７Ｕ／ｍＬ以上を示した検体を胆管がん患者とみなすと、今回用いた検体においてはＣＥＡの感度は７．７％、ＣＡ１９−９の感度は４６．２％しかなく、いずれのマーカーも胆管がんの検出には有用でないことが分かる（表７）。

一方、上記の実施例５の表２、及び実施例６の表４、及び実施例７の表５において、最も低い感度を示したのは、表２の「配列番号１」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合であり、その値は６９．２％であった。これはＣＡ１９−９の感度を２０％以上も上回っていることから、配列番号１〜５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組み合わせは、解析手法に依存せずに既存の胆管がんマーカー以上の感度を示すことになり、優れた診断マーカーであるといえる。

以上の実施例、比較例に示すように、本発明のキット及び方法によれば、既存の腫瘍マーカーよりも胆管がんを感度よく検出できるので、外科手術によるがん部の切除実施の早期判断が可能となり、その結果、５年生存率の向上や、再発率を低くすることが可能となる。

本発明により、簡易かつ安価な方法で、胆管がんを効果的に検出することができるため、胆管がんの早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて胆管がんを低侵襲的に検出できるため、胆管がんを簡便かつ迅速に検出することが可能になる。

Claims (14)

1. ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐから選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを含む、胆管がんの検出用キット。
2. ｍｉＲ−２０４−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０がｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５がｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、及びｍｉＲ−５００１−５ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐである、請求項１に記載のキット。
3. 前記核酸プローブが、下記の（ｃ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
   （ｃ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｄ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
   （ｅ）下記（ｅ１）及び（ｅ２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、当該（ｅ１）及び（ｅ２）のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド：
   （ｅ１）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｅ２）配列番号１〜５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
   からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のキット。
4. 前記核酸プローブに加えて、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
5. ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐである、請求項４に記載のキット。
6. 前記のさらに含む核酸プローブが、下記の（ｈ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
   （ｈ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｉ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
   （ｊ）下記（ｊ１）及び（ｊ２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、当該（ｊ１）及び（ｊ２）のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、
   （ｊ１）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｊ２）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
   からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項４又は５に記載のキット。
7. ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５及びｍｉＲ−５００１−５ｐから選択される少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを用いて、被験体の生体試料における標的核酸の発現量を測定し、該発現量を用いて被験体が胆管がんに罹患していること、又は胆管がんに罹患していないことをｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することを含む、胆管がんの検出方法。
8. ｍｉＲ−２０４−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−３６７８−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｍｉＲ−７６０がｈｓａ−ｍｉＲ−７６０、ｍｉＲ−４６７５がｈｓａ−ｍｉＲ−４６７５、及びｍｉＲ−５００１−５ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−５００１−５ｐである、請求項７に記載の方法。
9. 前記核酸プローブが、下記の（ｃ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド：
   （ｃ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｄ）配列番号１〜５で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
   （ｅ）下記（ｅ１）及び（ｅ２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、当該（ｅ１）及び（ｅ２）のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、
   （ｅ１）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
   （ｅ２）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
   からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記核酸プローブに加えて、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに用いる、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐがｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記のさらに含む核酸プローブが、下記の（ｈ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド：
    （ｈ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｉ）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
    （ｊ）下記（ｊ１）及び（ｊ２）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、当該（ｊ１）及び（ｊ２）のいずれかのポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、
    （ｊ１）配列番号６で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
    （ｊ２）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記被験体が、ヒトである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記生体試料が、血液、血清又は血漿である、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。

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