JP2015139440A - 胆管がんの検出キット及び検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
(1)miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pから選択される少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを含む、胆管がんの検出用キット。
(2)miR−204−3pがhsa−miR−204−3p、miR−3678−3pがhsa−miR−3678−3p、miR−760がhsa−miR−760、miR−4675がhsa−miR−4675、miR−5001−5pがhsa−miR−5001−5pである、(1)に記載のキット。
(3)前記核酸プローブが、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、(1)又は(2)に記載のキット。
(4)前記核酸プローブに、miR−135a−3pのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、(1)〜(3)のいずれかに記載のキット。
(5)miR−135a−3pがhsa−miR−135a−3pである、(4)に記載のキット。
(6)前記のさらに含む核酸プローブが、下記の(f)〜(j)に示すポリヌクレオチド:
(f)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、(4)又は(5)に記載のキット。
(7)miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pから選択される少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを用いて、被験体の生体試料における標的核酸の発現量を測定し、該発現量を用いて被験体が胆管がんに罹患していること、又は胆管がんに罹患していないことをin vitroで判定することを含む、胆管がんの検出方法。
(8)miR−204−3pがhsa−miR−204−3p、miR−3678−3pがhsa−miR−3678−3p、miR−760がhsa−miR−760、miR−4675がhsa−miR−4675、miR−5001−5pがhsa−miR−5001−5pである、(7)に記載の方法。
(9)前記核酸プローブが、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、(7)又は(8)に記載の方法。
(10)前記核酸プローブに、miR−135a−3pのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、(7)〜(9)のいずれかに記載の方法。
(11)miR−135a−3pがhsa−miR−135a−3pである、(10)に記載の方法。
(12)前記のさらに含む核酸プローブが、下記の(f)〜(j)に示すポリヌクレオチド:
(f)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、(10)又は(11)に記載の方法。
(13)前記被験体が、ヒトである、(7)〜(12)のいずれかに記載の方法。
(14)前記生体試料が、血液、血清又は血漿である、(7)〜(13)のいずれかに記載の方法。
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、DNA、RNAなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(日本国特許庁編)及び当技術分野における慣用に従うものとする。
1.胆管がんの標的核酸
本発明の上記定義の胆管がん検出用の核酸プローブ又はプライマーを使用して、胆管がん又は胆管がん細胞の存在及び/又は不存在を検出するための、胆管がんマーカーとしての主要な標的核酸には、miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pからなる群から選択される少なくとも1つ以上のmiRNAが含まれる。さらにこれらのmiRNAと組み合わせることができる他の胆管がんマーカー、すなわち、miR−135a−3pのmiRNAも標的核酸として好ましく用いることができる。
本発明において、胆管がんを検出するための、あるいは胆管がんを診断するために使用可能な核酸プローブ又はプライマーは、胆管がんの標的核酸としての、ヒト由来の、hsa−miR−204−3p、hsa−miR−3678−3p、hsa−miR−760、hsa−miR−4675、hsa−miR−5001−5p、あるいはそれらの組み合わせ、並びに、それらと場合により組み合わせることができる、hsa−miR−135a−3p、あるいはそれらの組み合わせ、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現量又は存在量を定性的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
(a)配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーはさらに、上記のポリヌクレオチド(a)〜(e)から選択される少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドの他に、下記の(f)〜(j)に示すポリヌクレオチドを含むことができる。
(f)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明はまた、本発明において核酸プローブ又はプライマーとして使用可能なポリヌクレオチド(これには、変異体、断片、又は誘導体を含みうる。)の1つ又は複数を含む胆管がん検出用キットを提供する。
(1)配列番号1〜5で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、15以上の連続した塩基を含むDNA。
(2)配列番号6で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、15以上の連続した塩基を含むDNA。
本発明はさらに、上記3.で説明した本発明のキット(本発明で使用可能な上記の核酸プローブ及び/又はプライマーを含む。)を用いて、生体試料(検体試料)中の、miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pで表される胆管がん由来の遺伝子の発現量、並びに場合により、miR−135a−3pで表される胆管がん由来の遺伝子の発現量、をin vitroで測定し、さらに、胆管がんの罹患が疑われる被験体と、健常体(非胆管がん患者を含む)とから採取した血液、血清、血漿等の生体試料を用いて、試料中の上記遺伝子の発現量を比較して、当該生体試料中の標的核酸の発現量に差がある場合、被験体が胆管がんに罹患していると評価することを含む、in vitroでの胆管がんの検出方法を提供する。
(a)被験体由来の生体試料を、in vitroで、本発明のキットのポリヌクレオチドと接触させるステップ、
(b)生体試料中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブ又はプライマーとして用いて測定するステップ、
(c)(b)の結果をもとに、当該被験体中の胆管がん(細胞)の存在又は不存在を評価するステップ、
を含むことができる。
(a)配列番号1〜5で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される。
具体的には、miR−135a−3pがhsa−miR−135a−3pである。
(f)配列番号6で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。
本発明の方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じてステップを変更することができる。
(a)被験体の生体試料から調製されたRNA又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド(cDNA)を、本発明のキットのポリヌクレオチドと結合させるステップ、
(b)当該ポリヌクレオチドに結合した生体試料由来のRNA又は当該RNAから合成されたcDNAを、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、あるいは、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる定量RT−PCRによって測定するステップ、
(c)上記(b)の測定結果に基づいて、胆管がん(由来の遺伝子)の存在又は不存在を評価するステップ、
を含むことができる。
(a)胆管がん患者由来の胆管がん由来遺伝子を含む組織及び/又は健常体由来の胆管がん由来遺伝子を含まない組織であることが既に知られている生体試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による検出用ポリヌクレオチド、キット又はDNAチップを用いて測定するステップ、
(b)(a)で測定された発現量の測定値から、上記の式1〜3、5及び6の判別式を作成するステップ、
(c)被験体由来の生体試料中の当該標的遺伝子の発現量を、本発明による診断(検出)用ポリヌクレオチド、キット又はDNAチップを用いて測定し、(b)で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて生体試料が胆管がん由来遺伝子を含むこと及び/又は含まないことを決定又は評価するステップ、
を含むことができる。ここで、式1〜3、5及び6の式中のxは説明変数であり、上記2節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を測定することによって得られる値を含み、具体的には本発明の胆管がん患者と健常体を判別するための説明変数は、例えば下記の(1)又は(2)より選択される遺伝子発現量である。
(1)配列番号1〜5で表される塩基配列又はその相補的配列において、15以上の連続した塩基を含むDNAのいずれかによって測定される胆管がん患者もしくは健常体の血清における遺伝子発現量。
(2)配列番号6で表される塩基配列又はその相補的配列において、15以上の連続した塩基を含むDNAのいずれかによって測定される胆管がん患者もしくは健常体の血清における遺伝子発現量。
<試料の採取>
インフォームドコンセントを得た健常体(N=10)、胆管がん患者(N=13)からベノジェクトII真空採血管VP−AS109K60(テルモ株式会社)を用いてそれぞれ血清を採取した。
<totalRNAの抽出>
試料として上記の実施例1で得た、計23検体から得られた血清、それぞれ900μLから、3D−Gene(登録商標)RNA extraction reagent from liquid sample kit(東レ株式会社)中のRNA抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従ってtotal RNAを得た。
<遺伝子発現量の測定>
試料として上記の実施例2で得た計23検体に対応するtotal RNAに対して、3D−Gene(登録商標) miRNA Labeling kit(東レ株式会社)を用いて同社が定めるプロトコール(ver2.20)に基づいてmiRNAを蛍光標識した。オリゴDNAチップとして、3D−Gene(登録商標) Human miRNA Oligo chip(東レ株式会社)を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。DNAチップを3D−Gene(登録商標)スキャナー(東レ株式会社)を用いてスキャンし、画像を取得して3D−Gene(登録商標)Extraction(東レ株式会社)にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が2の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行い、欠損値は各DNAチップにおける遺伝子発現量の最小値の対数値から0.1を減算した値で置換した。その結果、胆管がん患者13例及び健常体10例に対する、網羅的なmiRNAの遺伝子発現量を得た。
<判別式作成に用いる遺伝子の選定と判別性能の評価方法>
上記の実施例3で得た胆管がん患者13検体、もしくは健常体10検体の合計23検体の血清由来のtotal RNAから検出されたmiRNAの遺伝子発現量を、R言語3.0.1(R Development Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, URL http://www.R−project.org/.)及びe1071パッケージ1.6−1(Evgenia Dimitriadou, Kurt Hornik, Friedrich Leisch, David Meyer and Andreas Weingessel (2011)., TU Wien. R package version 1.6.)を用いて胆管がん患者群と健常体群で比較して、胆管がん判別用遺伝子を決定し、その遺伝子を用いた場合の胆管がん患者もしくは健常体の判別結果を算出した。すなわち、まず上記の実施例3で得た13検体の胆管がん患者群と10検体の健常体群を、quantile normalizationで正規化し、13検体の胆管がん患者群と10検体の健常体群のいずれかにおいて80%以上の検体で2の6乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを選択した。胆管がん患者群と健常体群の各々の遺伝子発現量について、等分散を仮定した両側t検定によってP値を算出し、ボンフェローニ補正を行い、p<0.01を満たす遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した。また、胆管がん患者群と健常体群の各々の遺伝子発現量について、中央値の発現比の絶対値(Fold change)を算出し、log2−scaleで2群の差が1.5以上の遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した。また、AUROC値が0.8以上の遺伝子を判別式の説明変数に用いる遺伝子として選択した(表1)。このようにして、hsa−miR−204−3p、hsa−miR−3678−3p、hsa−miR−760、hsa−miR−4675、hsa−miR−5001−5p及びhsa−miR−135a−3p遺伝子、これらに関連する配列番号1〜6の塩基配列を見出した。次に、これらの遺伝子の発現量を指標として、胆管がんの有無を判別する判別式を作成して判別性能を評価した。すなわち、選択された6種の遺伝子の中で、配列番号1〜5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも1つ以上含む組み合わせを式1〜3、5、6に入力し、LOOCVによってそれぞれの診断用判別式の精度、感度及び特異度を算出した。
<判別分析の結果(1) フィッシャーの判別分析>
胆管がん患者13検体の血清と健常体10検体の血清の配列番号1〜6で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号1〜5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも1つ以上含む測定値の組み合わせで、胆管がんの存在の有無をフィッシャーの判別分析によって判別し、LOOCVで汎化性の評価を行った。「配列番号4」又は「配列番号2+5」又は「配列番号4+5」又は「配列番号4+6」又は「配列番号1+2+5」又は「配列番号1+4+5」又は「配列番号2+4+5」又は「配列番号2+5+6」又は「配列番号4+5+6」又は「配列番号1+2+4+5」又は「配列番号2+3+4+5」又は「配列番号2+4+5+6」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が91.3%、感度が92.3%、特異度が90%となり、精度及び感度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した(表2)。一方、「配列番号3」又は「配列番号2+3」又は「配列番号3+4」又は「配列番号3+5」又は「配列番号3+6」又は「配列番号1+3+5」又は「配列番号2+3+4」又は「配列番号3+4+6」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が91.3%、感度が84.6%、特異度が100%となり、精度及び特異度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した(表2)。
<判別分析の結果(2) マハラノビス距離の判別分析>
胆管がん患者13検体の血清と健常体10検体の血清の配列番号1〜6で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号1〜5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも1つ以上含む測定値の組み合わせで、マハラノビス距離の判別分析を行い、LOOCVで汎化性の評価を行った。
<判別分析の結果(3) SVMの判別分析>
SVMはA Practical Guide to Support Vector Classification(Chih−Wei Hsuら、http://www.csie.ntu.edu.tw/〜cjlin/papers/guide/guide.pdf)に従いC−support vector classification(C−SVC)及びRBF kernelを使用した。胆管がん患者13検体の血清と健常体10検体の血清の配列番号1〜6で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの中で、配列番号1〜5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも1つ以上含む測定値の組み合わせでSVMを行い、LOOCVで汎化性の評価を行ったところ、「配列番号1+3」又は「配列番号3+4」又は「配列番号1+2+3」又は「配列番号1+2+6」又は「配列番号1+3+4」又は「配列番号1+3+5」又は「配列番号2+3+4」又は「配列番号3+4+5」又は「配列番号1+2+3+4」又は「配列番号1+2+3+5」又は「配列番号1+3+4+5」又は「配列番号1+3+4+6」又は「配列番号1+3+5+6」又は「配列番号1+3+4+5+6」のそれぞれの組み合わせで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的核酸として用いた場合に精度が95.7%、感度が92.3%、特異度が100%となり、精度と感度と特異度が最高になる遺伝子セットとなることを見出した(表5)。
<既存の胆管がんマーカーとの比較>
臨床現場で一般的に異常値とみなされるCEA 5ng/mL以上又はCA19−9 37U/mL以上を示した検体を胆管がん患者とみなすと、今回用いた検体においてはCEAの感度は7.7%、CA19−9の感度は46.2%しかなく、いずれのマーカーも胆管がんの検出には有用でないことが分かる(表7)。
Claims (14)
- miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pから選択される少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを含む、胆管がんの検出用キット。
- miR−204−3pがhsa−miR−204−3p、miR−3678−3pがhsa−miR−3678−3p、miR−760がhsa−miR−760、miR−4675がhsa−miR−4675、miR−5001−5pがhsa−miR−5001−5pである、請求項1に記載のキット。
- 前記核酸プローブが、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のキット。 - 前記核酸プローブに、miR−135a−3pのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のキット。
- miR−135a−3pがhsa−miR−135a−3pである、請求項4に記載のキット。
- 前記のさらに含む核酸プローブが、下記の(f)〜(j)に示すポリヌクレオチド:
(f)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項4又は5に記載のキット。 - miR−204−3p、miR−3678−3p、miR−760、miR−4675及びmiR−5001−5pから選択される少なくとも1つ以上のポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブを用いて、被験体の生体試料における標的核酸の発現量を測定し、該発現量を用いて被験体が胆管がんに罹患していること、又は胆管がんに罹患していないことをin vitroで判定することを含む、胆管がんの検出方法。
- miR−204−3pがhsa−miR−204−3p、miR−3678−3pがhsa−miR−3678−3p、miR−760がhsa−miR−760、miR−4675がhsa−miR−4675、miR−5001−5pがhsa−miR−5001−5pである、請求項7に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、下記の(a)〜(e)に示すポリヌクレオチド:
(a)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(b)配列番号1〜5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(c)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(d)配列番号1〜5で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(e)前記(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される、請求項7又は8に記載の方法。 - 前記核酸プローブに、miR−135a−3pのポリヌクレオチドと特異的に結合可能な核酸プローブをさらに含む、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- miR−135a−3pがhsa−miR−135a−3pである、請求項10に記載の方法。
- 前記のさらに含む核酸プローブが、下記の(f)〜(j)に示すポリヌクレオチド:
(f)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(g)配列番号6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(h)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、又は15以上の連続した塩基を含むその断片、
(i)配列番号6で表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてuがtである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
(j)前記(f)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項10又は11に記載の方法。 - 前記被験体が、ヒトである、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、血清又は血漿である、請求項7〜13のいずれか1項に記載の方法。
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