CN106636077B - 一种胆管癌microRNA检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种胆管癌microRNA检测试剂盒，用于解决现有胆管癌microRNA检测试剂盒稳定性差、重复性弱、特异性低、容易出现假阳性的问题。本发明提供了一种胆管癌microRNA检测试剂盒，包括一种探针组合物，所述探针组合物包括：与靶标microRNA结合捕获探针以及信号放大组合物，所述靶标microRNA选自has‑miR‑CCA、hsa‑miR‑204‑5p、hsa‑miR‑320a、hsa‑miR‑200b‑3p、hsa‑miR‑200a‑3p、hsa‑miR‑200c‑3p、hsa‑miR‑141‑3p、hsa‑miR‑429、hsa‑miR‑125a‑5p、hsa‑miR‑31‑5p、hsa‑miR‑142‑3p以及hsa‑miR‑27a‑3p中的一种或多种。本发明制得的一种胆管癌microRNA检测试剂盒具有稳定性好、重复性好、特异性高、不容易出现假阳性以及灵敏度高的优点。

Description

一种胆管癌microRNA检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种胆管癌microRNA检测试剂盒。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明，miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。近年来发现，部分miRNA的异常表达与多种疾病的发生和发展密切相关，如：miRNA的异常表达与胆管癌的发生和发展密切相关，多种miRNA在胆管癌细胞或组织中表达水平有不同程度的上调或下调。胆管癌是一种来源与肝内或肝外胆管上皮的恶性肿瘤，过去曾被认为是少见病，但近年来随着诊断技术的发展，胆管癌的发病率仅次于肝癌，胆管癌预后会很差，在全部癌症死者中占2.88％～4.65％，并且已经成为肝内原发肿瘤导致患者死亡的第一位肿瘤。研究表明miR-21在胆管癌中的高表达将抑制PDCD4及TIMP3等抑癌基因的表达，另外也有效地抑制PTEN的表达，而当miR表达受抑制时将导致胆管癌对抗肿瘤药物-吉西他滨敏感度的提高。此外，研究认为miR-200(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)家族可通过抑制ZEBI及ZEB2的表达来增强E-钙粘附蛋白的表达，从而在上皮细胞-间充质转化过程中有着重要作用。最初研究表明let-7a在线虫的发育中起着重要的调节作用，而最新研究发现，在胆管癌组织中let-7a和let-7的表达都下调，从而推测let-7可能在胆管癌的发生发展起到抑癌作用。然而其他研究发现IL-6过表达的胆管癌细胞中let-7的表达上调，由此推断let-7可能具有双重作用的机制。此外，还有多种miRNA在胆管癌的发生发展中也具有调控作用，如miR-29、miR-204、miR-320及miR-370。

目前，针对胆管癌miRNA的检测方法主要有Northern Blot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。然而，上述方法存在着敏感度低、耗时长、准确性低、RNA的用量较大、检测费用昂贵、重复性差等缺点。目前，克服了上述缺点的原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性microRNA序列的方法。然而，现有的原位杂交技术中，针对胆管癌microRNA的多重平行检测所使用的试剂盒仍然存在许多问题，如：稳定性差、重复性弱、特异性低、容易出现假阳性以及灵敏度低的缺点。

因此，研发出一种稳定性好、重复性好、特异性高、不容易出现假阳性以及灵敏度高的一种胆管癌microRNA的检测试剂盒，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种胆管癌miRNA的检测试剂盒，所述检测试剂盒具有稳定性好、重复性好、特异性高、不容易出现假阳性以及灵敏度高的优点。

本发明提供了一种探针组合物，所述探针组合物包括：与靶标microRNA结合捕获探针以及信号放大组合物，所述靶标microRNA选自has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-142-3p以及hsa-miR-27a-3p中的一种或多种。

优选地，所述捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与所述靶标microRNA结合的特异性序列P1、第一间隔臂序列、P2序列，所述P1序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12中的任意一条，所述P2序列为SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24中的任意一条，所述第一间隔臂序列为5～10个T。

优选地，所述信号放大组合物选自：第一信号放大组合物、第二信号放大组合物和第三信号放大组合物的任意一种；所述第一信号放大组合物为一级信号放大探针，所述第一信号放大组合物的3’端还修饰有第一荧光基团，所述第一荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种；所述第二信号放大组合物为一级信号放大探针和二级信号放大探针，所述第二信号放大组合物的3’端还修饰有第二荧光基团，所述第二荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种；所述第三信号放大组合物为一级信号放大探针、二级信号放大探针和三级信号放大探针，所述第三信号放大组合物的3’端还修饰有第三荧光基团，所述第三荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种。

优选地，所述一级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P4序列、第二间隔臂序列、与所述P2序列反向互补结合的P3序列；所述P4序列为SEQ ID NO.25～SEQ IDNO.36中的任意一条，所述第二间隔臂序列为5～10个T。

优选地，所述二级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P5序列、第三间隔臂序列、P6序列，所述P5序列含有一个或以上与所述P4序列反向互补的碱基序列；所述P5序列为SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.48中的任意一条，所述P6序列为SEQ ID NO.49～SEQ IDNO.60中的任意一条，所述第三间隔臂序列为5～10个T。

优选地，所述三级信号大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P8序列、第四间隔臂序列、P7序列，所述P7序列含有一个或以上与所述P5序列反向互补的碱基序列；所述P7序列为SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.72中的任意一条，所述P8序列为5个碱基的polyT序列，所述第四间隔臂序列为5～10个T。

优选地，所述P1序列、P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列和P8序列内部不存在发夹结构。

优选地，所述第一间隔臂序列、所述第二间隔臂序列和所述第三间隔臂序列、所述第四间隔臂序列中T的数量可以相同也可以不同。

优选地，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团、所述第三荧光基团可以相同，也可以不同。

本发明还提供了一种胆管癌microRNA检测试剂盒，所述胆管癌microRNA检测试剂盒包括以上任意一项所述的探针组分。

综上所述，本发明通过选用在胆管癌中表达异常的microRNA作为靶标，制的一种含有与靶标结合的捕获探针和信号放大组合物的试剂盒，克服了现有胆管癌microRNA的多重平行检测所使用的试剂盒存在稳定性差、重复性弱、特异性低、容易出现假阳性以及灵敏度低的缺点，本发明制得的一种胆管癌microRNA试剂盒具有稳定性好、重复性好、特异性高、不容易出现假阳性以及灵敏度高的优点。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种胆管癌microRNA检测试剂盒，进行具体地描述。

实施例1

本实施例提供了捕获探针的制备方法，本实施例所设计的捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的靶标microRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列。

间隔臂序列可将将捕获探针P2序列与待检测的靶标microRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂序列优选为5个T。

本实施例针对待检测靶标miRNA:has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200c-3p的SEQ ID NO.6、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-27a-3p的SEQID NO.12设计的捕获探针，具体见表1、表2：

表1捕获探针的P1序列

表2捕获探针的P2序列

SEQ ID NO.	P2序列(5’→3’)	SEQ ID NO.	P2序列(5’→3’)
				13	GTCTATAGTG	19	GATGACAGTA
14	GATTCAGTGA	20	AGTACTTGTG
				15	TTGAGTAATG	21	AGTCTTGAAG
16	TGTAATGAGT	22	TGATGAATTG
				17	GATTAGTGAT	23	ATGACGATAG
18	GTAGATTAGT	24	TTGACGTGAA

实施例2

本实施例提供了信号放大组分的制备方法，本实施例所述制备方法得到的信号放大组分选自：第一信号放大组分、第二信号放大组分和第三信号放大组分的任意一种；所述第一信号放大组分包括一级信号放大探针，所述第一信号放大组分的3’端还修饰有荧光基团；所述第二信号放大组分为一级信号放大探针和二级信号放大探针，所述第二信号放大组分的3’端还修饰有荧光基团；所述第三信号放大组分为一级信号放大探针、二级信号放大探针和三级信号放大探针，所述第三信号放大组分的3’端还修饰有荧光基团。

(1)、第一信号放大组分，第一信号放大组分包括一级信号放大探针和修饰在第一信号放大组分3’端的荧光基团，修饰在第一信号放大组分3’端的荧光基团选自Cy3、Cy5以及Alexa Flour 488中的任意一种。

一级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与P2序列反向互补配对结合的P3序列、间隔臂序列、P4序列，一级信号放大探针的间隔臂序列优选为10个T。

本实施例设计的一级信号放大探针的P4序列，具体见表3。

表3一级信号放大探针的P4序列

SEQ ID NO.	P4序列(5’→3’)
		25	GATCTC TTTTT GATCTC TTTTT GATCTC
26	ATATCA TTTTT ATATCA TTTTT ATATCA
		27	TATCTC TTTTT TATCTC TTTTT TATCTC
28	CACATC TTTTT CACATC TTTTT CACATC
		29	TCACAT TTTTT TCACAT TTTTT TCACAT
30	ACATCA TTTTT ACATCA TTTTT ACATCA
		31	CATCGA TTTTT CATCGA TTTTT CATCGA
32	TCAGTC TTTTT TCAGTC TTTTT TCAGTC
		33	ACTCTC TTTTT ACTCTC TTTTT ACTCTC
34	ATCATC TTTTT ATCATC TTTTT ATCATC
		35	ACATCC TTTTT ACATCC TTTTT ACATCC
36	TCACGA TTTTT TCACGA TTTTT TCACGA

(2)、第二信号放大组分，第二信号放大组分包括一级信号放大探针和二级信号放大探针，以及修饰在第二信号放大组分3’端的荧光基团，修饰在第二信号放大组分3’端的荧光基团选自选自Cy3、Cy5以及Alexa Flour 488中的任意一种。

一级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与P2序列反向互补配对结合的P3序列、间隔臂序列、P4序列，一级信号放大探针的间隔臂序列优选为10个T。

二级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列，P5序列含有一个或以上与P4序列反向互补的碱基序列，二级信号放大探针的间隔臂序列优选为6个T。

本实施例设计的二级信号放大探针的P5序列，具体见表4。

表4二级信号放大探针的P5序列

SEQ ID NO.	P5序列(5’→3’)	SEQ ID NO.	P5序列(5’→3’)
				37	GAGATC	43	TCGATG
38	TGATAT	44	GACTGA
				39	GAGATA	45	GAGAGT
40	GATGTG	46	GATGAT
				41	ATGTGA	47	GGATGT
42	TGATGT	48	TCGTGA

本实施例设计的二级信号放大探针的P6序列，具体见表5。

表5二级信号放大探针的P6序列

SEQ ID NO.	P6序列(5’→3’)
		49	TACGATTT TACGATTT TACGA
50	AGTCT TTT AGTCT TTT AGTCT
		51	TAGCA TTT TAGCA TTT TAGCA
52	ACGTA TTT ACGTATTT ACGTA
		53	TGAAC TTT TGAAC TTT TGAAC
54	CATTG TTT CATTGTTT CATTG
		55	TGTCCTTT TGTCC TTT TGTCC
56	CTACG TTT CTACG TTT CTACG
		57	AGCAG TTT AGCAG TTT AGCAG
58	ACGCT TTT ACGCTTTT ACGCT
		59	TCTAG TTT TCTAG TTT TCTAG
60	CTCTA TTT CTCTA TTT CTCTA

(3)、第三信号放大组分，第三信号放大组分包括一级信号放大探针、二级信号放大探针和三级信号放大探针，以及修饰在第三信号放大组分3’端的荧光基团，修饰在第三信号放大组分3’端的荧光基团选自Cy3、Cy5、TET以及Alexa Flour 488中的任意一种。

一级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与P2序列反向互补配对结合的P3序列、间隔臂序列、P4序列，一级信号放大探针的间隔臂序列优选为10个T。

二级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列，P5序列含有一个或以上与P4序列反向互补的碱基序列，二级信号放大探针的间隔臂序列优选为6个T。

三级信号大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，P7序列含有一个或以上与P5序列反向互补的碱基序列，三级信号放大探针的间隔臂序列优选为5个T。

本实施例设计的三级信号放大探针的P7序列，具体见表6。

表6三级信号放大探针的P7序列

SEQ ID NO.	P7序列(5’→3’)	SEQ ID NO.	P7序列(5’→3’)
				61	TCGTA	67	GGACA
62	AGACT	68	CGTAG
				63	TGCTA	69	CTGCT
64	TACGT	70	AGCGT
				65	GTTCA	71	CTAGA
66	CAATG	72	TAGAG

本实施例中，P8序列为5个碱基的polyT序列。

实施例3

本实施例提供了一种胆管癌microRNA检测试剂盒的制备方法，所述胆管癌microRNA检测试剂盒包括：实施例1制得的探针组分和实施例2制得的信号放大组分。

本实施例设计的一种胆管癌microRNA检测试剂盒的组成，具体见表7。

表7一种胆管癌microRNA检测试剂盒

实施例4

本实施例提供了应用实施例3制得的一种胆管癌microRNA检测试剂盒对胆管癌细胞进行检测。本实施例所使用的胆管癌细胞的来源为：胆管癌细胞株RBE(购自ATCC)。

表8提供了本实施例所使用的各种溶液的配方。

表8溶液配方

步骤一：样本预处理，将RBE细胞转移至滤膜

1、取样本保存管中的RBE细胞冻存细胞管从液氮中取出进行复苏，细胞数量1×10^7，待管中细胞融化后，600×g水平离心5min，弃上清，在样本保存管中使用保存液保存血液样本。

2、加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。

3、样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。

4、将滤膜转移至24孔板中，加入400μL 4％甲醛溶液，室温固定1h。

5、去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。

步骤二：透化处理

1、在一块新的24孔板中每孔加入50μL透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。

2、去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。

步骤三：消化细胞，暴露miRNA，使其与捕获探针杂交

1、配制消化酶工作液，取消化酶1.25μL与PBS48.75μL，制得消化酶工作液50μL。

2、消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。

3、将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。

4、去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。

步骤四：探针杂交，探针特异性序列与目标miRNA序列结合

1、捕获探针混合液、探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。

2.配制捕获探针工作液，取捕获探针混合液8μL和探针缓冲液42μL，制得捕获探针工作液50.0μL。捕获探针工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。

3、将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。

4、盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。

5、去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。步骤五、目标mRNA序列信号放大

1、探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。

2、配制探针工作液，取信号放大探针混合液8μL和探针缓冲液42μL制得探针工作液50μl。涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。

3、将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。

4、盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。

5、去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。

步骤六、显色，荧光标记目标信号

1、显色缓冲液(40℃预热)避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。

2、将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色缓冲液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。

3、盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。

4、去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。步骤七、荧光显微镜观察RBE细胞

本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。

1、将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μL抗荧光淬灭封片液(Antifade Mounting Medium)(购自碧云天，货号P0126)，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。

2、通过20倍物镜计数RBE细胞中异性核数量。

3、根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。

4、然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。

5、重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。显微镜使用通道如表9：

表9荧光基团的激发波长和发射波长

步骤八：检测结果及判断分析

1、阳性RBE鉴定标准。在滤膜上，富集有胆管癌细胞，胆管癌细胞阳性的判定标准为：1)具有相应靶标miRNA特异性标识物，在本试剂盒中表现为在相应的荧光通道下显示荧光信号点。2)细胞核DAPI染色阳性。3)胆管癌细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。

2、使用上述检测方法，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个胆管癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体检测结果见表10：

表10样本检测结果

从本实施例得出，实施例3制得的一种胆管癌microRNA试剂盒可以对靶标miRNA进行准确检测。

实施例5

本实施例提供了对于试剂盒的稳定性的检测。

本发明提供的一种胆管癌miRNA检测试剂盒，所述胆管癌miRNA检测试剂盒针对不同的靶标miRNA，选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。

本实施例将使用实施例3的探针组Group1组成的胆管癌miRNA检测试剂盒，对三组不同细胞株来源(购自ATCC)的15种样本(每种细胞株5个样本)中的has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-200b-3p表达情况进行检测，从而评估本发明试剂盒的稳定性。具体分组参阅表11

表11细胞株和检测样本

样本号	胆管癌细胞株	实验组
			样本16～样本20	RBE	Group4
样本21～样本25	TFK-1	Group5
			样本26～样本30	FRH-0201	Group6

本实施例所述探针选自实施例1～3，实验步骤参考实施例4。

检测结果：使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个胆管癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体样本检测结果参阅表12：

表12样本检测结果

从表12检测结果可见，一方面，不同细胞株来源的样本，其检测结果不同，因此，本发明是能够实现不同miRNA表达水平检测的，证明了本发明一种microRNA检测试剂盒稳定性好的优点；另一方面，相同细胞株来源的5个样本，其has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-200b-3p的4个miRNA的荧光点数检测结果相近(±3)，具体见Group4(样本16～20)、Group5(样本21～25)或Group6(样本26～30)，因此，本试剂盒重复性好，具有良好的特异性；由此可见，本发明试剂盒具有稳定性好、重复性好、特异性高的优点。

实施例6

本实施例提供了针队不同数量靶标miRNA的更具有特异性的检测试剂盒。

1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)

本实施例提供一种胆管癌microRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的靶点miRNA，可以选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。

本实施例分别针对1种、3种、5种、7种miRNA，选用捕获探针，信号放大组分选择第三信号放大组分，组成检测试剂盒，对同一细胞株CNE-2Z来源的样本进行检测，对比其检测效果。试剂盒的具体组成参阅表13，所述探针选自实施例1～3，实验步骤参考实施例4。

表13试剂盒各序列内容(表格数字为SEQ ID NO.)

2、使用上述试剂盒，对同一细胞株RBE来源的样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个胆管癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：

表13样本检测结果(荧光信号点数)

通过上述4组实验对比可知，本试剂盒可以针对不同数量的靶标miRNA进行检测，使用1条、3条和5条、7条的针对不同miRNA捕获探针均可完成检测，具有很好的稳定性。

实施例7

本发明提供的一种胆管癌miRNA检测试剂盒，为了评估本发明提供的试剂盒的特异性和不容易出现假阳性，本实施例将使用本发明提供的检测试剂盒，对3种不同肿瘤细胞株(人胆管癌细胞株RBE、人肺癌细胞株SPC-A1以及人胃癌细胞株Hs746T，购自ATCC)以及正常人胆管上皮细胞株HIBEpiC进行检测。本实施例以检测各细胞株(每种细胞株检测5个样本)has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-142-3p表达情况进行检测为例。具体试验安排如表14、15：

表14试剂盒设计

表15细胞株和检测样本

本实施例所述探针选自实施例1～3，实验步骤参考实施例4。

检测结果：使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体样本检测结果见表16：

表16样本检测结果

从表16检测结果可见，一方面，has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-142-3p在胆管癌细胞株和胆管上皮细胞株中的表达情况均不同，且差异显著(详见本实施例实验组11与实验组12的检测结果)；另一方面，has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-31-5p和hsa-miR-142-3p在不同癌症细胞株的表达情况也不尽相同，且部分miRNA的表达情况差异显著(详见本实施例实验组11、13、14)。此处可以清楚的得出，本发明提供的试剂盒具有特异性高和不容易出现假阳性的优点。

实施例8

本发明提供一种胆管癌miRNA检测试剂盒灵敏度的检测。

本实施例以检测人胆管癌细胞株RBE为例，所述的人胆管癌细胞株RBE母液细胞浓度为1×10⁷/mL，将人胆管癌细胞株RBE母液稀释成3个梯度，分别是1×10³/mL、100/mL以及10/mL。

本实施例以及检测has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-200c-3p为例，每个细胞浓度梯度检测5个样品，每个样品取1mL进行检测。具体的试验安排如表17、18：

表17试剂盒设计

表18细胞浓度及检测样本

本实施例所述探针选自实施例1～3，实验步骤参考实施例4。

检测结果：使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光。通过比较检测到靶miRNA细胞数与检测到的细胞数，评价本发明所提供试剂盒的灵敏度。具体样本检测结果见表19(表中数据表示细胞个数)：

表19不同细胞浓度的检测效果

根据上述检测结果发现，本发明所提供的试剂盒对has-miR-CCA、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-200c-3p的检测灵敏度高，且检测结果与实际情况相符。同时，使用本发明所提供的试剂盒检测低密度人胆管癌细胞株RBE(约10个细胞/mL)，检测到靶miRNA细胞数与检测到的细胞数至少90％，甚至达到100％。与现有技术普遍至少需要100个细胞/mL才能达到检测效果相比，可明显得出本发明制得的试剂盒灵敏度明显高于现有技术。针对本发明所提供的其他不同的miRNA及其不同组合的检测，也能实现本实施例的检测效果，具体检测结果省略。可见，本发明所提供的针对胆管癌相关miRNA的检测试剂盒检测灵敏度高。

以上实验内容可以清楚的推知，本发明提供的其他miRNA的组合也同样能实现本实施例的效果，具体实验数据省略。

综上所述，本发明提供的一种胆管癌microRNA的检测试剂盒具有稳定性好、重复性好、特异性高、不容易出现假阳性以及灵敏度高的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括：与靶标microRNA结合捕获探针以及信号放大组合物，所述靶标microRNA选自hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-142-3p以及hsa-miR-27a-3p中的一种或多种；

所述信号放大组合物选自：第二信号放大组合物和第三信号放大组合物中的任意一种；

所述第二信号放大组合物为一级信号放大探针和二级信号放大探针，所述第三信号放大组合物为一级信号放大探针、二级信号放大探针和三级信号放大探针；

所述捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与所述靶标microRNA结合的特异性序列P1、第一间隔臂序列、P2序列，所述P1序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12中的任意一条，所述P2序列为SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24中的任意一条，所述第一间隔臂序列为5～10个T。

2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述第一信号放大组合物的3’端还修饰有第一荧光基团，所述第一荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种；所述第二信号放大组合物的3’端还修饰有第二荧光基团，所述第二荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种；所述第三信号放大组合物的3’端还修饰有第三荧光基团，所述第三荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述一级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P4序列、第二间隔臂序列、与所述P2序列反向互补结合的P3序列；所述P4序列为SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.36中的任意一条，所述第二间隔臂序列为5～10个T。

4.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，所述二级信号放大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P5序列、第三间隔臂序列、P6序列，所述P5序列含有一个或以上与所述P4序列反向互补的碱基序列；所述P5序列为SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.48中的任意一条，所述P6序列为SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.60中的任意一条，所述第三间隔臂序列为5～10个T。

5.根据权利要求4所述的探针组合物，其特征在于，所述三级信号大探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：P8序列、第四间隔臂序列、P7序列，所述P7序列含有一个或以上与所述P5序列反向互补的碱基序列；所述P7序列为SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.72中的任意一条，所述P8序列为5个碱基的polyT序列，所述第四间隔臂序列为5～10个T。

6.根据权利要求5所述的探针组合物，其特征在于，所述P1序列、P2序列、P3序列、P4序列、P5序列、P6序列、P7序列和P8序列内部不存在发夹结构。

7.根据权利要求6所述的探针组合物，其特征在于，所述第一间隔臂序列、所述第二间隔臂序列、所述第三间隔臂序列和所述第四间隔臂序列中T的数量相同或者不同。

8.根据权利要求7所述的探针组合物，其特征在于，所述第一荧光基团、所述第二荧光基团和所述第三荧光基团相同或者不同。

9.一种胆管癌microRNA检测试剂盒，其特征在于，所述胆管癌microRNA检测试剂盒包括权利要求1至8任意一项所述的探针组分。