CN104031993A - 循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒以及方法，所述鉴定试剂盒包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。本发明所述鉴定方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种循环肿瘤细胞(CTCs)特异性基因，并将其分型为I型(上皮型)、II型(上皮-间质混合型)及III型(间质型)，降低CTCs在进入外周血循环的过程中因缺失部分CTCs特异性基因而导致的假阳性结果。本发明鉴定方法能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。

Description

循环肿瘤细胞鉴定试剂盒和方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒以及方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)为进入人体外周血的肿瘤细胞，可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来研究表明，肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中可能发生上皮-间质转变(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，EMT过程中，除了细胞形态和移动性发生改变外，细胞基因表达谱特别是上皮、间质分子标志物及其转录因子的表达也发生改变，发生EMT的肿瘤细胞间黏附改变，迁移和侵袭能力增强，脱离原发灶后进入血液形成循环肿瘤细胞。目前，根据CTCs抗原标志物的差异，可将CTCs分为上皮标志物阳性表型(简称上皮细胞型)、上皮与间质混合表型(简称上皮-间质细胞型)和间质标志物阳性表型(简称间质细胞型)等。最新研究表明，间质标志物阳性表型的CTM具有最强的转移潜能。
目前，多数CTCs检测方法都是以肿瘤细胞表面的上皮细胞标志物为靶点，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)，用相应的抗体捕获CTCs，以细胞表达CKs作为主要诊断依据，这类方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮细胞特异性。其中，代表性检测方法是目前唯一通过美国FDA批准进行临床应用的CellSearch系统。由于外周血中可能存在一定数量的非肿瘤性上皮细胞，以及采血可能造成正常上皮细胞污染血样，加上一些CTCs由于发生EMT丢失了上皮抗原而无法被检测到，从而导致假阳性和假阴性的检测结果，此外，免疫磁性分选(MACS)技术联合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法也是常用的CTC分离与鉴定的技术，但是RT-PCR过程对环境和操作的要求高，且mRNA容易降解，无法进行CTC细胞分型等缺点，因此，急需一种能够准确检测CTCs的技术，实现CTCs的的鉴定与精确分型的新技术。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能分型、灵敏度高的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，使用白细胞标志基因，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰。
在其中一个实施例中，所述检测探针包括：
(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(2)针对每个标志基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
在其中一个实施例中，所述检测探针包括：
(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的特异性序列P3互补配对的P2序列，所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(2)针对每个标志基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3)针对每种种类的标记探针：所述标记探针具有与扩增探针P4互补配对的序列P5，且末端修饰有荧光基团；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
本发明的另一目的在于提供一种循环肿瘤细胞鉴定方法。
实现上述目的的技术方案如下。
一种循环肿瘤细胞鉴定方法，主要包括以下步骤：
(1)得到去除红细胞后的生物体液样本；
(2)过滤，在滤膜上富集循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露；
(3)检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
在其中一个实施例中，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列P1与对因的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)通过荧光检测仪检测。
在其中一个实施例中，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列P1与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；
(3.4)通过荧光检测仪检测。
在其中一个实施例中，针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.21～SEQ IDNO.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.41～SEQ IDNO.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ IDNO.101；针对上皮细胞标志基因的P3序列为SEQ ID NO.104；针对上皮种类标志基因的P4序列为SEQ ID NO.107。
在其中一个实施例中，针对CDH2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ IDNO.60中的2条或2条以上，针对VIMENTIN基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ IDNO.70中的2条或2条以上，针对FN1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.102；针对间质细胞标志基因的P3序列为SEQ ID NO.105，针对间质细胞标志基因的P4序列为SEQID NO.108。
在其中一个实施例中，还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，针对CD45基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.103，针对白细胞标志种类基因的P3序列为SEQ ID NO.106，针对白细胞标志基因的P4序列为SEQ IDNO.109。
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor488，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所选择的上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明标志基因的选取，除了能实现单个标志基因的检测外，更与其它标志基因一起使用，从而能够最全面地检测出循环肿瘤细胞，并区分其细胞类型，解决了循环肿瘤细胞个体之间由于某些标志基因表达水平的差异而造成假阴性，极大地提高检测的灵敏度。
(2)本发明所述鉴定试剂盒和方法采用多重RNA探针，能够同时标记多种CTCs特异性基因，并将其分型为I型(上皮型)、II型(上皮-间质混合型)及III型(间质型)，降低CTCs在进入外周血循环的过程中因缺失部分CTCs特异性基因而导致的假阳性结果。
(3)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。
(4)本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
(5)本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
附图说明
图1是本发明阳性CTC鉴定结果示意图；
图2是本发明阳性CTC分型结果示意图；
图3是实施例4的比较上皮型CTCs的信号标记效果的示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，有两种类型，具有标记探针的与不具有标记探针。
其中，具有标记探针的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒A，主要包括有：
一、捕获探针
捕获探针由三部分组成，5’端至3’依次是与对应的标志基因的mRNA互补配对的序列P1，间隔臂序列，与对应的扩增探针特异性序列P3互补配对的P2序列，同一类别的标志基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。每个标志基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(使用时，针对每种目标基因，选择2条或3条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例6)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的标志基因的捕获探针见表1、不同类型的标志基因的捕获探针的P2序列见表2。
表1目标基因捕获探针的P1序列
表2标志基因捕获探针的P2序列
二、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2互补配对的特异性序列P3，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的序列P4(如不运用标记探针检测时，则P4序列的3’端修饰有荧光基团)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增延伸探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。
标志基因的扩增探针的特异性序列P3见表3。所述P4的设计按照本领域的探针设计的公知常识，其为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列，本实施例P4序列优选的碱基组成见表4。
表3目标基因的扩增探针的P3序列
表4目标基因的扩增探针的P4序列
三、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补结合的序列P5，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。(当检测体系中使用标记探针时，扩增探针的P4序列3’端不带有荧光基团标记，而由标记探针的3’端带有荧光基团标记)标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LCRED705和Alexa Fluor488，标记探针的FL1、FL2和FL3选择的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。本实施例标记探针的荧光基团标记优选如表6所示。
表6标记探针
本实施例所述不具有标记探针的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒B，主要包括有：
一、捕获探针：与上述具有标记探针的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒中的捕获探针相同。
二、扩增探针：与上述具有标记探针的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒中的捕获探针的序列相同，但P4序列的3’端修饰有荧光基团。
所述P4序列的3’端修饰有荧光基团，具体为：针对上皮细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL1，间质细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL2，白细胞标志基因检测探针P4序列修饰的荧光基团为FL3，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和AlexaFluor488，其中FL1、FL2和FL3对应的荧光基团互不相同，且所对应的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的标志基因。标志基因扩增探针的P4的3’端的荧光基团标记优选如表5所示。
表5标志基因的染料标记
实施例2运用实施例1中的试剂盒A对人外周血循环肿瘤细胞进行检测
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的探针混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1相应基因列表中的全部探针。
一、样本预处理，将CTCs过滤至滤膜上
1.在样本保存管中使用RI保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，去除红细胞。
2.加入4mL PBS和1mL RI固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μL4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μL RI透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在RI透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的RI消化酶工作液：
试剂组分 每个样本用量
RI消化酶 1.25μL
PBS 48.75μL
总体积 50μL
2.RI消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合
1.RI探针缓冲液、RI扩增缓冲液和RI显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制RI探针工作液：
试剂组分 每个样本用量
RI探针混合液 8μL
RI探针缓冲液(40℃预热) 42μL
总体积 50.0μL
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液
中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
1.配制RI扩增工作液：
试剂组分 每个样本用量
RI扩增混合液 2μL
RI扩增缓冲液(40℃预热) 48μL
总体积 50.0μL
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.配制RI显色工作液
试剂组分 每个样本用量
RI显色混合液 2μL
RI显色缓冲液(40℃预热) 48μL
总体积 50.0μL
避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中RI显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml RI洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在RI洗涤液中至下一步实验操作，样本在RI洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察CTCs
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μL RI抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数CTC异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
八、检测结果判断及分析
1.阳性CTC鉴定标准
在滤膜上，富集有少量的循环肿瘤细胞以及残留的数千个白细胞，循环肿瘤细胞阳性的判定标准为(参见图1)：
1)具有循环肿瘤细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy3通道和Alexa Fluor488通道下能够显示红色荧光信号点或绿色荧光信号点。
2)不具有白细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Cy5通道下不显示荧光信号点。
3)细胞核DAPI染色阳性。
4)循环肿瘤细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。
2.阳性CTC分型标准：
本试剂盒采用多重RNA探针，分别针对多种CTCs特异性基因，通过不同颜色荧光信号，可进一步将CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs携带Cy3荧光基团(显示为红色荧光信号点)，Ⅲ型(间质型)CTCs携带Alexa Fluor488荧光基团(显示为绿色荧光信号点)，同时表达Ⅰ型和Ⅲ型特异性基因的CTCs为Ⅱ型(上皮-间质混合型，同时显示红色荧光及绿色荧光信号点)。参见图2。CTCs分型标准如下：
表8阳性CTC分型标准
3.使用上述检测方法，对20个血液样本进行检测和观察，具体结果为：
表9样本检测结果
编号 上皮型 上皮-间质混合型 间质型 CTC总量
1 0 0 1 1
2 0 2 2 4
3 0 0 0 0
4 0 0 9 9
5 0 24 40 64
6 0 1 6 7
7 0 8 4 12
8 0 4 18 22
9 0 5 2 7
10 1 14 15 30
11 0 0 0 0
12 0 4 38 42
13 0 1 4 5
14 0 7 2 9
15 0 12 0 12
16 0 1 0 1
17 1 3 0 4
18 0 3 1 4
19 0 3 12 15
20 0 23 8 31
实施例3试剂盒目标检测标志基因的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测标志基因数量和种类的选择)
本发明试剂盒上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19，间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2，当上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因选择不同数量和种类的基因时，其检测结果一致。
以上皮细胞标志基因的选择为例，参见实施组1-3，分别选取一种、三种及五种的标志基因基因，对比其检测效果，而间质细胞标志基因使用全部的4种基因以及白细胞标志基因CD45，具体设计如表10所示。
以不加入白细胞标志基因为例，实验组4使用所有的上皮细胞标志基因EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18和KRT19，同时使用所有的间质细胞标志基因：CDH2、VIMENTIN、FN1和AKT2，实验时，不包括有白细胞标志基因相应的探针组成。
本实施例所述捕获探针、扩增探针与标记探针的合成、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表10上皮细胞标志基因基因的选择
二、样品检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-25进行检测，检测结果如下(表中数据为CTC数目)：
表11使用不同数量上皮细胞标志基因检测效果的比较
截取观察荧光信号的视野，比较上皮型CTCs的信号标记效果，具体结果对比为图3。
从图3中可以看出，在上皮型CTC的判断中，红色荧光信号点从实验组1到实验组3随着上皮细胞标志基因数量的增加而逐渐增加，在上皮-间质型CTC的判断中，因间质细胞标志基因使用全部的4种基因，所以3组实验中绿色荧光没有很大差别，而红色荧光信号点从实验组1到实验组3随着上皮细胞标志基因数量的增加而逐渐增加，三组的检测结果一致，但含有上皮细胞标志基因越多，其红色荧光信号越多，检测效果更优。
通过对比3组CTCs细胞的种类和数量可知，当上皮细胞标志基因和间质细胞标志基因选择不同数量和种类的基因时，其检测结果一致，其中，使用全部的上皮细胞标志基因检测探针时，检测信号更强更稳定，效果较优。其它针对使用不同数量的上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
通过实验组1-3与实验组4的检测结果对比可知，不使用白细胞检测探针，其检测结果与使用白细胞检测探针一致，但使用白细胞标志基因检测探针，有助于进一步区分白细胞和肿瘤细胞，排除白细胞对检测结果的干扰，因此为了便于检测人员对肿瘤细胞的判断，优选使用含有白细胞检测探针的试剂盒。
实施例4不同间隔臂的试剂盒对循环肿瘤细胞mRNA原位杂交的检测
一、试剂盒制备的设计(间隔臂的选择)
分别以上皮细胞标志基因基因(共5个基因)、间质细胞标志基因(共4个基因)、白细胞标志基因(1个基因)为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表12所示。捕获探针、扩增探针与标记探针的合成、检测方法等如实施例1和实施例2所述。对应的捕获探针、扩增探针的间隔臂相同。
表12间隔臂及其长度
间隔臂种类 长度 实验组
poly(dT) 5 1
poly(dA) 8 2
(CH2)n 15 3
poly(TTG) 3 4
二、样品检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样品26-30进行检测，检测结果如下(表中数据为CTC数目)：
表13上皮细胞标志基因检测探针使用不同间隔臂的实验结果比较
表14间质细胞标志基因检测探针使用不同间隔臂的比较
表15白细胞标志基因检测探针使用不同间隔臂的比较
经过对比4组CTCs细胞的种类和数量可知，4组实验设计的检测效果没有差异。因此，这4种间隔臂的设计是等效的。其它针对捕获探针、扩增探针和标记探针内部不同的间隔序列的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例5：标记探针的运用
一、试剂盒制备的设计(信号检测组分)
本发明试剂盒信号检测组分有两种选择，1)扩增探针序列P4的3’端修饰有荧光基团；2)扩增探针3’端序列P4与标记探针的P5序列通过碱基互补配对结合，同时标记探针的3’端带有荧光基团。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。
以两种不同信号检测组分为例，即所述试剂盒的组成为：
实验组1：捕获探针和扩增探针同实施例1，扩增探针3’端修饰有荧光基团Cy3；没有标记探针；如实施例1所述试剂盒A。
实验组2：捕获探针、扩增探针和标记探针同实施例1，扩增探针不具有荧光基团，但配置有标记探针，标记探针的P5序列3’端修饰有荧光基团Cy3。如实施例1所述试剂盒B。
二、样品检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样品31-35进行检测，检测结果如下(表中数据为CTC细胞数目)：
表16上皮细胞标志基因使用不同信号检测探针的检测结果比较
将两组设计的CTCs数量和类型进行统计学分析，证明两组设计的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。
实施例6标志基因的捕获探针的数量选择
一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明外周血循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，针对不同类别的每个标志基因分别设计了10条捕获探针，且同一类别的标志基因的捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种标志基因，选择对应的至少2条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
以上皮细胞标志基因EPCAM的捕获探针数量选择为例，参见实验组1-3，分别选取2条、5条及10条的捕获探针，对比其检测效果。在该对比实验中，上皮细胞标志基因仅使用EPCAM(参见表17)，而间质细胞标志基因使用如实施例1所列出的全部的4种基因以及白细胞标志基因CD45及其对应的检测探针。
表17上皮细胞标志基因EPCAM的捕获探针的选择
二、样品检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样品36-40进行检测，检测结果如下(表中数据为CTC细胞数目)：
表18上皮细胞标志基因EPCAM使用不同数量捕获探针的检测结果比较
通过三组实验对比可知，针对上皮细胞标志基因EPCAM，使用2条、5条和10条的捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时可得知，检测信号更强更稳定，检测效果最佳。
其它针对上皮细胞标志基因、间质细胞标志基因和白细胞标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (15)

1.一种循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，包括有检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA的检测探针；所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，还包括有白细胞标志基因mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45。
3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述检测探针包括：
(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(2)针对每个标志基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于，所述检测探针包括：
(1)针对每个标志基因的捕获探针：所述捕获探针连接标志基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的特异性序列P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(2)针对每个标志基因的扩增探针：每条扩增探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3)针对每种细胞种类的标记探针：所述标记探针具有与扩增探针P4互补配对的序列P5，且末端修饰有荧光基团；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
5.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.101、P3序列为SEQ ID NO.104、P4序列为SEQ ID NO.107。
6.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于：针对CDH2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对VIMENTIN基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对FN1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.102、P3序列为SEQ ID NO.105、P4序列为SEQ ID NO.108。
7.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于：还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，针对CD45基因mRNA的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因mRNA的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.103、P3序列为SEQ ID NO.106、P4序列为SEQ ID NO.109。
8.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于：所述间隔臂序列为5－10个T。
9.根据权利要求3或4所述的循环肿瘤细胞鉴定试剂盒，其特征在于：所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor488，且针对不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
10.一种循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)得到去除红细胞后的生物体液样本；
(2)过滤，在滤膜上富集循环肿瘤细胞，通过透化处理，消化细胞，使mRNA暴露；
(3)检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，所述上皮细胞标志基因选自：EPCAM、KRT16、KRT8、KRT18、KRT19中的一个或一个以上；所述间质细胞标志基因选自：CDH2、VIMENTIN、FN1、AKT2中的一个或一个以上。
11.根据权利要求10所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针的特异性序列P1与对应的目标mRNA序列特异性结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与带有荧光基团标记的扩增探针的P3序列结合，从而实现目标mRNA信号的放大；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列，每条扩增探针的3’端还修饰有荧光基团，不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；所述P4为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)通过荧光检测仪检测。
12.根据权利要求10所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于，所述检测上皮细胞标志基因mRNA、和/或间质细胞标志基因mRNA是否存在，包括以下步骤：
(3.1)每种标志基因的捕获探针特异性序列P1与对应的目标mRNA序列结合；每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的标志基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与对应标志基因的扩增探针的P3互补配对的P2序列；所述P2为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.2)捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合；所述扩增探针碱基序列从5’端到3’端依次为：能与捕获探针P2互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4分别为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
(3.3)所述扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，从而实现目标mRNA信号的级联放大；不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同；
(3.4)通过荧光检测仪检测。
13.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于：针对EPCAM基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对KRT16基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对KRT8基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上，针对KRT18基因特异性序列P1的选自SEQID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上，针对KRT19基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上；针对上皮细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.101、P3序列为SEQ ID NO.104、P4序列为SEQ ID NO.107；和/或
针对CDH2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对VIMENTIN基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对FN1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上，针对AKT2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上；针对间质细胞标志基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.102、P3序列为SEQ ID NO.105、P4序列为SEQ ID NO.108；和/或
还包括有白细胞标志基因的mRNA的检测探针，所述白细胞标志基因为CD45，针对CD45基因mRNA的特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上；针对白细胞标志基因mRNA的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.103、P3序列为SEQID NO.106、P4序列为SEQ ID NO.109。
14.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于：所述间隔臂序列为5－10个T。
15.根据权利要求11或12所述的循环肿瘤细胞鉴定方法，其特征在于：所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor488，且不同细胞种类标志基因的荧光基团互不相同。
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Application publication date: 20140910

Assignee: Shanghai Yishan Medical Laboratory Co., Ltd.

Assignor: Surexam Biological Technology Co., Ltd.

Contract record no.: 2019990000156

Denomination of invention: Circulating tumor cell identification kit and circulating tumor cell identification method

Granted publication date: 20160629

License type: Common License

Record date: 20190515