CN106636308A - 一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒。本发明提供的皮肤癌相关的标志物选自12种miRNA，所述标志物与皮肤癌密切相关；本发明提供所探针组合物包括捕获探针和信号放大组合物，所述的探针组合物特异性、准确度、灵敏度皆良好，能够实现对目标标志物的准确检测，且重复性好。本发明提供的试剂盒还包括信号放大探针，本发明提供的方法采用原位杂交方法，通过级联放大体系提高信号强度，采用本发明提供的试剂盒和方法能够在8h内完成对样品的检测，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
皮肤癌包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、特发性出血性肉瘤、汗腺癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、血管肉瘤等。其中常见的是鳞状细胞癌和基底细胞癌。目前，研究结果表明，多种miRNA在皮肤癌细胞或临床样本中呈过表达或下调表达，且发现有些miRNA能够诱导形成皮下肿瘤。基于miRNA的表达与皮肤癌的相关性，miRNA可以作为皮肤癌相关的标志物，通过对miRNA表达的检测，实现对皮肤癌的早期诊断和治疗。
目前，针对miRNA的检测方法主要有Northern Blot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。
原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性miRNA序列的方法。然而目前现有技术中对miRNA的多重平行检测仍存在许多困难。首先，需要分别制备各靶miRNA的标记探针；其次，难以同时原位检测多种靶miRNA的表达。因此，目前报道的对多种miRNA的检测只能用不同的标记方法，然而，用不同的标记方法不能很好地控制探针与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的皮肤癌相关microRNA检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物能够检测皮肤癌相关标志物，所述标志物选自hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p中一种或以上。
所述探针组合物，其特征在于，包括捕获探针：
所述捕获探针的核苷酸序列自5’端至3’端依次为P1序列、间隔臂序列、P2序列；
所述P1序列与权利要求1所述的标志物特异性结合；
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5个～10个T。
在其中一个实施例中，所述P1序列选自SEQ ID NO:1～12，所述P2序列选自SEQ ID NO:13～24。
在其中一个实施例中，所述的探针组合物，其特征在于，所述捕获探针选自以下序列：
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:1、5个T、SEQ ID NO:13；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:2、5个T、SEQ ID NO:14；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:3、5个T、SEQ ID NO:15；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:4、5个T、SEQ ID NO:16；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:5、5个T、SEQ ID NO:17；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:6、5个T、SEQ ID NO:18；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:7、5个T、SEQ ID NO:19；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:8、5个T、SEQ ID NO:20；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:9、5个T、SEQ ID NO:21；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:10、5个T、SEQ ID NO:22；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:11、5个T、SEQ ID NO:23；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:12、5个T、SEQ ID NO:24。
本发明的另一目的是提供一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其特征在于，包含上述的捕获探针和信号放大组合物。
所述一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其特征在于，所述信号放大组合物为：
一级信号放大探针，在一级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；
或一级信号放大探针，二级信号放大探针，在二级信号放大探针的3’端修饰荧光基团；
或一级信号放大探针、二级信号放大探针，三级信号放大探针，在三级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；
针对所述捕获探针中的任一种，所述一级信号放大探针与所述捕获探针特异性结合；
针对所述一级信号放大探针中的任一种，所述二级信号放大探针与所述一级信号放大探针特异性结合；
针对所述二级信号放大探针中的任一种，所述三级信号放大探针与所述二级信号放大探针特异性结合。
本发明提供的一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其另一特征在于，所述：
一级信号放大探针自5’端至3’端依次为P4序列、间隔臂序列、P3序列；
二级信号放大探针自5’端至3’端依次为P5序列、间隔臂序列、P6序列；
三级信号放大探针自5’端至3’端依次为P8序列、间隔臂序列、P7序列；
所述P3序列与P2序列特异性结合；
所述P5序列与P4序列特异性结合；
所述P6序列与P7序列特异性结合；
所述间隔臂序列独立的为2个～20个T；
所述P8序列为5个T。
在其中一个实施例中，所述P4序列选自SEQ ID NO:25～36；所述P6序列选自SEQ ID NO:49～60。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705或Alexa Fluor 488，且针对不同捕获探针的信号放大探针上修饰的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的原位杂交方法所设计的检测试剂盒，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的核酸杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高miRNA原位杂交的检测灵敏度，此外，由于多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
(2)本发明所选择的信号放大探针，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明方法采用多重信号放大探针，该探针的选取，能够实现包括二级探针或三级使用，均能够实现信号放大检测，当三种探针共同使用时，极大地提高检测的灵敏度。
(3)本发明所设计的12中miRNA的各种具体探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
具体实施方式
本发明提供了一种皮肤癌相关标志物、其检测探针与检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
实施例1 皮肤癌相关miRNA检测试剂盒
本实施例提供一种皮肤癌相关miRNA检测试剂盒，包括有捕获探针以及信号放大探针，信号放大探针包括有，一级信号放大探针、二级信号放大探针、三级信号放大探针。以上探针具有特异性强、灵敏度高的特点。
1、捕获探针
捕获探针是连接靶核酸与一级信号放大探针，每条捕获探针的碱基序列从5’端到3’端依次为与待检测的靶核酸结合的特异性序列P1、间隔臂序列、能与P2序列，所述P3序列为与P2序列反向互补的碱基序列；针对不同目标基因的P2序列互不相同。
所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与特异性序列P1间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。
本实施例针对hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p设计捕获探针，具体如表1、表2：
表1 捕获探针的P1序列
| SEQ ID NO. | miRNA | P1序列(5’→3’) |
| 1 | hsa-miR-375 | TCACGCGAGCCGAACGAACAAA |
| 2 | hsa-miR-149-3p | GCACAGCCCCCGTCCCTCCCT |
| 3 | hsa-miR-221-3p | GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT |
| 4 | hsa-miR-222-3p | ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT |
| 5 | hsa-miR-34a-5p | ACAACCAGCTAAGACACTGCCA |
| 6 | hsa-miR-199a-5p | GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG |
| 7 | hsa-miR-137 | CTACGCGTATTCTTAAGCAATAA |
| 8 | hsa-miR-182-5p | AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA |
| 9 | hsa-miR-125b-5p | TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA |
| 10 | hsa-miR-31-5p | AGCTATGCCAGCATCTTGCCT |
| 11 | hsa-miR-21-5p | TCAACATCAGTCTGATAAGCTA |
| 12 | hsa-miR-365a-3p | ATAAGGATTTTTAGGGGCATTA |
表2 捕获探针的P2序列
| SEQ ID NO. | P2序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P2序列(5’→3’) |
| 13 | GTCTATAGTG | 19 | GATGACAGTA |
| 14 | GATTCAGTGA | 20 | AGTACTTGTG |
| 15 | TTGAGTAATG | 21 | AGTCTTGAAG |
| 16 | TGTAATGAGT | 22 | TGATGAATTG |
| 17 | GATTAGTGAT | 23 | ATGACGATAG |
| 18 | GTAGATTAGT | 24 | TTGACGTGAA |
2、信号放大探针
1)一级信号放大探针
信号放大组分中包括一条或以上的一级信号放大探针，所述每条一级信号放大探针从5’端到3’端依次为：与P2序列反向互补配对结合的P3序列、间隔臂序列、P4序列，P3序列通过与捕获探针P2序列的结合实现目标信号的级联放大。
本发明P3与P4序列之间的间隔臂序列可以选自5－20个T，本实施例使用的间隔臂为10个T。
所述P4序列含有一个或以上与二级信号放大探针的P5序列反向互补的碱基片段，
优选含有2～5个与P2序列互补配对的碱基片段，本实施例中，P4含有3个与P5反向互补的碱基片段，相同碱基片段之间设有间隔臂序列，所述间隔臂序列优选为3—10个T，本实施例中为设有3个T，具体如表3：
表3 一级信号放大探针的P4序列
| SEQ ID NO. | P4序列(5’→3’) |
| 25 | GATCTC TTT GATCTC TTT GATCTC |
| 26 | ATATCA TTT ATATCA TTT ATATCA |
| 27 | TATCTC TTT TATCTC TTT TATCTC |
| 28 | CACATC TTT CACATC TTT CACATC |
| 29 | TCACAT TTT TCACAT TTT TCACAT |
| 30 | ACATCA TTT ACATCA TTT ACATCA |
| 31 | CATCGA TTT CATCGA TTT CATCGA |
| 32 | TCAGTC TTT TCAGTC TTT TCAGTC |
| 33 | ACTCTC TTT ACTCTC TTT ACTCTC |
| 34 | ATCATC TTT ATCATC TTT ATCATC |
| 35 | ACATCC TTT ACATCC TTT ACATCC |
| 36 | TCAGGA TTT TCAGGA TTT TCAGGA |
2)二级信号放大探针
本发明含有一条或以上的二级信号放大探针，所述二级信号放大探针从5’端到3’端依次为：与P4序列反向互补结合的P5序列、间隔臂序列、P6序列，所述P4含有一个或以上的P5序列反向互补碱基序列。
本发明P5与P6序列之间的间隔臂序列可以选自5－10个T，本实施例使用的间隔臂为6个T，具体如表4：
表4 二级信号放大探针的P5序列
| SEQ ID NO. | P5序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P5序列(5’→3’) |
| 37 | GAGATC | 43 | TCGATG |
| 38 | TGATAT | 44 | GACTGA |
| 39 | GAGATA | 45 | GAGAGT |
| 40 | GATGTG | 46 | GATGAT |
| 41 | ATGTGA | 47 | GGATGT |
| 42 | TGATGT | 48 | TCCTGA |
所述P6序列含有一个或以上与三级信号放大探针的P7序列反向互补的碱基序列，优选含有2-5个与P7序列互补配对的碱基片段，本实施例中，所述P6序列含有三个与P7序列反向互补片段，相同碱基序列之间设有间隔臂序列，间隔臂序列优选为2—10个T，本实施例中为有2个T，具体见表5：
表5 二级信号放大探针的P6序列
| SEQ ID NO. | P6序列(5’→3’) |
| 49 | CACTC TT CACTC TT CACTC |
| 50 | CATGA TT CATGA TT CATGA |
| 51 | ACGAC TT ACGAC TT ACGAC |
| 52 | GACTC TT GACTC TT GACTC |
| 53 | CTGAC TT CTGAC TT CTGAC |
| 54 | ACACG TT ACACG TT ACACG |
| 55 | AGCAT TT AGCAT TT AGCAT |
| 56 | CAGCT TT CAGCT TT CAGCT |
| 57 | ACGTG TT ACGTG TT ACGTG |
| 58 | GACGA TT GACGA TT GACGA |
| 59 | CTAGC TT CTAGC TT CTAGC |
| 60 | TACGA TT TACGA TT TACGA |
3)三级信号放大探针
本发明所述三级信号放大探针从5’端到3’端依次为：P8序列、间隔臂序列、P7序列，所述P6序列含有一个或以上与P7序列反向互补序列；所述P8序列5’端还修饰有荧光基团；
本发明P7与P8序列之间的间隔臂序列可以选自3－10个T，本实施例使用的间隔臂为5个T，具体如表6：
表6 三级信号放大探针的P7序列
| SEQ ID NO. | P7序列(5’→3’) | SEQ ID NO. | P7序列(5’→3’) |
| 61 | GAGTG | 67 | ATGCT |
| 62 | TCATG | 68 | AGCTG |
| 63 | GTCGT | 69 | CACGT |
| 64 | GAGTC | 70 | TCGTC |
| 65 | GTCAG | 71 | GCTAG |
| 66 | CGTGT | 72 | TCGTA |
本发明所设计的信号放大探针，除上述条件限定的特定探针反向互补完全匹配的情况以外，所述P3、P4、P5、P6、P7、P8序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与整个检测体系的其它核酸之间均不存在特异性结合的序列。
本实施例中，P8序列为5个碱基的polyT序列，其5’端带有荧光基团标记，荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705和Alexa Fluor 488，针对不同目标核酸的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标核酸。
实施例2 一种检测皮肤癌相关miRNA试剂盒
本发明提供了一种皮肤癌相关miRNA检测试剂盒，该试剂盒能够检测靶标miRNA包括：hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p等表达水平，在实际检测中，能根据具体的需要，使用相应的P1～P8序列，组成检测试剂盒，即可实现检测。
本实施例检测试剂盒的组分包括有：捕获探针、信号放大探针和荧光基团，具体探针组分见表7所示。
本实施例将hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p以及hsa-miR-365a-3p等12种miRNA随机分成3组，以检测针对不同miRNA的试剂盒组分，其可靠性和重复性。
本实施例检测试剂盒的组分包括有：捕获探针、信号放大探针和荧光基团，具体探针组分见表7所示。
表7 针对具体目标基因的检测试剂盒(表格数字为SEQ ID NO.)
实施例3 运用实施例2中的试剂盒对样品进行检测
本实施例将使用实施例2的试剂盒，对皮肤癌细胞进行检测，
本实施例以皮肤癌细胞株HS-1为例，本领域技术人员，根据细胞株名称，即可在现有产品中获得相关的细胞株。
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的信号放大探针混合液均使用实施例1相应列表中的全部探针。
一、样本预处理，将样品细胞过滤至滤膜上
1.将样本保存管中的皮肤癌细胞(HS-1)600×g水平离心5min，弃上清。
2.加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μL 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μL透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露miRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 消化酶 | 1.25μL |
| PBS | 48.75μL |
| 总体积 | 50μL |
2.消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标miRNA序列结合
1.捕获探针混合液、探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制捕获探针工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 捕获探针混合液 | 8μL |
| 探针缓冲液(40℃预热) | 42μL |
| 总体积 | 50.0μL |
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、目标mRNA序列信号放大
1.探针缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制探针工作液：
| 试剂组分 | 每个样本用量 |
| 信号放大探针混合液 | 8μL |
| 探针缓冲液(40℃预热) | 42μL |
| 总体积 | 50.0μL |
涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.显色缓冲液(40℃预热)避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色缓冲液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μL抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数样本细胞数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表8 荧光基团的激发波长和发射波长
| 荧光基团 | 激发波长(Excitation filter) | 发射波长(Emission filter) |
| DAPI | 330-385nm | 420nm |
| Alexa Fluor 488 | 460-495nm | 510-550nm |
| Cy3 | 545-580nm | 610nm |
| Cy5 | 616-649nm | 667-751nm |
| TET | 521nm | 536nm |
| HEX | 535nm | 556nm |
| TAMRA | 555nm | 576nm |
| Texas Red | 560-580nm | 600-650nm |
八、检测结果判断及分析
1.阳性皮肤癌细胞鉴定标准
在滤膜上，富集有皮肤癌细胞，皮肤癌细胞阳性的判定标准为：
1)具有相应靶标miRNA特异性标识物，在本试剂盒中表现为在相应的荧光通道下显示荧光信号点。
2)细胞核DAPI染色阳性。
3)皮肤癌细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。
2.使用上述检测方法，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个皮肤癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表9 样本检测结果(荧光信号点数)
实施例4 试剂盒的稳定性
1、试剂盒稳定性检测
本发明提供一种miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。
本实施例将使用实施例1探针组Group1组成的试剂盒，对三组不同细胞株的15种样本(每种细胞株5个样本)中的hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p表达情况进行检测，从而评估本发明试剂盒的稳定性。
2、关于检测样本
本实施例使用皮肤癌的3种皮肤癌细胞作为检测对象，从而验证其有效性和稳定性(可重复性)，具体细胞株和样本如表10所示，本领域技术人员，根据细胞株名称，即可在现有产品中获得相关的细胞株。本实施例所述探针选自实施例1，实验步骤参考实施例2。
表10 细胞株和检测样本
| 样本号 | 皮肤癌细胞株 | 实验组 |
| 样本16～样本20 | HS-1 | Group4 |
| 样本21～样本25 | A431 | Group5 |
| 样本26～样本30 | HS-4 | Group6 |
3、检测结果
使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个皮肤癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表11 样本检测结果(荧光信号点数)
从上述检测结果可见，一方面，不同细胞株的样本，其检测结果不同，因此，本发明是能够实现不同miRNA表达水平检测的，是有效的；另一方面，相同细胞株的5个样本，其hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p等4中miRNA的荧光点数检测结果相近(±3)，具体见Group4(样本16～20)、Group5(样本21～25)或Group6(样本26～30)，因此，本试剂盒重复性好；由此可见，本发明试剂盒是有效的，稳定性可靠的，其它针对不同miRNA种类的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例5 靶标miRNA数量选择
1、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明提供一种miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同数量的捕获探针，组成相应的探针混合液，从而实现不同数量miRNA的并行检测。
本实施例分别针对1种、3种、5种、7种miRNA，选用捕获探针，信号放大探针选择一级信号方法探针、二级放大探针以及三级信号放大探针，组成检测试剂盒，对同一细胞株HS-1的样本进行检测，对比其检测效果，.具体组成如表12，所述探针选自实施例1，实验步骤参考实施例2。
表12 选择不同数量靶标miRNA的捕获探针(表格数字为SEQ ID NO.)
2、使用上述试剂盒，对每个样本进行检测和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个皮肤癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表13 样本检测结果(荧光信号点数)
通过上述4组实验对比可知，本试剂盒可以针对不同数量的靶标miRNA进行检测，使用1条、3条和5条、7条的针对不同miRNA捕获探针均可完成检测，特异性和稳定性都很好。
其它针对标志基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例6 标记探针的选择
1、试剂盒制备的设计(信号放大探针组合的选择)
本发明提供一种皮肤癌相关miRNA检测的试剂盒，所述的试剂盒针对不同的目标检测miRNA，选取不同信号探针组合，组成相应的探针混合液，从而实现miRNA的并行检测。
本实施例将使用实施例1的所提供的各级信号放大探针组成的试剂盒，对同一细胞株(HS-1)的5个样本中的hsa-miR-149-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-125b-5p表达情况进行检测，从而评估本发明所提供的P2，P3，P4，P5，P6，P7信号放大探针的适用性。具体的试剂盒组成如下：
表14 不同信号放大探针组合(表格数字为SEQ ID NO.)
2、使用上述试剂盒，对每个样本进行检测(应用实施例2所述检测方法)和观察，其中，针对细胞核的DAPI染色，使用“-”或“+”表示是否检测到荧光；针对目标检测miRNA标志物的荧光信号强度，分别读取每个样本中10个前列腺癌细胞的相应颜色的miRNA荧光点数量，并计算平均点数，具体结果为：
表15 不同信号放大探针组合的检测结果
通过上述3组实验对比可知，使用不同信号探针组合组成的试剂盒对miRNA进行检测，其检测结果相一致，除了本实施例检测的miRNA以及其放大探针组合外，本发明所提供的其他miRNA以及其他信号放大探针的组合，同样能实现本实施例的检测效果，具体试验结果省略。由此可知，本发明提供的信号放大探针可以根据实际操作需要进行任意搭配，并且能实现本发明所述的miRNA检测，其检测结果一致，说明本发明所提供的信号放大探针对于皮肤癌相关miRNA检测具有良好的适用性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物能够检测皮肤癌相关标志物，所述标志物选自hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p中一种或以上。
2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，包括捕获探针：
所述捕获探针的核苷酸序列自5’端至3’端依次为P1序列、间隔臂序列、P2序列；
所述P1序列与权利要求1所述的标志物特异性结合；
所述间隔臂序列为5个～10个T。
3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述P1序列选自SEQ ID NO:1～12，所述P2序列选自SEQ ID NO:13～24。
4.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，所述捕获探针选自以下序列：
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:1、5个T、SEQ ID NO:13；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:2、5个T、SEQ ID NO:14；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:3、5个T、SEQ ID NO:15；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:4、5个T、SEQ ID NO:16；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:5、5个T、SEQ ID NO:17；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:6、5个T、SEQ ID NO:18；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:7、5个T、SEQ ID NO:19；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:8、5个T、SEQ ID NO:20；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:9、5个T、SEQ ID NO:21；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:10、5个T、SEQ ID NO:22；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:11、5个T、SEQ ID NO:23；
自5’端至3’端顺序连接的SEQ ID NO:12、5个T、SEQ ID NO:24。
5.一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～4任一项所述的捕获探针和信号放大组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述信号放大组合物为：
一级信号放大探针，在一级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；
或一级信号放大探针，二级信号放大探针，在二级信号放大探针的3’端修饰荧光基团；
或一级信号放大探针、二级信号放大探针，三级信号放大探针，在三级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；
针对所述捕获探针中的任一种，所述一级信号放大探针与所述捕获探针特异性结合；
针对所述一级信号放大探针中的任一种，所述二级信号放大探针与所述一级信号放大探针特异性结合；
针对所述二级信号放大探针中的任一种，所述三级信号放大探针与所述二级信号放大探针特异性结合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述：
一级信号放大探针自5’端至3’端依次为P4序列、间隔臂序列、P3序列；
二级信号放大探针自5’端至3’端依次为P5序列、间隔臂序列、P6序列；
三级信号放大探针自5’端至3’端依次为P8序列、间隔臂序列、P7序列；
所述P3序列与P2序列特异性结合；
所述P5序列与P4序列特异性结合；
所述P6序列与P7序列特异性结合；
所述间隔臂序列独立的为2个～20个T；
所述P8序列为5个T。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述P4序列选自SEQ IDNO:25～36。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述P6序列选自SEQ IDNO:49～60。
10.根据权利要求5～9任一所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705或Alexa Fluor 488，且针对不同捕获探针的信号放大探针上修饰的荧光基团互不相同。
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