CN109055618A - 用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对。本发明还公开了与所述的引物对配合使用的探针。本发明还公开了一种检测试剂盒。本发明以传染性脾肾坏死病毒中DNA polymerase基因为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。与PCR检测方法相比，本发明的方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。

Description

用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒。
背景技术
虹彩病毒(iridovirus)是对鱼类、两栖类和爬行类水生动物都有致病性的一类病原，由其感染所致的疾病已经给世界水产养殖业造成巨大的经济损失。虹彩病毒科(Iridoviridae)大致可分为五个属，分别是虹彩病毒属(Iridovirus)，绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)，蛙病毒属(Ranavirus)，淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidneynecrosis virus,ISKNV)被国际病毒分类委员会(International Committee On Taxnonmyof Viruses,ICTV)归纳进虹彩病毒科细胞肿大病毒属，是一类有囊膜、二十面体的线性双链DNA病毒，直径大小约为140nm左右。病鱼有脾肾脏肿大贫血等症状,严重可致其死亡，在鳜鱼中较为流行。
目前关于检测传染性脾肾坏死病毒的方法主要有PCR、LAMP。PCR以4种dNTP为底物，在引物存在的情况下，在DNA模板的3’末端进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板核酸得到指数级的扩增。PCR法检测传染性脾肾坏死病毒的基本步骤包括样本的前处理，在PCR总反应体系中加入缓冲液、氯化镁、Taq酶、dNTP、模板和引物，设置扩增条件扩增反应。取微量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外检测仪观察并用凝胶成像系统照相，观察是否有目的片段出现。PCR产物的分析一般采用琼脂糖凝胶电泳分析，初步判断PCR产物片段的大小与预计是否一致。劳海华建立了巢式PCR技术用于检测传染性脾肾坏死病毒，令人头痛的问题是普通PCR扩增检测容易出现气溶胶污染，使检测结果出现假阳性。随着分子生物学的发展，逐渐发展了荧光定量PCR技术进行ISKNV检测手段，如付小哲建立了鳜传染性脾肾坏死病毒的荧光定量PCR检测技术，安伟建立了鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的TaqMan荧光定量PCR检测技术。
荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。虽然实时荧光定量PCR简化了操作步骤，采用闭管检测可避免PCR跑胶导致的气溶胶假阳性的出现，敏感性高，可以实现实时监控，还可以实现定量判断。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，因此难以得到全面推广。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的基因扩增技术，由日本学者Notomi 2000年在Nucleic Acids Res杂志上公开发表，作为一种分子生物学检测技术，现先已广泛应用于分子检测领域，Suebsing利用ISKNV的MCP基因建立了传染性脾肾坏死病毒快速检测的LAMP技术。LAMP原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(如Bst酶)的作用下，水浴锅中63℃左右，60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有很高的扩增效率，操作简单，检测不需要使用特殊的仪器。LAMP虽然增加了扩增效率，但引物间的非特异性配对容易导致假阳性结果，限制了LAMP方法的使用，所以目前在水产病原的检测应用较少。酶联免疫吸附测定(ELISA)，虽然使检测结果能够量化，容易判断且耗时短，但该方法对酶活性要求高,非常依赖酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性；另外，该类方法所需的试剂盒价格较昂贵，不利于大面积推广。
发明内容
发明目的：本发明所要解决技术问题是提供了一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对。本发明通过Vector NTI软件对比文献上列出传染性脾肾坏死病毒常见的保守基因，并选定保守性强的DNA polymerase基因作为目标扩增区段，利用Oligo 6软件在保守区分别设计了4对引物和3条探针，将设计好的序列在NCBI上进行BLAST比对，确保种类的保守性及种间的特异性。
本发明还要解决的技术问题是提供了与所述的引物对配合使用的探针。
本发明还要解决的技术问题是提供了包含上述引物对和/或与引物对配合使用的探针的试剂盒。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示，所述下游引的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。
本发明内容还包括与所述的引物对配合使用的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
其中，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为SYTO-13，SYTO-82，FAM，FITC,SYBR Green I，SYTO-13，SYTO-82，VIC，HEX，JOE，TAMRA，TET，Cy3，ROX，TEXAS-Red或Cy5中的一种。
其中，所述探针的长度为35-55个核苷酸碱基，位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。
本发明内容还包括所述的特异性引物对、所述的探针在制备传染性脾肾坏死病毒检测或诊断试剂盒中的应用。
本发明内容还包括一种传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，所述传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒包括所述的引物对和/或所述的探针。
其中，所述的检测试剂盒反应体系包括：重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，至少一对引物，一条探针，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。
其中，所述重组酶选自噬菌体UvsX蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合。
其中，所述聚合酶选自klenow聚合酶，bsu聚合酶或phi29聚合酶及其这些酶的突变体或大片段的任一种或一种以上的组合。
其中，所述单链DNA结合蛋白选自大肠杆菌SSB蛋白，GP32蛋白的任一种或其组合。
其中，所述核酸酶选自核酸外切酶III或核酸内切酶IV或甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶的任一种或一种以上的组合。
其中，所述重组加载蛋白选自噬菌体UvsY蛋白，大肠杆菌RecO或大肠杆菌RecR的任一种或一种以上的组合。
其中，所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合。
其中，所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000，PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000中的一种或几种。
其中，所述能量系统选自ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或一种以上的组合。
其中，所述盐离子选自Tris，镁离子或钾离子的任一种或一种以上的组合。
具体的，本发明的引物和探针的组合有以下四种组合：
组合一：
上游引物：5’-AGACACAGGGTGCATTTAAGATACATGAGTCG-3’
下游引物：5’-CACTGGGGAACACGTTTTCATGGTCGGACTTG-3’
探针：5’-CGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAG(FAM-dT)A(THF)A(BHQ1-dT)GGTGCCTAACTGG(C3-SPACER)-3’
组合二：
上游引物：5’-TGACGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAG-3’
下游引物：5’-CCTATCTGAAATATCACCTCGTCGTCCCTGTC-3’
探针：5’-ACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCAGTGACAGG(C3-SPACER)-3’
组合三：
上游引物：5’-GATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGATGG-3’
下游引物：5’-TACACAGCACCAGGCCTATCTGAAATATCACC-3’
探针：5’-ACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCAGTGACAGG(C3-SPACER)-3’
或组合四：
上游引物：5’-CCCAACTACAATGCCATGCGCGATGTACAGGA-3’
下游引物：5’-ATGGTCGGACTTGACCTCAATGTCAAAGTAAA-3’
探针：5’-ATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGA(FAM-dT)G(THF)AG(BHQ1-dT)TCACAGCACGCGCC(C3-SPACER)-3’
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification)在扩增时间、扩增特异性、扩增所需要的能耗等方面均具有明显的优势。原理为通过反应体系中通常为28-35个碱基的两条特异性引物与重组酶形成复合物，在模板DNA上寻找同源序列发生链交换，并在DNA聚合酶作用下发生延伸。经过上下游引物在模板的特异性区段两端分别结合延伸，循环往复发生指数级扩增。扩增产物虽然可通过添加SYBR Green染料实现荧光信号的增加，但因荧光染料无法区分非特异性，而通过反应体系中增加可以被核酸外切酶III或者核酸内切酶IV进行碱基类似物切除的方式的特异性荧光探针技术进行检测，从而大大提高了检测的特异性。
本发明通过NCBI搜索文献上列出常见的传染性脾肾坏死病毒DNA polymerase基因，利用Vector NTI软件进行比对找出其保守区域，选取DNA polymerase基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体puc57中，制备成传染性脾肾坏死病毒的阳性质粒，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，选取的DNA polymerase基因基因部分序列如下：
GCCTGTATGGCGCAAAGGGGGTGGGCACATACTTTGCCGCACGCGTGCCCAACTACAATGCCATGCGCGATGTACAGGAGACACAGGGTGCATTTAAGATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGATGGAGTTCACAGCACGCGCCGGCCTGCCGACCGTTGGCTGGATACAGGTGTCGCAGCGATGTGTGGTGACGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAGTACATGGTGCCTAACTGGCGTACCGATGTCAGGCCGGCCCCGGACATGGAGGGCGTGCCGCCGGCAAAGATTGTTTACTTTGACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACGTGTTCCCCAGTGACAGGGACGACGAGGTGATATTTCAGATAGGCCTGGTGCTGTGTAGTGGCAACACGGTGCTGCGCACTGACCTTCTCTCCTTGCCCGGCCGCGATTACGACGACTCTGTGTACCAGTACGCCACAGAAGGCGAGCTGCTGCACGCATTCATAG(SEQ ID NO：12)
本发明利用Oligo 6软件在保守区分别设计了4对引物和3条探针，将设计好的序列在NCBI上进行BLAST比对，确保种内的保守性及种间的特异性。
因此，本发明还包括了检测传染性脾肾坏死病毒的方法，该方法采用的扩增体系同前所述检测试剂盒的体系，该方法至少包括两条引物和一条探针，引物分别结合于待扩增区域的上游和下游，引物的长度为15-45核苷酸碱基，优选为28-35核苷酸碱基；所述探针长度为35-55个核苷酸碱基，优选地46-52个碱基，探针中位于第28-35位的一个碱基被替换为核酸类似物，所述核酸类似物优选为THF，在THF的两侧分别为两个T碱基并标记荧光基团和淬灭基团，探针在3’-末端通过封闭基团进行封闭。引物和探针的组合同前所述的四种组合。
在该扩增体系中，三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0终浓度为20-60mM，更优选为30mM；醋酸钾终浓度为60-120mM，更优选为120mM；引物终浓度为0.1-0.5μM，更优选为0.42μM；聚乙二醇选自终浓度5％PEG8000或PEG20000，更优选为5％PEG20000，二硫苏糖醇终浓度为1-10mM，更优选为3mM；ATP终浓度为1-10mM，更优选为2-3mM；磷酸肌酸终浓度为10-50mM，更优选为20mM；肌酸激酶终浓度为50-250ng/μl，更优选为100ng/μl；噬菌体gp32蛋白终浓度为100-1000ng/μl，更优选为400-600ng/μl；噬菌体uvsX蛋白终浓度为50-500ng/μl，更优选为150ng/μl；噬菌体uvsY蛋白终浓度为10-100ng/μl，更优选为25ng/μl；klenow聚合酶终浓度为5-100ng/μl，更优选为20-80ng/μl；核酸外切酶III终浓度为10-200ng/μl，更优选为50ng/μl。
该扩增反应中，反应温度为25-45℃，优选为37-42℃，更优选为37℃；反应时间为15-60分钟，优选为15-20分钟。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
(1)本发明以传染性脾肾坏死病毒中保守DNA为检测靶点，通过恒温扩增技术，使用特异性的引物和探针组合，提高了传染性脾肾坏死病毒的检测便捷性和特异性，同时检测时间也大大缩短。
(2)与PCR检测方法相比，本发明的检测方法省去了产物电泳验证过程，避免了假阳性结果出现，提高检测的准确度。与qPCR相比，本发明的方法简便易行，也不需要操作复杂的仪器设备，节约了成本，提高了检测效率，同时便于在大范围内推广使用。与其他恒温扩增方法相比，本发明的检测方法所需时间更短，检测的准确率更高。
(3)本发明的检测方法依赖于酶促扩增反应，在恒定的温度下即可进行连续的扩增反应，其扩增速率远远高于常规的PCR变温反应。整个扩增在20分钟即检测完成；而且在操作上，不需要对多种参数进行设置，不需要具备很专业的技能也可以进行检测操作。
(4)本发明的反应条件为37～42℃，对温度控制不需要特别严格，并且采用了特异性的荧光探针，可以更好的区分非特异性扩增。因此，对于基层测试使用更为便捷，且耗能更低，对于现场操作尤为适合。
附图说明
图1为ISKNV重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法灵敏度测试结果。1.质粒6(10-4ng/μl)2.质粒7(10-5ng/μl)3.质粒8(10-6ng/μl)4.质粒9(10-7ng/μl)5.ddH2O
图2为ISKNV重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法特异性测试结果。1.ISKNV 2.GCRV-I 3.GCRV-II 4.GCRV-III 5.SVCV 6.KHV 7.IHNV 8.GIV 9.Cyhv-II10.NCT：DEPC处理水
图3为ISKNV重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶IV)方法灵敏度测试结果。1.质粒6(10-4ng/μl)2.质粒7(10-5ng/μl)3.质粒8(10-6ng/μl)4.质粒9(10-7ng/μl)5.ddH2O
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。
本发明中采用的传染性脾肾坏死病毒感染的病鱼组织样本均由江苏省渔业技术推广中心提供。
实施例1
1、传染性脾肾坏死病毒的阳性质粒的获得：通过NCBI搜索文献上列出常见的传染性脾肾坏死病毒的基因序列，利用Vector NTI软件进行比对找出其保守区域，选区DNApolymerase基因部分区域作为目标扩增区段，将其构建至载体puc57中，制备成传染性脾肾坏死病毒的阳性质粒，质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，选取的DNApolymerase基因部分序列如下：
GCCTGTATGGCGCAAAGGGGGTGGGCACATACTTTGCCGCACGCGTGCCCAACTACAATGCCATGCGCGATGTACAGGAGACACAGGGTGCATTTAAGATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGATGGAGTTCACAGCACGCGCCGGCCTGCCGACCGTTGGCTGGATACAGGTGTCGCAGCGATGTGTGGTGACGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAGTACATGGTGCCTAACTGGCGTACCGATGTCAGGCCGGCCCCGGACATGGAGGGCGTGCCGCCGGCAAAGATTGTTTACTTTGACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACGTGTTCCCCAGTGACAGGGACGACGAGGTGATATTTCAGATAGGCCTGGTGCTGTGTAGTGGCAACACGGTGCTGCGCACTGACCTTCTCTCCTTGCCCGGCCGCGATTACGACGACTCTGTGTACCAGTACGCCACAGAAGGCGAGCTGCTGCACGCATTCATAG。
2、选择通过步骤1合成的含有传染性脾肾坏死病毒保守区DNA polymerase基因序列的质粒为检测目标，
上游引物：5’-AGACACAGGGTGCATTTAAGATACATGAGTCG-3’(SEQ ID NO：1)；
下游引物：5’-CACTGGGGAACACGTTTTCATGGTCGGACTTG-3’(SEQ ID NO：2)；
探针：5’-CGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAG(FAM-dT)A(THF)A(BHQ1-dT)GGTGCCTAACTGG(C3-SPACER)-3’(SEQ ID NO：9)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建25μl扩增反应体系如下：
30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM醋酸钾
14mM醋酸镁
3mM二硫苏糖醇
5％聚乙二醇(分子量20000)
3mM ATP
30mM磷酸肌酸
100ng/μl肌酸激酶
600ng/μl大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl噬菌体uvsY蛋白
60ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM每条上游引物
420nM每条下游引物
120nM每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒，1.5μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以上述合成的阳性质粒为模板进行检测。重组酶聚合酶扩增不需要复杂的样品DNA前处理过程，不需要模板的热变性，反应在较低的恒定温度条件下完成，反应敏感度高，特异性强，上机检测20min即可出结果。反应通过荧光数值判读，省去了PCR产物电泳验证的过程，避免了气溶胶污染。
模板处理：用NanoDrop标定阳性质粒的浓度，用TE先将其稀释至10ng/μl(命名为质粒1)，随后10倍依次稀释，稀释至1ng/μl(命名为质粒2)、稀释至10-1ng/μl(命名为质粒3)、稀释至10-2ng/μl(命名为质粒4)、稀释至10-3ng/μl(命名为质粒5)、稀释至10-4ng/μl(命名为质粒6)、稀释至10-5ng/μl(命名为质粒7)、稀释至10-6ng/μl(命名为质粒8)、稀释至10- 7ng/μl(命名为质粒9)；经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-6ng/μl(命名为质粒8)，(结果参见图1)，灵敏度完全能达到应用需求。
实施例2
选择通过实施例1合成的含有传染性脾肾坏死病毒保守区DNA polymerase基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-TGACGCGCACTGTAACAATGGCAGCCAAAGAG-3’(SEQ ID NO:3)；
下游引物序列是：5’-CCTATCTGAAATATCACCTCGTCGTCCCTGTC-3’(SEQ ID NO:4)；
探针序列是：5’-ACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCAGTGACAGG(C3-SPACER)-3’。(SEQ ID NO：10)
进行重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法版本扩增测试，构建25μl扩增反应体系如下：
30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM醋酸钾
14mM醋酸镁
3mM二硫苏糖醇
5％聚乙二醇(20000)
3mM ATP
30mM磷酸肌酸
100ng/μl肌酸激酶
600ng/μl大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl噬菌体uvsY蛋白
60ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl核酸外切酶III
450μM dNTP
300nM每条上游引物
300nM每条下游引物
120nM每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒1.5μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以上述合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-5ng/μl质粒7，灵敏度与重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法基本相同(见图3)。
实施例3
选择通过合成含有传染性脾肾坏死病毒保守区基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-GATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGATGG-3’(SEQ ID NO:5)；
下游引物序列是：5’-TACACAGCACCAGGCCTATCTGAAATATCACC-3’(SEQ ID NO：6)；
探针序列是：5’-ACATTGAGGTCAAGTCCGACCATGAAAACG(FAM-dT)(THF)(BHQ1-dT)TCCCCAGTGACAGG(C3-SPACER)-3’。(SEQ ID NO：10)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建25μl扩增反应体系如下：
50mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
100mM醋酸钾
14mM醋酸镁
3mM二硫苏糖醇
5％聚乙二醇(分子量20000)
3mM ATP
30mM磷酸肌酸
100ng/μl肌酸激酶
600ng/μl大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl噬菌体uvsY蛋白
40ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM每条上游引物
420nM每条下游引物
120nM每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒1.5μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-6ng/ul质粒8。
实施例4
选择通过合成含有传染性脾肾坏死病毒保守区基因序列的质粒为检测目标，
上游引物序列是：5’-CCCAACTACAATGCCATGCGCGATGTACAGGA-3’(SEQ ID NO：7)；
下游引物序列是：5’-ATGGTCGGACTTGACCTCAATGTCAAAGTAAA-3’(SEQ ID NO：8)；
探针序列是：5’-ATACATGAGTCGCGTGTTAGCAAGACGA(FAM-dT)G(THF)AG(BHQ1-dT)TCACAGCACGCGCC(C3-SPACER)-3’。(SEQ ID NO：11)
利用重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法扩增反应体系进行扩增，构建25μl扩增反应体系如下：
30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
80mM醋酸钾
14mM醋酸镁
3mM二硫苏糖醇
5％聚乙二醇(分子量20000)
3mM ATP
30mM磷酸肌酸
100ng/μl肌酸激酶
600ng/μl大肠杆菌SSB蛋白
150ng/μl噬菌体uvsX蛋白
25ng/μl噬菌体uvsY蛋白
60ng/μl klenow聚合酶大片段(exo-)
50ng/μl核酸外切酶III
450μM dNTP
420nM每条上游引物
420nM每条下游引物
120nM每条荧光探针
模板为合成的阳性质粒1.5μl
扩增温度为37℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl质粒9(见图1)。
核酸提取：柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(B518251)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，取待检样本发病组织约25mg，DNA提取过程按照试剂盒内标准抽提步骤，将提取好的核酸进行分装，冻存于-20℃备用。
特异性检测：为了验证引物及探针的特异性，分别以鱼类常见病毒GCRV-I、II、III、SVCV、KHV、IHNV、GIV、CyHV-2的阳性样本为模板进行检测；经过检测仅ISKNV阳性样品出现正常扩增，阴性对照(无菌水)及GCRV、SVCV、KHV、IHNV、GIV、CyHV-2阳性样品均未出现扩增(见图2)。
实施例5
选取实施例4中设计的引物及探针序列，进行重组酶聚合酶扩增(结合核酸内切酶IV)方法版本扩增测试，构建25μl扩增反应体系如下：
30mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0
80mM醋酸钾
14mM醋酸镁
3mM二硫苏糖醇
5％聚乙二醇(20000)
3mM ATP
30mM磷酸肌酸
100ng/μl肌酸激酶
400ng/μl大肠杆菌recA蛋白
200ng/μl大肠杆菌SSB蛋白
60ng/μl大肠杆菌recO蛋白
40ng/μl大肠杆菌recR蛋白
60ng/μl大肠杆菌recF蛋白
8Units枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I
50ng/μl核酸内切酶IV
450μM dNTP
420nM每条上游引物
420nM每条下游引物
120nM荧光探针
模板为合成的阳性质粒1.5μl
扩增温度为42℃，反应20min，用GS8荧光恒温扩增仪进行检测荧光的变化值，每30s读取一次荧光。以实施例1合成的阳性质粒为模板进行检测。
模板处理：同实施例1，经过检测最终确认其灵敏度能检测到10-7ng/μl质粒9，灵敏度与重组酶聚合酶扩增(结合核酸外切酶III)方法基本相同(见图3)。
综上，实施例4为最佳实施例，最佳引物及探针分别是SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：11。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 江苏水产渔业推广中心、苏州先达基因科技有限公司
<120> 用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 1
agacacaggg tgcatttaag atacatgagt cg 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 2
cactggggaa cacgttttca tggtcggact tg 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacgcgcac tgtaacaatg gcagccaaag ag 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 4
cctatctgaa atatcacctc gtcgtccctg tc 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 5
gatacatgag tcgcgtgtta gcaagacgat gg 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 6
tacacagcac caggcctatc tgaaatatca cc 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 上游引物(Artificial Sequence)
<400> 7
cccaactaca atgccatgcg cgatgtacag ga 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 下游引物(Artificial Sequence)
<400> 8
atggtcggac ttgacctcaa tgtcaaagta aa 32
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 探针(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcgcactgt aacaatggca gccaaagaga aggtgcctaa ctgg 44
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 探针(Artificial Sequence)
<400> 10
acattgaggt caagtccgac catgaaaacg tccccagtga cagg 44
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 探针(Artificial Sequence)
<400> 11
atacatgagt cgcgtgttag caagacgaga gtcacagcac gcgcc 45
<210> 12
<211> 501
<212> DNA
<213> ISKNV的DNA聚合酶(Infectious spleen and kidney necrosis virus)
<400> 12
gcctgtatgg cgcaaagggg gtgggcacat actttgccgc acgcgtgccc aactacaatg 60
ccatgcgcga tgtacaggag acacagggtg catttaagat acatgagtcg cgtgttagca 120
agacgatgga gttcacagca cgcgccggcc tgccgaccgt tggctggata caggtgtcgc 180
agcgatgtgt ggtgacgcgc actgtaacaa tggcagccaa agagtacatg gtgcctaact 240
ggcgtaccga tgtcaggccg gccccggaca tggagggcgt gccgccggca aagattgttt 300
actttgacat tgaggtcaag tccgaccatg aaaacgtgtt ccccagtgac agggacgacg 360
aggtgatatt tcagataggc ctggtgctgt gtagtggcaa cacggtgctg cgcactgacc 420
ttctctcctt gcccggccgc gattacgacg actctgtgta ccagtacgcc acagaaggcg 480
agctgctgca cgcattcata g 501

Claims (10)

1.一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：4 或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。
2.与权利要求1所述的引物对配合使用的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9 或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针为荧光染料标记的探针，所述荧光染料为SYTO-13，SYTO-82， FAM，FITC, SYBR Green I，SYTO-13，SYTO-82，VIC，HEX，JOE，TAMRA，TET，Cy3 ，ROX，TEXAS-Red或Cy5中的一种。
4.权利要求1所述的特异性引物对、权利要求2所述的探针在制备传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒检测或诊断试剂盒中的应用。
5.一种传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒包括权利要求1所述的引物对和/或权利要求2~3任一项所述的探针。
6.根据权利要求5所述的传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒反应体系包括：重组酶，聚合酶，单链DNA结合蛋白，核酸酶，至少一对引物，一条探针，dNTP、拥挤试剂、重组加载蛋白、能量系统和盐离子。
7.根据权利要求6所述的传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述重组酶选自噬菌体UvsX 蛋白，大肠杆菌recA蛋白的任一种或一种以上的组合。
8.根据权利要求6所述的传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸酶选自核酸外切酶III，核酸内切酶IV或甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶的任一种或一种以上的组合。
9.根据权利要求6所述的传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述拥挤试剂选自聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐或聚蔗糖的一种或一种以上的组合，所述聚乙二醇选自PEG1450，PEG3000，PEG8000，PEG10000，PEG14000， PEG20000，PEG25000，PEG30000，PEG35000或PEG40000中的一种或几种。
10.根据权利要求7所述的传染性脾肾坏死病毒传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述能量系统选自ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶的一种或一种以上的组合。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111850099A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 一种用于检测鼠痘病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法
CN111850162A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心 一种用于检测猴免疫缺陷病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法

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CN110551845B (zh) * 2019-08-12 2023-12-19 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒

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