CN111235232B - 基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用。具体地，本发明的用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视化的检测体系，包括：(a)Cas12a蛋白；(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号。本发明检测体系和检测方法具有快速、灵敏、高特异、裸眼可视化、适合现场快速检测等优点。

Description

基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种靶标核酸分子可视化检测方法及应用。

背景技术

靶标核酸的快速检测对于临床诊断与生物技术应用非常重要，特别是体外分子诊断中。随着核酸分子检测市场的快速发展，对核酸检测技术不断提出新的需求,尤其对现场快速检测提出了新需求。现场快速检测(point-of-care testing,POCT)是在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。现场快速检测POCT技术目前广泛应用于临床检验、慢病监测、应急反恐、灾害医学救援、传染病监测、检验检疫、食品安全、毒品检验等公共卫生领域。

在病原体检测方面，由于每种病原体微生物的核酸分子序列独特，因此需要开发出针对特定物种的核酸分子检测手段。例如针对非洲猪瘟，该病是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、接触性传染病。以高热、内脏器官严重出血和高死亡率为特征，严重危害着养猪产业，造成巨大经济损失。通过核酸检测的方法对疾病进行监控和控制，是目前至关重要的控制方法。

传统核酸检测技术主要采用普通PCR、荧光定量PCR、核酸等温扩增技术(RPA或LAMP)等。而随着对CRISPR核酸内切酶如Cas12或Cas13等“反式切割”活性(transcleavage，或称collateral effect)原理的解析，由此发展了极具革命性的CRISPR检测技术。目前该方法主要是依靠荧光信号来判定检测样品中靶标核酸分子的浓度，检测时依然需借助相关仪器设备，这限制了其开展现场快速检测的需求。

因此，本领域迫切需要开发一种能快速、灵敏、高特异、裸眼可视化的且适用于现场快速检测靶标核酸的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能快速、灵敏、高特异且能满足现场快速检测需求的靶标核酸可视化检测方法。

本发明的另一目的就是提供一种灵敏、高特异、简便且能实现现场快速检测非洲猪瘟病毒核酸的方法与试剂盒及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视化检测体系，所述检测体系包括：

(a)Cas12a蛋白(又称为Cpf1)，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号。

在另一优选例中，所述的可检测信号包括荧光信号，或不需要仪器而直接裸眼可见的信号(即裸眼可视化的信号)。

在另一优选例中，所述的可检测的标记物选自下组：荧光团、生色团、或其组合。

在另一优选例中，所述的报告分子是非特异性的。

在另一优选例中，所述的报告分子是荧光报告分子。

在另一优选例中，所述的核酸探针是单链DNA。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。

在另一优选例中，所述的检测体系还含特异的核酸扩增引物对。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。

在另一优选例中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有：

(e1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；

(e2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；

(e3)任选的用于反转录的反转录酶；

(e4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。

在另一优选例中，所述的(c)核酸探针为ssDNA-reporter单链DNA报告分子。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行修饰改造。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行修饰位于所述(c)核酸探针的5′端、3′端和/或中部。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行修饰为在5′端标记荧光基团HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA、FAM。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行的修饰为在3′端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2、MGBNFQ。

在另一优选例中，所述核酸探针的一端带有标记荧光基团JOE或ROX，而另一端带有淬灭基团BHQ1。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行的修饰为在5′端标记荧光基团JOE或ROX，并在3′端标记淬灭基团BHQ1。

所述的核酸探针是ssDNA-reporter，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5′端标记荧光基团HEX、JOE、TET、ROX、TAMRA、FAM；和/或在3′端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2、MGBNFQ。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的碱基进行的修饰为在5′端标记荧光基团JOE或ROX，并在3′端标记淬灭基团BHQ1，且ssDNA-reporter的碱基长度为12个碱基。

在另一优选例中，所述的核酸探针的结构为5′JOE-N_m-3′BHQ1或5′ROX-N_m-3′BHQ1，

其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5′JOE表示位于5′的JOE，或5′ROX表示位于5′的ROX，而3′BHQ1表示位于3′端的BHQ1；和m为4-20的正整数。

在另一优选例中，所述的ssDNA-reporter的结构为5′JOE-N₁₂-3′BHQ1或5′ROX-N₁₂-3′BHQ1，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5′JOE表示位于5′的JOE，或5′ROX表示位于5′的ROX，而3′BHQ1表示位于3′端的BHQ1。

在另一优选例中，所述的检测体系(或反应体系)中，ssDNA-reporter的浓度为2-200μM，较佳地4-100μM，更佳地5-50μM。

在另一优选例中，所述的检测体系(或反应体系)中，5′JOE-N₁₂-3′BHQ2被作为荧光或裸眼可视化的报告分子使用时，浓度为2-200μM，较佳地4-100μM，更佳地5-50μM。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括基于RNA反转录形成的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括cDNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。

在另一优选例中，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。

在另一优选例中，所述的靶标DNA包括由RNA逆转录或扩增而获得的DNA，如cDNA等。

在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1×10^-9nM-1×10³nM；较佳地1×10^-8nM-1×10²nM。

在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-100拷贝/微升或1-1×10¹⁵拷贝/微升，较佳地1-10拷贝/微升，更佳地1-5拷贝/微升。

在另一优选例中，所述的Cas12a蛋白选自下组：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a。

在另一优选例中，所述的Cas12a蛋白也可选自同一家族同功能蛋白，如Cas12b(又称为C2c1)等。

在另一优选例中，所述的可视化检测体系指激发Cas12a蛋白对ssDNA-reporter的切割活性后，核酸探针发出的阳性信号的发射光为可见光、蓝光或紫外光波长范围内。

在另一优选例中，所述的可视化检测体系用于定性检测或定量检测。

在另一优选例中，所述的检测体系用选自下组的检测平台进行观察：蓝光切胶仪、紫外凝胶成像系统、定量PCR仪、和/或多功能酶标仪。

在另一优选例中，所述的检测体系用荧光检测仪进行观察。

在另一优选例中，所述的检测体系不需要仪器而直接裸眼进行观察

在本发明的第二方面，提供了一种非洲猪瘟病毒核酸分子的检测体系，所述体系包括：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA，并且所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号。

在另一优选例中，所述的检测体系还包括：(d)核酸扩增引物，所述核酸扩增引物为PCR、RPA或LAMP引物对。

在另一优选例中，所述的非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子为p72的DNA扩增产物。

在另一优选例中，所述的(b)sgRNA的序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述的(c)核酸探针为改造的ssDNA-reporter。

在本发明的第三方面，提供了一种非洲猪瘟病毒核酸分子的可视化检测体系，所述体系包含：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号。

在另一优选例中，所述的检测体系还包括：(d)核酸扩增引物，所述核酸扩增引物为PCR、RPA或LAMP引物对。

在另一优选例中，所述的(b)sgRNA的序列如SEQ ID NO.:10所示。

在另一优选例中，所述的(c)核酸探针的结构为5′JOE-N₁₂-3′BHQ1或5′ROX-N₁₂-3′BHQ1，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5′JOE表示位于5′的JOE，或5′ROX表示位于5′的ROX，3′BHQ1表示位于3′端的BHQ1。

在本发明的第四方面，提供了一种非洲猪瘟病毒核酸的非诊断性或诊断性的检测方法，所述检测方法包括：

(a)提供一反应体系，所述反应体系包括：如本发明第三方面所述的检测体系、待测样品和核酸扩增引物，所述的核酸扩增引物用于扩增非洲猪瘟病毒的核酸序列；

(b)对所述反应体系进行核酸扩增，从而获得含扩增产物的反应体系；和

(c)在扩增反应过程之中或之后，检测所述检测探针发出的可检测信号，所述可检测信号为荧光或不需要仪器而直接裸眼可见的信号；

其中，所述特异性检测探针发出的荧光或溶液颜色改变的信号是指所述检测体系中的sgRNA-报告核酸复合探针被Cas蛋白切割，表示所述样本中存在对应的靶标核酸分子；而sgRNA-报告核酸复合探针不被Cas蛋白切割，则表示所述样本中不存在对应的靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的可检测信号为不需要仪器而直接裸眼可见的信号。

在另一优选例中，所述的方法还包括设置一个或多个对照组。

在另一优选例中，所述的对照组包括：p72阳性对照组、p72阴性对照组、p72内标对照组。

在另一优选例中，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。

在另一优选例中，所述的核酸扩增包括PCR、RPA或LAMP。

在另一优选例中，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、或低温PCR。

在另一优选例中，所述的PCR扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的PCR特异性引物对，所述引物对包括：

(P1)p72基因的p72-PCR-F引物：序列如SEQ ID NO:11所示；和

(P2)p72基因的p72-PCR-R引物：序列如SEQ ID NO:12所示。

在另一优选例中，所述的等温扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的LAMP特异性引物对，所述引物对包括：

(P1)p72基因的Asfv-p72-F3引物：序列如SEQ ID NO:19所示；和

(P2)p72基因的Asfv-p72-B3引物：序列如SEQ ID NO:20所示。

(P3)p72基因的Asfv-p72-FIP引物：序列如SEQ ID NO:21所示。

(P4)p72基因的Asfv-p72-BIP引物：序列如SEQ ID NO:22所示。

(P5)p72基因的Asfv-p72-LF引物：序列如SEQ ID NO:23所示。

(P6)p72基因的Asfv-p72-LB引物：序列如SEQ ID NO:24所示。

在另一优选例中，所述的等温扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的RPA特异性引物对，所述引物对包括：

(P7)p72基因的RPA-P72-F引物：序列如SEQ ID NO:25所示。

(P8)p72基因的RPA-P72-R引物：序列如SEQ ID NO:26所示。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有：

(d1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；或

(d2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；

(d3)任选的用于反转录的反转录酶；

(d4)任选的用于转录的转录酶；

(d5)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs；

(d6)用于转录反应的NTPs。

在另一优选例中，在步骤(c)中的检测包括荧光检测法。

在另一优选例中，所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计或者荧光定量PCR仪进行检测。

在另一优选例中，所述的方法是体外检测方法。

在另一优选例中，所述的样本是体外的或离体的样本。

在另一优选例中，所述的方法可以也用于非洲猪瘟病毒核酸的诊断性检测。

在本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有以下组分：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号。

在另一优选例中，所述的组分(a)、(b)和(c)可位于相同或不同的容器中。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(d)用于PCR、RPA或LAMP等温扩增的试剂(如引物、缓冲液等)；

(e)用于作为阳性对照的质粒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了比较不同ssDNA-reporter(报告分子)的碱基修饰方法对荧光可视化检测信号强度的影响。其中图a为5'HEX-N₁₂-3′BHQ1；图b为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1；图c为5'TET-N₁₂-3'BHQ1；图d为5'ROX-N₁₂-3'BHQ2；图e为5'TAMRA-N₁₂-3'BHQ2；图f为5'FAM-N₁₂-3'BHQ1；图g为5'FAM-N₁₄-3'MGBNFQ。注：5'为荧光基团，3'为淬灭基团，N代表A、T、C、G任意四种碱基。蓝光(Bule light)指在蓝光切胶仪中用手机拍摄的图片；紫外光(UV light)指在紫外凝胶成像系统中用手机拍摄的图片；紫外光(凝胶成像系统)(UV light，Gel Imaging System)指在紫外凝胶成像系统中采用数字摄像头和相关软件拍摄的图片。

图2显示了采用PCR扩增和CRISPR-Cas12a相结合的策略检测非洲猪瘟病毒的核酸。使用修饰类型为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1的ssDNA-reporter(报告分子)；ssDNA activator表示sgRNA的互补的单链DNA分子，不含PAM；DNA template代表p72基因PCR扩增的部分片段的PCR产物，其中p72-sgR-1、p72-sgR-2、p72-sgR-3、p72-sgR-4和p72-sgR-5可以靶向PCR扩增的目标基因片段。

图3显示了评估PCR扩增和CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的灵敏度。图A为PCR扩增产物凝胶电泳检测，泳道1：8×10⁷拷贝/微升、泳道2：8×10⁶拷贝/微升、泳道3：8×10⁵拷贝/微升、泳道4：8×10⁴拷贝/微升、泳道5：8×10³拷贝/微升、泳道6：8×10²拷贝/微升、泳道7：8×10¹拷贝/微升、泳道8：4×10¹拷贝/微升、泳道9：2×10¹拷贝/微升、泳道10：8×10⁰拷贝/微升、泳道11：非模板对照组；图B为利用图A中的PCR产物，通过CRISPR-Cas12a进行荧光可视化检测；图C为利用图A中的PCR产物，通过CRISPR-Cas12a在荧光定量PCR仪上进行反应并收集荧光信号。

图4显示了比较5'JOE与HEX修饰，而3'为BHQ1修饰的ssDNA-reporter检测信号强度大小变化。图A为利用蓝光切胶仪检测荧光信号。试管1：8×10³拷贝/微升，试管2：8×10²拷贝/微升，试管3：8×10¹拷贝/微升，试管4：8×10⁰拷贝/微升，试管5：非模板对照组。图B为利用多功能酶标仪检测荧光信号。

图5显示了评估猪基因组DNA对CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的影响。图A为PCR检测单独或混合猪全基因组DNA和pMD18T-p72质粒。泳道1：猪基因组DNA为扩增模板、泳道2：pMD18T-p72质粒A为扩增模板、泳道3：猪基因组DNA和pMD18T-p72质粒(1：1)混合模板、泳道4：非模板对照组。图B为结合CRISPR-Cas12a技术可视化检测。试管1：以猪基因组DNA为模板，试管2：以pMD18T-p72质粒为模板，试管3：以猪基因组DNA和pMD18T-p72质粒(1：1)混合为模板，试管4：非模板对照组。图C为基于CRISPR-Cas12a技术用多功能酶标仪检测荧光信号值，三次重复检测。图D为基于CRISPR-Cas12a技术用荧光定量PCR仪检测荧光信号值：1.以pMD18T-p72质粒为模板，2.以猪基因组DNA和pMD18T-p72质粒(1：1)混合为模板，control指以猪基因组DNA为模板。

图6显示了评估CRISPR-Cas12a技术检测非洲猪瘟病毒的特异性。图A为PCR扩增和凝胶电泳检测评估检测p72基因引物对的特异性；图B为利用CRISPR-Cas12a技术可视化检测。试管1：以pMD18T-p72为模板，试管2：以PRV-Ea的目标基因为模板，试管3：以PRRSV为模板，试管4：以IAV-PR8为模板，试管5：以JEV为模板，试管6：以PDcoV为模板，试管7：NTC(非模板阴性对照)。

图7显示了评估CRISPR-Cas12a酶切反应的特异性。图A为针对不同病毒的目标基因进行PCR扩增；图B为利用CRISPR-Cas12a酶切反应检测不同病毒的目标基因。

图8显示了评估LAMP扩增结合CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的灵敏度。图A为LAMP扩增产物凝胶电泳检测，泳道1：2×10⁴拷贝/微升、泳道2：2×10³拷贝/微升、泳道3：2×10²拷贝/微升、泳道4：2×10¹拷贝/微升、泳道5：2×10⁰拷贝/微升、泳道6：NTC(非模板阴性对照)；图B为利用图A中的LAMP产物，通过CRISPR-Cas12a进行荧光可视化检测。

图9显示了评估LAMP扩增结合CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的最佳反应温度。图A为LAMP在不同反应温度条件下扩增产物凝胶电泳检测，泳道1：57℃、泳道2：59℃、泳道3：61℃、泳道4：63℃、泳道5：65℃、泳道6：67℃、泳道7：非模板对照组；图B为利用图A中的LAMP产物，通过CRISPR-Cas12a进行荧光可视化检测。

图10显示了评估LAMP扩增结合CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的最佳反应时间。图A为LAMP在不同反应时间的扩增产物凝胶电泳检测，泳道1：1min、泳道2：5min、泳道3：10min、泳道4：15min、泳道5：20min、泳道6：30min、泳道7：40min、泳道8：非模板对照组；图B为利用图A中的LAMP产物，通过CRISPR-Cas12a进行荧光可视化检测。其中LAMP的反应温度均为65℃。

图11显示了通过Exo I酶切筛选能用于核酸裸眼可视化检测的最佳ssDNA-reporter。其中图a为5'HEX-N₁₂-3'BHQ1；图b为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1；图c为5'TET-N₁₂-3'BHQ1；图d为5'ROX-N₁₂-3'BHQ2；图e为5'TAMRA-N₁₂-3'BHQ2；图f为5'FAM-N₁₂-3′BHQ1；图g为5′FAM-N14-3′MGBNFQ。注：5′为荧光基团，3′为淬灭基团，N代表A、T、C、G任意四种碱基。Visiblelight表示可见光。

图12显示了摸索ROX-N₁₂-BHQ2报告分子用于核酸裸眼可视化检测非洲猪瘟病毒p72基因的最佳浓度。

图13显示了评估RPA与CRISPR-Cas12a技术结合使用ROX-N₁₂-BHQ2作为报告分子的检测非洲猪瘟病毒p72基因的检测灵敏度。EP管1.2×10⁷拷贝/微升；EP管2.2×10⁶拷贝/微升；EP管3.2×10⁵拷贝/微升；EP管4.2×10⁴拷贝/微升；EP管5.2×10³拷贝/微升；EP管6.2×10²拷贝/微升；EP管7.2×10¹拷贝/微升；

EP管8.2×10⁰拷贝/微升；EP管9.NTC(非模板阴性对照)。

图14显示了评估LAMP与CRISPR-Cas12a技术结合使用ROX-N₁₂-BHQ2作为报告分子的检测非洲猪瘟病毒p72基因的检测灵敏度。EP管1.2×10⁴拷贝/微升；EP管2.2×10³拷贝/微升；EP管3.2×10²拷贝/微升；EP管4.2×10¹拷贝/微升；EP管5.2×10⁰拷贝/微升；EP管6.NTC(非模板阴性对照)。

图15-19显示了对靶向p72基因的5条sgRNA在不同非洲猪瘟病毒毒株中的序列保守性分析。分别为p72-sgR-1、p72-sgR-2、p72-sgR-3、p72-sgR-4和p72-sgR-5。

图20显示了增强CRISPR-Cas12a辅助核酸裸眼可视化检测流程示意图。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明提供了一种能快速、灵敏、高特异且能满足现场快速检测需求的靶标核酸可视化的检测方法。具体地，本发明人首次意外地发现，通过采用经由不同化学修饰的非特异性ssDNA-reporter(报告分子)与特异性的高活性sgRNA结合，用于CRISPR-Cas12a核酸检测时，除了可显著增强荧光可视化检测信号的强度外，还可高灵敏度、高特异性地实现裸眼直接观察靶标核酸分子。由此开发了一种高灵敏、高特异且能实现裸眼直接检测非洲猪瘟病毒核酸的方法。在此基础上完成了本发明。

术语说明

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

非洲猪瘟病毒与p72基因

如本文所用，术语“非洲猪瘟”，指由非洲猪瘟病毒感染而引起的烈性传染病。

非洲猪瘟病毒的p72基因和猪基因组序列可获自公共数据库，例如可从NCBI数据库下载。

CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein)是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制。由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来。该系统能够整合外援侵入宿主的DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(crRNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白(Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等)的编码基因和CRISPR序列组成。而CRISPR序列由一段前导序列(leader)、众多短而保守的重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)组成。重复序列区含有回文序列，能够形成发卡结构。而间隔区就是被宿主俘获的外源DNA序列。这些被俘获的外源DNA序列相当于免疫系统的“异物”，当这些外源的遗传物质再次入侵宿主时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA，与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，引发宿主细胞的自我修复。

根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究和利用最广泛的为2类Ⅱ型，即为CRISPR/Cas9系统。

CRISPR检测通常分为2部分。第一步是目标序列的扩增，具体做法是利用PCR、RT-PCR、RPA、LAMP等技术扩增目的核酸；第二步是Cas蛋白的反式切割反应：在体系中添加一端为荧光发光基团、一端为荧光淬灭基团的非特异的单链DNA或RNA报告分子(ssDNA-reporter或ssRNA-reporter)，在Cas12、Cas13或Cas14/sgRNA结合靶标DNA后，即激发单链DNA或RNA荧光报告分子的切割活性，从而产生游离的荧光发光基团并发出可检测的荧光。

环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术，英文名称为LAMP(loop-mediated isothermalamplification)，能在等温(60-65℃)条件下，短时间(通常是一小时内)内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

CRISPR/Cas12核酸快速检测方法

在本发明中，基于Cas12a蛋白的核酸检测方法包括(例如)：HOLMES(one-HOurLow-cost Multipurpose highly Efficient System)、DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)等。无论是HOLMES还是DETECTR方法均具有极其高效、灵敏和特异的检测活性，可以用来快速检测DNA或RNA病毒、以及单核苷酸多态性。

在本文中，术语“CRISPR-Cas12a辅助核酸检测”，是指利用CRISPR-Cas12a特异识别切割目标基因后，且能非特异切割ssDNA荧光报告分子，借助荧光信号检测系统检测目标核酸分子的技术。

在本文中，术语“Cas12a”(也称“Cpf1”)：为CRISR系统中的核酸内切酶，Cas12a的特征在于兼具顺式和反式单链DNA切割活性。Cas12a非常适合用于核酸快速检测研究。

在本文中，术语“sgRNA”：指能引导靶向特异核酸分子并激活Cas12a切割活性的小向导分子。

在本文中，术语“报告分子”：是指一定长度的单链DNA(ssDNA)，对其5'和3'端的碱基添加荧光基团和淬灭基团，即ssDNA-reporter。其在CRISPR检测系统中的作用在于，当ssDNA被Cas12a非特异性切割后，荧光基团和淬灭基团分离，淬灭基团解除对荧光基团的封闭作用，在特定波长光线照射条件下，借助荧光信号检测设备即可检测到荧光强度变化。

在本文中，术语“裸眼可视化”：是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

本发明的技术方案具有如下主要的有益效果：

1.本发明首次提供了一种能快速、灵敏、高特异且能满足现场快速检测技术需求的靶标核酸可视化检测方法。

2.本发明核心要素除了提供一种基于荧光信号强度强弱或溶液颜色改变来表征靶标核酸浓度的方法，特别是提供了一种不需要仪器而直接裸眼快速检测靶标核酸分子的方法。

3.本发明提供了由此开发了能检测非洲猪瘟病毒核酸的可视化检测技术及试剂盒，其与PCR或RPA扩增技术结合，针对非洲猪瘟病毒核酸的检测灵敏度为40拷贝/微升，能特异区分PRV、PRRSV等病毒的基因。

4.本发明还提供了与LAMP等温扩增结合的检测技术及试剂盒，其针对非洲猪瘟病毒核酸的检测灵敏度可达2拷贝/微升，该策略结合裸眼直接观察，可实现免仪器设备、现场快速可视化检测靶标核酸的目的。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

序列

实施例1：利用核酸外切酶(Exonuclease I)切割ssDNA-reporter评估不同碱基修饰方法对荧光检测信号强度的影响

基于CRISPR-Cas12a技术检测核酸实验主要分为2个步骤：1)扩增目标核酸分子；2)Cas12a酶切反应：在体系中添加一端为荧光发光基团、一端为荧光淬灭基团的非特异ssDNA荧光报告分子，在Cas12/sgRNA复合体结合靶标DNA后，即激发Cas12a蛋白对ssDNA-reporter的切割活性，从而产生游离的荧光发光基团并发出可检测的荧光。为了筛选能增强荧光可视化检测信号强度的碱基修饰方式，组合方式为：5'荧光基团-NNNNNNNNNNNN-3'淬灭基团，N代表A、T、C、G任一种碱基，设计并合成了探针如表1所示。

表1.不同修饰方式的ssDNA-reporter及其特性

先采用核酸外切酶(Exonuclease I,ExoI)切割非特异性ssDNA-reporter，以评估不同碱基修饰方法对荧光检测信号强度的影响。核酸外切酶I具有单链特异性3'→5'核酸外切酶活性，可从ssDNA的3'-OH末端分解生成5′-单核苷酸。对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA及RNA，其可通过80℃，15min的热处理使之失活。20μL反应体系为：Exonuclease I(20U/μL)：1μL；ssDNA-reporter(0.03μM)：0.3μL；10x ExonucleaseⅠBuffer：2μL。反应条件为：37℃，反应30min；98℃，2min终止反应。反应完成后，分别直接在蓝光切胶仪(EP2020可见光透射仪/切胶仪，北京百泰克生物技术有限公司)或紫外凝胶成像仪(培清JS-2012自动对焦凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司)上进行检测。

结果：

检测结果如图1所示：在蓝光或紫外光照射下，不同ssDNA-reporter的背景和荧光强度不同。

在蓝光或紫外光照射下，修饰类型为5′TET-N₁₂-3′BHQ1、5′FAM-N₁₂-3′BHQ1和5′FAM-N₁₄-3′MGBNFQ的ssDNA-reporter，在不同检测条件下，具有不同程度的背景，可能会影响可视化检测的准确度。

在蓝光或紫外光照射下，修饰类型为5′HEX-N₁₂-3′BHQ1与5′TAMRA-N₁₂-3′BHQ2的ssDNA-reporter，荧光强度相对较低，可视化检测信号较弱。

相对而言，在蓝光或紫外光照射下，修饰类型为5′JOE-N₁₂-3′BHQ1或5′ROX-N₁₂-3′BHQ1的ssDNA-reporter，其具有背景较低和荧光检测信号强度相对较高的特点，由此确定其作为增强CRISPR-Cas12a核酸可视化检测信号强度的最佳的ssDNA-reporter。

实施例2：针对检测非洲猪瘟的核酸设计靶向p72基因的特异PCR引物对与sgRNA

从NCBI数据库分别下载非洲猪瘟病毒的p72基因(MK333180)和基因组(AY261366.1)序列。送公司合成p72基因部分片段插入克隆载体中(pMD18T-p72)。利用primer3软件设计扩增p72基因的引物对(表2)；针对PCR扩增区域，利用CRISPR-offinder软件(https://sourceforge.net/projects/crispr-offinder-v1-2/)设计5条sgRNA，PAM为TTTV，以sgRNA空载体(pUC57-T7-sgRNA)为模板设计体外转录用引物对(表2)。利用CRISP-Cas12检测核酸的实验步骤如下：

(1)PCR扩增靶标基因片段：配置50μLPCR反应液，其中Ex taq Mix 25μL，以p72-PCR-F和p72-PCR-R引物各10pmoL，pMD18T-p72模板1μL(约10ng)。PCR反应程序设置为：94℃30s、58℃30s、72℃35s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。

表2.PCR引物与sgRNA体外转录模板扩增用引物对

>pMD18T-p72(MK333180)(载体部分序列)(SEQ ID No.:1)

p72-sgR-5

ATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATT

p72-sgR-4

AAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTC

p72-sgR-3

TTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATT

p72-sgR-1

AAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTC

p72-sgR-2

TTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATT

ACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAG

AATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCT

(双划线为sgRNA序列，波浪线为PAM)

(2)体外转录sgRNA：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold的质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和不同sgRNA-R引物(表2)，利用PCR技术扩增用于sgRNA体外转录用的模板。实验反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，sgRNA空载体(pUC57-T7-sgRNA)的模板为1μL(约10ng)。反应条件为：94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠)进行回收。依据HiScribe^TMQuick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，反应条件为：37℃下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，测定浓度后分装冻存于-80℃长期保存。

>pUC57-T7-sgRNA(载体部分序列)(SEQ ID No.:3)

T7启动子序列

CGAGGGGACGGTGATTGGAGATCGGTACTTCGCGAATGCGTCGAGATGGATCCCTAATACG

sgRNA scaffold：19ntACTCACTATAGGGAATTTCTACTGTTGTAGATAATCGCATTGCCTCCGTAGTGAATTTTTTAAAGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTATCGGATGCCGGGACCGACGAGTGCAGAGGCGTGCAAGCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAA

(3)Cas12a酶切反应：先采用修饰类型为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1的ssDNA-reporter检测p72基因。在20μL反应体系中，加入步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，步骤1中3μL PCR扩增纯化的产物，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，NEB buffer 2.1，0.5μLRNA酶抑制剂。阴性对照设置为不加检测目标基因模板，即不加p72基因扩增产物。阳性对照设置为仅加ssDNA activitor，对应的sgRNA反应引物，如p72-sgR-1R，p72-sgR-2R，p72-sgR-3R，p72-sgR-4R，p72-sgR-5R等作为ssDNA activator替代靶标基因。37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(4)结果检测与判定：直接将含反应液的离心管，置于蓝光切胶仪或紫外凝胶成像仪中检测荧光强度变化。

结果：

结果如图2可见，采用实施例1鉴定的ssDNA-reporter，可明显检测到荧光信号，表明可用于CRISPR-Cas12a核酸检测实验。

比较针对非洲猪瘟病毒p72基因的5条sgRNA，在将ssDNA-activator作为靶基因的模板条件下，发现仅p72-sgR1无明显的荧光。将p72基因的扩增产物作为模板的条件下，p72-sgR5的荧光信号最强，显著优于其他4条sgRNA，这表明此条sgRNA的检测活性最高。

实施例3：评估CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒核酸方法的灵敏度

在本实施例中，进一步评估CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒核酸方法的灵敏度，以稀释不同拷贝数pMD18T-p72质粒为模板，通过PCR扩增后进行CRISPR-Cas12a核酸可视化检测。实验流程如下：

(1)PCR扩增：将pMD18T-p72质粒进行倍比稀释为8×10⁷拷贝/微升、8×10⁶拷贝/微升、8×10⁵拷贝/微升、8×10⁴拷贝/微升、8×10³拷贝/微升、8×10²拷贝/微升、8×10¹拷贝/微升、4×10¹拷贝/微升、2×10¹拷贝/微升、8×10⁰拷贝/微升等，以不同稀释倍数的质粒为模板，以p72-PCR-F和p72-PCR-R为引物，PCR扩增(表1)。具体步骤是反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmol,，模板1μL。按94℃30s、58℃30s、72℃35s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，分别取3μL上述PCR产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。

(2)体外转录制备sgRNA的制备：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和p72-sgR-5R引物，PCR扩增出体外转录的模板。具体步骤是反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，模板1μL(约10ng)。反应程序为：94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为3％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶，将目的条带用天漠胶回收试剂盒回收。用HiScribe^TMQuick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，在37℃，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，测定浓度后分装冻存于-80℃长期保存。

(3)Cas12a酶切反应：在20μL反应体系中，加入步骤1中PCR产物(3μL)，步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，缓冲液为NEB buffer 2.1，0.5μL RNA酶抑制剂。在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(4)结果检测：反应液直接置于蓝光切胶仪或紫外凝胶成像系统中检测，比较使用不同拷贝模板扩增后，荧光可视化检测信号强弱变化，以此判断核酸检测灵敏度。同时，配置好的Cas12反应液，置于荧光定量PCR仪(7500Real-Time PCR System 4345241)中进行反应，设定程序为：37℃，150min，每1.5min自动收集一次荧光信号。

结果：

由图3可见，通过凝胶电泳检测PCR扩增产物，可见PCR扩增和凝胶电泳检测非洲猪瘟病毒p72基因的最低灵敏度为泳道6，对应模板稀释浓度为8×10²拷贝/微升(图3A)；而通过PCR扩增，对PCR产物用Cas12a酶切后，通过蓝光切胶仪或紫外凝胶成像系统检测，其最低灵敏度为8号PCR管，即对应模板稀释浓度为4×10¹拷贝/微升。进一步，将Cas12a酶切反应液置于荧光定量PCR仪中进行反应，基于收集到的荧光信号绘制的曲线图，由图3C可见，随着检测时间的增加，模板浓度高的实验组荧光信号值迅速增大；相对而言，模板浓度低的实验组荧光信号值增加较为平缓。由此设置检测阈值(红线)，可见与图3B结果相同，检测灵敏度可达到4×10¹拷贝/微升。由此可见，CRISPR-Cas12a方法检测灵敏度高，是普通PCR凝胶电泳检测灵敏度的10-100倍；特异性强，特异的sgRNA仅识别扩增出的目标核酸分子才能激活Cas12a的“反式切割”活性，能有效降低假阳性干扰。基于CRISPR-Cas12a的方法也能在荧光定量PCR仪上进行反应，但其检测成本相对较低，是传统荧光定量PCR检测成本的1/3左右。

实施例4：比较ssDNA-reporter的5′端JOE与HEX修饰对荧光可视化检测信号的影响

在实施例3确定的检测灵敏度基础上，分别在2种模板扩增浓度条件(8×10³拷贝/微升和8×10¹拷贝/微升)，进一步比较了ssDNA-reporter的5′端JOE或HEX修饰，即是JOE-N₁₂-BHQ1和HEX-N₁₂-BHQ1，对检测荧光信号强度、灵敏度与背景信号的影响。具体实验流程为如下：

(1)PCR扩增目的片段：将pMD18T-p72质粒进行倍比稀释为8×10³拷贝/微升，8×10²拷贝/微升，8×10¹拷贝/微升和8×10⁰拷贝/微升等。以不同稀释倍数的质粒为模板，以p72-PCR-F和p72-PCR-R为引物(表2)，PCR扩增。具体步骤为：反应体系为50μL，其中ExtaqMix 25μL，上下游引物各10pmol，pMD18T-p72质粒模板1μL。反应程序为：94℃30s、58℃30s、72℃35s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。

(2)sgRNA的体外转录：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和p72-sgR-5R引物(表2)，利用PCR技术扩增出体外转录的模板。具体步骤为：反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，sgRNA空载体为模板1μL(约10ng)。反应程序为：94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为3％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶，将目的条带用天漠胶回收试剂盒回收。用HiScribe^TMQuick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，在37℃条件下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，并分装冻存于-80℃。

(3)Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入步骤1中PCR产物(3μL)，步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM或HEX-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，缓冲液为NEB buffer 2.1，0.5μL RNA酶抑制剂。在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(4)结果检测：在蓝光切胶仪中检测，比较不同拷贝模板扩增后，Cas12反应产物的可视化荧光检测效果，同时用酶标仪读取的相对荧光强度，其中JOE修饰为激发光535nm，发射光556nm；HEX修饰为激发光520nm，发射光548nm。

结果：

如图4A和4B可见，JOE-N₁₂-BHQ1和HEX-N₁₂-BHQ1两种ssDNA-reporter，在相同模板浓度8×10³拷贝/微升条件下，JOE修饰的比HEX的ssDNA-reporter荧光亮点显著高；进一步通过酶标仪测定比较，统计学分析的结果与蓝光切胶仪检测结果一致。而对于检测灵敏度而言，两者检测灵敏度相同。

出乎意料的是，在不同模板浓度下，采用JOE-N₁₂-BHQ1时的背景信号均显著低于采用HEX-N₁₂-BHQ1时的背景信号。

实施例5：评估猪的基因组DNA对CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒特异性的影响

在前述实施例中，检测非洲猪瘟核酸主要使用pMD18T-p72质粒为模板，为了真实模拟临床样本，特别是来自血液或组织样品中，会存在大量猪的基因组DNA。因此，进一步比较混合有猪基因组DNA对检测非洲猪瘟的p72基因特异性的影响。在本实施例中，将猪的基因组DNA、质粒或基因组DNA混合质粒分别作为模板进行实验，流程如下：

(1)提取猪基因组DNA：取猪耳朵组织30mg，将其碾碎后用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取猪的全基因组。

(2)PCR扩增和检测：以步骤1的基因组为模板(10ng)，用引物ZFX-F(5′-TGTGTTGCTTGGTTCTCTGG-3′)和ZFX-R(5′-ACACACACTCTTCAGCCCTT-3′)，PCR扩增染色体X上基因ZFX；以pMD18T-p72质粒为模板，以p72-PCR-F和p72-PCR-R为引物，PCR扩增P72基因。具体步骤是：反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，模板1μL。反应程序：94℃30s、58℃30s、72℃35s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶鉴定。

(3)体外转录sgRNA：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和p72-sgR-5R引物，PCR扩增出体外转录的模板。具体步骤是反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，模板1μL(约10ng)。按94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为3％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶，将目的条带用天漠胶回收试剂盒回收。用HiScribe^TMQuick T7 HighYield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，在37℃条件下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化并分装冻存于-80℃。

Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入步骤1中基因组(100ng)或pMD18T-p72质粒(100ng)或基因组(100ng)混合pMD18T-p72质粒(100ng)，步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，缓冲液为NEB buffer 2.1，0.5μL RNA酶抑制剂。在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(5)结果检测：将Cas12a反应结果置于蓝光切胶仪、或紫外凝胶成像系统、或荧光定量PCR仪、或多功能酶标仪(激发光520nm，发射光548nm)中进行检测。

结果：

如图5A所示，在以猪的基因组DNA、或基因组DNA与pMD18T-p72质粒混合液为模板的反应中，仅猪的内源ZFX基因能被扩增出来；而在以pMD18T-p72质粒，因组DNA与pMD18T-p72质粒混合液为模板的反应中，仅ASFV的p72基因能被扩增出来。由此表明，检测p72的引物对仅针对病毒基因。进一步，通过CRISPR-Cas12a检测方法，如图5B可见，单独以猪的基因组DNA为模板扩增的产物，无法检测到荧光信号；而以pMD18T-p72质粒为模板扩增的产物，可检测到高亮度的荧光信号；以猪的基因组DNA和pMD18T-p72质粒混合为模板扩增的产物，也可检测到高亮度的荧光信号。与通过荧光定量PCR仪和多功能酶标仪(图5C和5D)的结果一致，这表明采用本发明的CRISPR-Cas12a检测方法，检测非洲猪瘟病毒p72基因不受猪基因组DNA干扰。

实施例6：评估CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的特异性

在本实施例中，进一步评估利用CRISPR-Cas12a辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒技术的特异性。主要是测试其是否能区别目前猪中DNA或RNA病毒，设计的实验流程如下：

(1)提取不同病毒基因组DNA或RNA：取PRV、PRRSV、IAV-PR8、JEV和PDcoV病毒感染易感细胞，分别收集上清200μL，用TAKARA病毒基因组提取试剂盒病毒基因组DNA或RNA的提取。

(2)反转录cDNA：将步骤1中提取的RNA病毒，如PRRSV、IAV-PR8、JEV和PDcoV病毒的RNA，分别用TOYOBO反转录试剂盒制备相应的cDNA。

(3)PCR扩增目的基因片段：以质粒pMD18T-p72为模板，以步骤1和步骤2中的PRV基因组以及PRRSV、IAV-PR8、JEV和PDcoV的cDNA为模板，以p72-PCR-F和p72-PCR-R为引物或各自对应的引物，如表3所示，进行PCR扩增。具体步骤是：反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，模板1μL。反应条件为：94℃30s、58℃30s、72℃35s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，各自取3μL PCR产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶鉴定。

表3.PCR引物对

引物名称	引物序列(5′-3′)
		PRV-gE-F	ATGGGCATCGGCGACTACCTG
PRV-gE-R	GCGAGAAGAGCTGCGAGTGGAA
		PRRSV-M-F	CCGACTGCTAGGGCTT
PRRSV-M-R	CTGCCACCCAACACG
		IAV-PR8-F	GAGTTGCAGACCAAGAACTA
IAV-PR8-R	CAAGCGAATCTCTGTAGAGT
		JEV-C-F	GAGCTTGTTGGACGGCAGAG
JEV-C-R	CACGGCGTCGATGAGTGTTC
		PDcoV-N-F	CTACTACTGACGCGTCTTG
PDcoV-N-R	ATTGCCTGTGCCTCTGGAGT

(5)体外转录sgRNA：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和p72-sgR-5R引物，PCR扩增出体外转录的模板。具体步骤是反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，模板1μL(约10ng)。反应条件为：94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为3％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶，将目的条带用天漠胶回收试剂盒回收。用HiScribe^TMQuickT7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，在37℃条件下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化并分装冻存于-80℃。

(6)Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入步骤3中PCR扩增产物3μL，步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，缓冲液为NEBbuffer 2.1，0.5μL RNA酶抑制剂。在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(7)结果检测：Cas12a反应完成后，直接将含有反应液的试管置于蓝光切胶仪、或紫外凝胶成像系统中进行检测。

结果：

先通过凝胶电泳检测PCR扩增的目的片段，如图6A所示，仅以pMD18T-p72质粒为模板能特异检测到特异的目的条带。而在以PRV、PRRSV、IAV-PR8、JEV和PDcoV为模板未检测到电泳条带，表明检测p72基因的引物对特异性高。进一步，通过CRISPR-Cas12a检测，也仅在非洲猪瘟病毒实验组观察到明显的荧光信号。

此外，以病毒编码基因特异引物对扩增对应病毒基因组DNA或cDNA，如图7A可见，对应引物对均可扩增特异目标片段。分别取一定量的PCR产物，进行Cas12a反应，由图7B可见，仅以pMD18T-p72质粒为模板的PCR扩增产物可见较高的荧光信号，说明靶向p72基因的sgRNA序列特异性高。

这些结果表明，基于CRISPR-Cas12a检测非洲猪瘟病毒核酸的检测技术具有高特异性。

实施例7：建立LAMP与CRISPR-Cas12a结合的辅助核酸可视化检测非洲猪瘟病毒的方法

为了提高检测非洲猪瘟病毒的检测灵敏度，特别是能实现现场快速检测，在本实施例中评估了采用LAMP等温扩增与CRISPR-Cas12a相结合来实现辅助核酸可视化检测的策略。

(1)构建LAMP扩增的模板pEASY-T1-p72，针对包含p72-sgR-5的扩增区域，利用PrimerExplorer V5软件(http://primerexplorer.jp/lampv5e/)设计特异的LAMP扩增引物(表4)。

表4.LAMP引物对

>pEASY-T1-p72(载体部分序列，ASFV p72，MK333180)(SEQ ID No.:2)

CCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAG

(双划线为p72-sgR-5序列，波浪线为PAM)

(2)LAMP扩增目的片段：将pEASY-T1-p72质粒进行倍比稀释为2×10⁴拷贝/微升，2×10³拷贝/微升，2×10²拷贝/微升，2×10¹拷贝/微升和2×10⁰拷贝/微升等。以不同稀释倍数的质粒为模板，以表4中的引物对进行LAMP扩增。具体步骤为：1μL Bst 3.0DNAPolymerase(NEB)、2.5μL 10×Isothermal Amplification Buffer、6mM MgSO₄、14mM dNTPMix、2.5μL引物混合液(10×primer：4μL Asfv-p72-FIP/BIP；0.5μL Asfv-p72-F3/B3，1μLAsfv-p72-LF/LB)。反应程序为：65℃，50min；80℃变性，10min。其中评估不同LAMP反应温度和反应时间依据实际需求调整。

(3)sgRNA的体外转录：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold质粒(pUC57-T7-sgRNA)作为模板，用T7-crRNA-F和p72-sgR-5R引物(表2)，利用PCR技术扩增出体外转录的模板。具体步骤为：反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，sgRNA空载体为模板1μL(约10ng)。反应程序为：94℃30s、55℃30s、72℃5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min，将PCR产物在浓度为3％的琼脂糖胶上进行电泳跑胶，将目的条带用天漠胶回收试剂盒回收。用HiScribe^TMQuick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，在37℃条件下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，并分装冻存于-80℃。

(4)Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入步骤2中LAMP产物(3μL)，步骤3中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N₁₂-BHQ1，0.03μM或HEX-N₁₂-BHQ1，0.03μM)，缓冲液为NEB buffer 2.1，0.5μL RNA酶抑制剂。在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

(5)结果检测：在蓝光切胶仪中检测，比较不同拷贝模板扩增后，Cas12反应产物的可视化荧光检测效果，同时用酶标仪读取的相对荧光强度，其中JOE修饰为激发光535nm，发射光556nm；HEX修饰为激发光520nm，发射光548nm。

结果：

先通过凝胶电泳检测LAMP扩增的目的片段，如图8A所示，LAMP检测灵敏度为2×10⁰拷贝/微升。进一步对LAMP产物用Cas12a酶切后，通过蓝光切胶仪或紫外凝胶成像系统检测(图8B)，其最低灵敏度对应模板稀释浓度为2×10⁰拷贝/微升。相对PCR扩增和Cas12a酶切而言(图3)，可见其检测灵敏度升高了20倍。

进一步，比较了不同温度对LAMP反应效率的影响，如图9A所示，LAMP的反应温度在57℃和67℃之间均较高。对LAMP产物用Cas12a酶切后，通过蓝光切胶仪或紫外凝胶成像系统检测(图9B)，可见不同温度条件下荧光强度接近，表明在测试的温度区间温度对LAMP反应效率影响不大。接着，在65℃反应条件，测试不同反应时间，如从1min到40min对LAMP反应产量的影响，如图10A可见，在反应时间为30min时，可见明显的LAMP反应的检测产物，图10B荧光检测结果与凝胶电泳结果一致，表明最低反应时间为30min。

实施例8：建立不需要仪器而直接裸眼快速检测非洲猪瘟病毒核酸分子的方法

在可见光条件下，对7种不同的ssDNA-reporter进行观察，发现不同颜色的探针颜色不同。为此，在本实施例中，继续对将ssDNA-reporter用于裸眼直接检测靶标核酸分子的性能进行测试。

(1)核酸外切酶ExoI酶切反应：20μL反应体系为：Exonuclease I(20U/μL)：1μL；不同的ssDNA-reporter(0.03μM)：0.3μL；10x ExonucleaseⅠBuffer：2μL。反应条件为：37℃，反应30min；98℃，2min终止反应后，在可见光条件下裸眼直接观察反应溶液颜色的变化并进行拍照。

(2)测试不同ROX-N₁₂-BHQ2浓度，对荧光或裸眼直接检测非洲猪瘟病毒核酸分子的影响。Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入载体pMD18T-p72(100ng)，纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，不同浓度核酸探针(ROX-N₁₂-BHQ2)，缓冲液为NEB buffer 2.1在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

检测：在可见光，或蓝光仪和凝胶成像仪中进行荧光信号检测，观察比较不同拷贝模板扩增后荧光或裸眼直接检测的效果。

(3)评估RPA与CRISPR-Cas12a结合进行荧光或裸眼直接检测非洲猪瘟病毒核酸分子的方法的灵敏性。RPA扩增:将公司合成的pEASY-T1-P72质粒进行倍比稀释为2×10⁷拷贝/μL,2×10⁶拷贝/μL,2×10⁵拷贝/μL,2×10⁴拷贝/μL,2×10³拷贝/μL,2×10²拷贝/μL,2×10¹拷贝/μL,2×10⁰拷贝/μL等，以不同稀释倍数的质粒为模板，以P72基因的RPA引物进行扩增。扩增体系为25μL，将每个干粉反应管中加入A Buffer 14.7μL，引物RPA-P72-F和RPA-P72-R各1μL，B Buffe 1.25μL,2.1Buffer 2.5μL，sgRNA 0.5μM，模板1μL，同时将Cas12a(0.25μM)置于管壁上，在37℃反应30min。Cas12a反应：待步骤1反应完成后，瞬离，将管壁上Cas12a离心至管中，混匀后37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

检测：在可见光，或蓝光仪和凝胶成像仪中进行荧光信号检测，观察比较不同拷贝模板扩增后荧光或裸眼直接检测的效果。

(4)评估LAMP与CRISPR-Cas12a结合进行荧光或裸眼直接检测非洲猪瘟病毒核酸分子的方法灵敏性。LAMP扩增：将公司合成的pEASY-T1-P72质粒进行倍比稀释为2×10⁴拷贝/μL,2×10³拷贝/μL,2×10²拷贝/μL,2×10¹拷贝/μL,2×10⁰拷贝/μL等，以不同稀释倍数的质粒为模板，以p72基因的三对LAMP引物进行扩增。扩增体系为25μL，其中8U Bst 3.0，10X Isothermal Amplification Buffer，6mM MgSO4，14mM dNTP Mix,2.5μL引物混合液(10X primer:FIP/BIP 4μL,F3/B3 0.5μL,LF/LB 1μL)，模板1μL。反应条件为：65℃50min，80℃，10min。反应结束后取取3μL扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。Cas12a反应：在20μL反应体系中，加入步骤1中LAMP产物(3μL)，步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ROX-N₁₂-BHQ2，缓冲液为NEB buffer 2.1在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。

检测：在可见光，或蓝光仪和凝胶成像仪中进行荧光信号检测，观察比较不同拷贝模板扩增后荧光或裸眼直接检测的效果。

结果：

先采用ExoI酶切对不同的ssDNA-reporter进行酶切，对比发现图11结果，当5′ROX-N₁₂-3′BHQ2荧光报告分子被ExoI酶切后，裸眼直接可以观察到，反应溶液的颜色从蓝紫色变为紫红色，进而能指示酶切反应。进一步，通过利用Cas12a和sgRNA对含p72基因的质粒(pMD18T-p72)进行酶切，比较了使用不同浓度的ssDNA-reporter对荧光或裸眼直接检测靶标核酸分子的灵敏度的影响。如图12可见，当体系中5′ROX-N₁₂-3′BHQ2荧光报告分子的浓度为1μM时，酶切反应前后溶液颜色变化不明显。但随着5′ROX-N₁₂-3′BHQ2浓度升高后，发现酶切后溶液的颜色从蓝紫色变为紫红色，并且随着荧光报告分子的浓度增加而加强。同时，分别在蓝光和UV条件下，也能明显观察到酶切后的溶液呈现红色。由此可见，将5′ROX-N₁₂-3′BHQ2作为直接裸眼观察的荧光报告分子使用时，建议推荐最低浓度最小为4μM(图12)。

进一步，测试了分别采用RPA与LAMP结合CRISPR-Cas12a，使用5′ROX-N₁₂-3′BHQ2作为荧光报告分子，检测非洲猪瘟病毒p72基因的荧光或直接裸眼检测方法的灵敏度。结果发现，如图13可见，采用RPA结合CRISPR-Cas12a策略，直接裸眼检测的灵敏度为2×10²拷贝/微升，蓝光检测的灵敏度也为2×10²拷贝/微升，采用UV检测可以达到2×10⁰拷贝/微升。随后采用LAMP结合CRISPR-Cas12a策略时，发现裸眼直接检测的灵敏度为2×10⁰拷贝/微升，同时对应采用蓝光和UV检测均达到2×10⁰拷贝/微升。相对而言，采用LAMP与CRISPR-Cas12a结合，进而使用5′ROX-N₁₂-3'BHQ2作为荧光报告分子，不论是荧光还是裸眼直接检测条件下，其检测靶标核酸分子的灵敏度均可达到单拷贝。

实施例9：分析不同sgRNA靶向不同非洲猪瘟病毒毒株的序列保守性

p72基因在不用ASFV毒株中的序列存在碱基变异，而假如碱基变异正好位于sgRNA序列中，可能会降低甚至消除sgRNA的检测活性。为了同时靶向不同来源的非洲猪瘟毒株p72基因的序列保守性，先从NCBI数据下载了38种ASFV毒株的p72基因，它们的登录号分别为：MH766894_AKO62763.1，FR682468_CBW46748.1，MK128995_AYW34053.1，MG939584_AKO62763.1，MG939583_AXZ95856.1，KJ747406_AKO62763.1，KP843857_AKO62763.1，MH681419_AKO62763.1，MG939586_AKO62763.1，MG939585_AKO62763.1，MG939589_AKO62763.1，MK333180_QBH90570.1，MK333181_QBH90755.1，MG939587_AXZ96044.1，LS478113_SPS73505.1，MG939588_AXZ96139.1，AY261363_AKO62763.1，AY261366_AKO62763.1，AY261365_AKO62763.1，AY261364_AKO62763.1，KM102979_AJZ77054.1，KM262845_AIY22431.1，KM262844_AIY22273.1，FN557520_CBH29183.1，AM712240_CAN10431.1，KX354450_AOO54423.1，AM712239_CAN10181.1，KP055815_AKO62763.1，AY261362_AKO62763.1，AY261361_AKO62763.1，MH025919_AXB49827.1，MH025916_AXB49310.1，MH025918_AXB49656.1，MH025917_AXB49484.1，MH025920_AXB50000.1，KM111295_AJL34260.1，AY261360_AKO62763.1，KM111294_AJL34095.1，AY261361_AKO62763.1。利用在线的多序列比对程序clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)，将5种靶向p72基因的sgRNA序列与这些来自不同毒株的序列进行比对。

结果：

图15-19显示了sgRNA序列在不同ASFV毒株中的保守性分析结果，如表5可见，5条sgRNAs的保守性从高到低依次为：p72-sgR-5>p72-sgR-1>p72-sgR-4>p72-sgR-2>p72-sgR-3。

本发明的研究表明，p72-sgR-5的检测活性相对最高(图2)，且其能准确识别38种来自ASFV不同毒株的p72基因(表5)。

表5.sgRNA序列保守性效果比较

讨论

2017年，美国麻省理工学院的张锋教授实验室，利用Cas13a开发了SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)的检测系统。利用该方法，研究人员可灵敏地检测了各种DNA或RNA病毒，包括寨卡病毒、登革热病毒、抗性基因、单核苷酸多态和癌症基因突变等。同年，利用Cas12a蛋白也建立了多种核酸快速检测方法，如HOLMES(one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System)、DETECTR(DNAEndonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)等。无论是HOLMES还是DETECTR方法均具有极其高效、灵敏和特异的检测活性，可以用来快速检测DNA或RNA病毒、以及单核苷酸多态性。然而，目前的检测或需要借助专用的设备或仪器进行检测，无法实现低成本进行裸眼可视化检测靶标核酸的目的。

对ssDNA荧光报告分子的5'端碱基进行HEX修饰，使用Cas12蛋白可实现荧光可视化检测目标核酸靶标，但该方法目前存在检测时发光信号强度较弱的问题，极大降低了肉眼观察检测的效果，可能影响对检测结果的准确判定，甚至误判。

本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用。通过优化，本发明的基于CRISPR-Cas12a的检测体系和检测方法具有快速、灵敏、高特异、直接裸眼可视化的、适合现场快速检测等优点。

图20显示了基于CRISPR-Cas12a系统的快速核酸检测方法技术流程，特别是能实现荧光或裸眼可视化检测靶标分子的策略。其主要步骤包括：样品制备与核酸制备、核酸扩增和核酸检测。而该方法能适用多种核酸检测平台，如：蓝光或紫外照射仪、荧光定量PCR仪与多功能酶标仪等。尤其是还可在可见光条件下，实现不需要仪器而直接裸眼观察靶标核酸分子，将非常适合用于现场快速检测(POCT)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 基于CRISPR-Cas12a系统的可视化快速核酸检测方法及应用

<130> P2019-1936

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 597

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaccacca cgatgaaaaa ctaatgtctg ctcttaaatg gcccattgaa tatatgttta 60

taggattaaa acctacctgg aacatctccg atcaaaatcc tcatcaacac cgagattggc 120

acaagttcgg acatgttgtt aacgccatta tgcagcccac tcaccacgca gagataagct 180

ttcaggatag agatacagct cttccagacg catgttcatc tatatctgat attagccccg 240

ttacgtatcc gatcacatta cctattatta aaaacatttc cgtaactgct catggtatca 300

atcttatcga taaatttcca tcaaagttct gcagctctta catacccttc cactacggag 360

gcaatgcgat taaaaccccc gatgatccgg gtgcgatgat gattaccttt gctttgaagc 420

cacgggagga ataccaaccc agtggtcata ttaacgtatc cagagcaaga gaattttata 480

ttagttggga cacggattac gtggggtcta tcactacggc tgatcttgtg gtatcggcat 540

ctgctattaa ctttcttctt cttcagaacg gttcagctgt gctgcgttac agtacct 597

<210> 2

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccctgaaat acacaacctt tttgtaaaac gcgttcgctt ttcgctgata cgtgtccata 60

aaacgcaggt gacccacacc aacaataacc accacgatga aaaactaatg tctgctctta 120

aatggcccat tgaatatatg tttataggat taaaacctac ctggaacatc tccgatcaaa 180

atcctcatca acaccgag 198

<210> 3

<211> 289

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaggggacg gtgattggag atcggtactt cgcgaatgcg tcgagatgga tccctaatac 60

gactcactat agggaatttc tactgttgta gataatcgca ttgcctccgt agtgaatttt 120

ttaaagggcc cgtcgactgc agaggcctgc atgcaagctt atcggatgcc gggaccgacg 180

agtgcagagg cgtgcaagcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 240

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaa 289

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccctaa tacgactcac tataggg 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatttctact gttgtagat 19

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgataagat tgataccatg agcag 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatcgcattg cctccgtagt ggaa 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taataatagg taacgtgatc gga 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatcggagat gttccaggta gg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagcagaca ttagtttttc a 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtactgta acgcagcaca gc 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ataaccacca cgatgaaaaa ct 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactatagg 19

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgctcatgg tatcaatctt atcgaatcta caacagtaga aat 43

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttccactacg gaggcaatgc gattatctac aacagtagaa at 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccgatcacg ttacctatta ttaatctaca acagtagaaa t 41

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cctacctgga acatctccga tcatctacaa cagtagaaat 40

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaaaaacta atgtctgctc tatctacaac agtagaaat 39

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcggtgttg atgaggatt 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccctgaaat acacaacct 19

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgctcttaaa tggcccattg aatattgatc ggagatgttc cagg 44

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcatcgtggt ggttattgtt ggttttgtaa aacgcgttcg c 41

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtttatagg attaaaacct 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtcacctgcg ttttatggac acg 23

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gccaatctcg gtgttgatga ggattttgat cggag 35

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccatggttta tcccaggagt cattaatgaa atctc 35

Claims (59)

1.一种用于检测靶标核酸分子的荧光或裸眼可视化检测体系，其特征在于，所述检测体系包括：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号；

其中，所述的可检测信号包括荧光信号，或不需要仪器而直接裸眼可见的信号；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子即ssDNA-reporter，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1或BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

2.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述核酸探针的一端带有标记荧光基团JOE，而另一端带有淬灭基团BHQ1。

3.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为2-200 μM。

4.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为4-100 μM。

5.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，ssDNA-报告分子的浓度为5-50 μM。

6.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。

7.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含特异的核酸扩增引物对。

8.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。

9.如权利要求6所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还含有：

(e1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；

(e2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；

(e3)任选的用于反转录的反转录酶；

(e4)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。

10.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的ssDNA-reporter的碱基进行的修饰为在3'端标记淬灭基团BHQ2。

11.如权利要求3所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系中，5'JOE-N₁₂-3'BHQ2被作为荧光或裸眼可视化的报告分子使用时，浓度为2-200 μM。

12.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子包括来源于选自下组的靶标核酸分子：植物、动物、昆虫、微生物、病毒、或其组合。

13.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA包括基于RNA反转录形成的DNA。

14.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA包括cDNA。

15.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。

16.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA是人工合成或天然存在的DNA。

17.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA包括野生型或突变型的DNA。

18.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA包括由RNA逆转录或扩增而获得的DNA。

19.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1×10^-9 nM-1×10³ nM。

20.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1×10^-8 nM-1×10² nM。

21.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-100拷贝/微升。

22.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-1×10¹⁵拷贝/微升。

23.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-10拷贝/微升。

24.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1-5拷贝/微升。

25.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的Cas12a蛋白选自下组：FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a和Lb4Cas12a。

26.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的Cas12a蛋白为选自同一家族同功能蛋白Cas12b。

27.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的可视化检测体系指激发Cas12a蛋白对ssDNA-reporter的切割活性后，核酸探针发出的阳性信号的发射光为可见光、蓝光或紫外光波长范围内。

28.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的可视化检测体系用于定性检测或定量检测。

29.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系用选自下组的检测平台进行观察：蓝光切胶仪、紫外凝胶成像系统、定量PCR仪、和/或多功能酶标仪。

30.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系用荧光检测仪进行观察。

31.如权利要求1所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系不需要仪器而直接裸眼进行观察。

32.一种非洲猪瘟病毒核酸分子的检测体系，其特征在于，所述体系包括：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA，并且所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

33.如权利要求32所述的检测体系，其特征在于，所述的检测体系还包括：(d)核酸扩增引物，所述核酸扩增引物为PCR、RPA或LAMP引物对。

34.如权利要求32所述的检测体系，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子为p72的DNA扩增产物。

35.如权利要求32所述的检测体系，其特征在于，所述的(b)sgRNA的序列如SEQ ID NO:10所示。

36.如权利要求32所述的检测体系，其特征在于，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1。

37.一种非洲猪瘟病毒核酸分子的可视化检测体系，其特征在于，所述体系包含：

(a)Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b)sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于非洲猪瘟病毒p72基因核酸分子；和

(c)核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

38.如权利要求37所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的检测体系还包括：(d)核酸扩增引物，所述核酸扩增引物为PCR、RPA或LAMP引物对。

39.如权利要求37所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的(b)sgRNA的序列如SEQID NO: 10所示。

40.如权利要求37所述的可视化检测体系，其特征在于，所述的(c)核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1。

41.一种非洲猪瘟病毒核酸的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

(a) 提供一反应体系，所述反应体系包括：如权利要求37所述的非洲猪瘟病毒核酸分子的可视化检测体系、待测样品和核酸扩增引物，所述的核酸扩增引物用于扩增非洲猪瘟病毒的核酸序列；

(b) 对所述反应体系进行核酸扩增，从而获得含扩增产物的反应体系；和

(c) 在扩增反应过程之中或之后，检测所述检测探针发出的可检测信号，所述可检测信号为荧光或不需要仪器而直接裸眼可见的信号；

其中，所述特异性检测探针发出的荧光或溶液颜色改变的信号是指所述检测体系中的sgRNA-报告核酸复合探针被Cas蛋白切割，表示所述样本中存在对应的靶标核酸分子；而sgRNA-报告核酸复合探针不被Cas蛋白切割，则表示所述样本中不存在对应的靶标核酸分子；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

42.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的可检测信号为不需要仪器而直接裸眼可见的信号。

43.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的方法还包括设置一个或多个对照组。

44.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的对照组包括：p72阳性对照组、p72阴性对照组、p72内标对照组。

45.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述核酸扩增的方法选自下组：PCR扩增、LAMP扩增、RPA扩增、连接酶链式反应、分支DNA扩增、NASBA、SDA、转录介导扩增、滚环扩增、HDA、SPIA、NEAR、TMA和SMAP2。

46.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的核酸扩增包括PCR、RPA或LAMP。

47.如权利要求46所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR包括高温PCR、常温PCR、或低温PCR。

48.如权利要求45所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的PCR特异性引物对，所述引物对包括：

(P1) p72基因的p72-PCR-F引物：序列如SEQ ID NO: 11所示；和

(P2) p72基因的p72-PCR-R引物：序列如SEQ ID NO: 12所示。

49.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的等温扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的LAMP特异性引物对，所述引物对包括：

(P1) p72基因的Asfv-p72-F3引物：序列如SEQ ID NO: 19所示；和

(P2) p72基因的Asfv-p72-B3引物：序列如SEQ ID NO: 20所示；

(P3) p72基因的Asfv-p72-FIP引物：序列如SEQ ID NO: 21所示；

(P4) p72基因的Asfv-p72-BIP引物：序列如SEQ ID NO: 22所示；

(P5) p72基因的Asfv-p72-LF引物：序列如SEQ ID NO: 23所示；

(P6) p72基因的Asfv-p72-LB引物：序列如SEQ ID NO: 24所示。

50.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的等温扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对p72基因的RPA特异性引物对，所述引物对包括：

(P7) p72基因的RPA-P72-F引物：序列如SEQ ID NO: 25所示；

(P8) p72基因的RPA-P72-R引物：序列如SEQ ID NO: 26所示。

51.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的检测体系还含有用于核酸扩增反应的试剂。

52.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的检测体系还含有：

(d1)用于扩增靶标DNA的聚合酶；或

(d2)用于扩增靶标DNA的等温扩增酶；

(d3)任选的用于反转录的反转录酶；

(d4)任选的用于转录的转录酶；

(d5)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs；

(d6)用于转录反应的NTPs。

53.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，在步骤(c)中的检测包括荧光检测法。

54.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计或者荧光定量PCR仪进行检测。

55.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的方法是体外检测方法。

56.如权利要求41所述的检测方法，其特征在于，所述的样本是体外的或离体的样本。

57.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有以下组分：

(a) Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白是Cas12a或者具有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白；

(b) sgRNA，所述sgRNA引导Cas12a蛋白特异性结合于靶标核酸分子；和

(c) 核酸探针，所述核酸探针含有可检测的标记物，其中当所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割后，产生可检测信号；

其中，所述的可检测的标记物为荧光团；

并且所述的核酸探针是ssDNA-报告分子，并且在所述报告分子的碱基进行修饰为：在5'端标记荧光基团JOE或ROX；和在3'端标记淬灭基团BHQ1、BHQ2；

并且所述的核酸探针是单链DNA；

其中，所述的核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1、5'ROX-N₁₂-3'BHQ1或5'ROX-N₁₂-3'BHQ2，其中，N代表选自A、T、C、G的任一碱基，5'JOE表示位于5'的JOE，5'ROX表示位于5'的ROX，而3'BHQ1表示位于3'端的BHQ1，3'BHQ2表示位于3'端的BHQ2；并且，所述N₁₂的序列为GTATCCAGTGCG；

其中，当所述体系中不存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针不被Cas12a蛋白旁路切割；而当所述体系中存在靶标核酸分子时，则所述核酸探针被Cas12a蛋白旁路切割；

其中“裸眼可视化”是指如果观察荧光信号，需借助荧光检测设备进行检测；而如果是观察溶液的颜色发生改变，则不需要仪器而直接裸眼可视化检测。

58.如权利要求57所述的试剂盒，其特征在于，所述的组分(a)、(b)和(c)可位于相同或不同的容器中；

并且所述的(c)核酸探针的结构为5'JOE-N₁₂-3'BHQ1。

59.如权利要求57所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有：

(d) 用于PCR、RPA或LAMP等温扩增的试剂；

(e) 用于作为阳性对照的质粒。

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