CN112899356B - 一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用，本发明在传统的核酸扩增方法之上，找到灵敏度高的sgRNA，然后根据该位点进行引物设计并改进，获得一组灵敏度高、扩增效果好的特异性引物，然后再结合具有高效、灵敏和特异的CRISPR‑Cas12a核酸内切酶酶切后检测，最终能够实现简便快速、灵敏、高特异、可视化鉴定克隆或基因编辑猪早期胚胎或成纤维细胞的性别；而且本发明的方法对仪器设备要求较低，适用范围广，可作为一种应用方法进行推广。

Description

一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用
【技术领域】
本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用。
【背景技术】
家畜的性别控制是指通过人为干预，使雌性繁殖动物按人们的愿望繁衍所需性别后代的技术，在畜牧业生产中具有重大意义。目前，家畜性别鉴定方法有很多中，主要有细胞遗传学方法、H-Y抗原法、性特异性DNA探针法、PCR法等，主要用于牛、羊或其它经济动物的性别鉴定，经检索有关于克隆猪早期胚胎性别鉴定方法只有双温多重PCR鉴定，使用该方法需要配备的较多的昂贵仪器，且鉴定灵敏性未可知；为此，有必要对现有的检测方法进行改进，以期能获得快速、准确、反应灵敏、高效的非创伤猪胚胎性别检测方法。
【发明内容】
鉴于上述内容，有必要提供一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用，该引物具有灵敏度高，经过CRISPR-Cas12a酶切后再进行可视化反应，有灵敏度高、反应效果好，观测简单的特点，是一种快速、准确、灵敏度高的非创伤检测猪胚胎性别的方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组，所述引物组包括Sry引物组和Zfx引物组：
Sry引物组：
Sry-1引物对：上游外引物序列：5’-gcttctgctatgttcagagt-3’；
下游外引物序列：5’-cctttgatcacgagacca-3’；
上游内引物序列：5’-gtgaggagcctttccccaagaaagcggacgattacagc-3’；
下游内引物序列：5’-tcaaacgatggacgtgaaactagacacaatgaaagcgttcatgg-3’；
上游环引物序列：5’-tttgctgctgtgccgc-3’；
下游环引物序列：5’-ggaagtggtagagagagtggcc-3’；
Zfx引物组：
Zfx-1引物对：上游外引物序列：5’-ggttctctgggaatctca-3’；
下游外引物序列：5’-gacacagattgctggatc-3’；
上游内引物序列：5’-actgcactgaaatatcacccttctcacattctaggattcctcta-3’；
下游内引物序列：5’-tgacagcaccctaggactttgtttcctattagtgagtctgg-3’；
上游环引物序列：5’-tttgactggtcaagcttttcct-3’；
下游环引物序列：5’-gcaaattctcagccccacc-3’。
本发明还包括一种快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，所述试剂盒包含如前述所述引物组；所述试剂盒的的扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为1μL、10×IsothermaLAmpLification Buffer II为2μL、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTP Mix、Sry引物组或Zfx引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL。
进一步的，所述Sry引物组混合液中，Sry-1引物对：Sry-2引物对：Sry-3引物对的质量比为：1:8:2；所述Zfx引物组混合液中，Zfx-1引物对：Zfx-2引物对：Zfx-3引物对的质量比为：1:8:2。
本发明还包括一种应用所述快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组和所述快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒检测猪早期胚胎性别的方法，所述方法为：
(1)采集并提取猪早期胚胎的DNA细胞；
(2)采用如前述 所述的扩增体系和前述 所述的引物组在65℃40min，80℃ 10min的反应条件下扩增得到扩增产物；提取扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定，当琼脂糖电泳检测出Zfx基因阳性、Sry基因阴性时为雌性；当检测出Zfx基因和Sry 基因均未阳性时为雄性。
本发明还包括一种应用所述快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组和所述快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒检测猪早期胚胎性别的可视化检测方法，所述方法为：
(1)采集并提取猪早期胚胎的DNA细胞；
(2)采用如前述 所述的扩增体系和前述 所述的引物组在65℃40min，80℃ 10min的反应条件下扩增得到扩增产物；
(3)然后将步骤(2)获得的扩增产物进行Cas12a酶切反应；反应体系为：0.5μM的纯化的Sry基因或Zfx基因的sgRNA、3μL的步骤(2)的LAMP扩增产物、0.25μM的Cas12a、 300nM的ssDNA-reporter(JOE-N12-BHQ1)、2μL的10x NEB buffer 2.1、以超纯水补足至 20μL；放入定量PCR仪中进行反应，反应条件为：PCR程序设置为37℃，99个循环、每90s 收集一次荧光信号；在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应；
(4)当在蓝光或紫外光下同时检测出Zfx基因和的Sry基因的荧光信号时，证明样本性别为雄性；当检测出Zfx基因的荧光信号，未检测出Sry基因的荧光信号时，证明样本性别为雌性。
进一步的，
所述Sry基因的sgRNA核酸序列为：5’-atttctactgttgtagatcgacggacaatcatagctcaaacg-3’；
所述Zfx基因的sgRNA核酸序列为：5’-atttctactgttgtagataaagtgtgccttggcagcggtgac-3’。
本发明具有如下有益效果：
本发明基于传统的核酸扩增方法上，找到灵敏度高的sgRNA，然后根据该位点进行引物设计并改进，获得一组灵敏度高、扩增效果好的特异性性引物，然后再结合具有高效、灵敏和特异的CRISPR-Cas12a核酸内切酶酶切后检测，最终能够实现简便快速、灵敏、高特异、可视化鉴定克隆或基因编辑猪早期胚胎或成纤维细胞的性别；而且本发明的方法对仪器设备要求较低，适用范围广，可作为一种应用方法进行推广。
【附图说明】
图1为Sry基因扩增的凝胶电泳图；
图2为Sry基因的可视化检测结果图；
图3为Zfx基因扩增的凝胶电泳图；
图4为Zfx基因的可视化检测结果图；
图5为Sry基因的PCR扩增的灵敏性实验图；
图6为Sry基因的PCR扩增和CRISPR-Cas12a可视化检测相结合的可视化检测灵敏性实验图；
图7为基于CRISPR-Cas12a技术检测Sry基因的荧光曲线图；
图中，曲线0为：2×100copies/μL；曲线1为：2×101copies/μL；曲线2为：2×102copies/μL；曲线3为：2×103copies/μL；曲线4为：2×104copies/μL；NTC为：非模板对照组；
图8为扩增引物改进后Sry基因的可视化检测图；
图中，图中试管1为：2×104copies/μL，试管2为：2×103copies/μL，试管3为：2×102copies/μL，试管4为：2×101copies/μL，试管5为：2×100copies/μL，试管6：为NTC非模板对照组；
图9为扩增引物改进后Sry基因的凝胶电泳检测图；
图中，泳道1为：2×104copies/μL，泳道2为：2×103copies/μL，泳道3为：2×102copies/μL，泳道4为：2×101copies/μL，泳道5为：2×100copies/μL，泳道6：为NTC非模板对照组；
图10为扩增引物改进后Sry基因的荧光曲线图；
图中，曲线1：2×104copies/μL，曲线2：2×103copies/μL，曲线3：2×102copies/μL，曲线 4：2×101copies/μL，曲线5：2×100copies/μL，曲线6：为NTC非模板对照组；
图11为性别检测时Zfx基因的凝胶电泳扩增图；
图12为性别检测时Sry基因的凝胶电泳扩增图；
图13为性别检测时CRISPR-Cas12a可视化检测结果图。
【具体实施方式】
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
实施例1：
筛选靶向Sry基因的高活性sgRNA
为了能够确保检测的准确性，同时增强检测的灵敏性，我们首先筛选活性高的sgRNA。分析并找到只针对猪的性别决定基因Sry与猪X染色体连锁基因Zfx序列，选择针对相对保守区域进行PCR扩增。设计扩增Sry及Zfx基因的引物对(表1)；并根据PCR扩增核酸保守区域，分别对两个基因设计2条sgRNA，以sgRNA空载体为模板设计体外转录用引物对 (表1)。利用CRISP-Cas12检测核酸的实验步骤如下：
表1 PCR引物与sgRNA体外转录模板扩增用引物对
引物名称 序列表 引物序列(5'-3') 备注
SRY-F SEQ ID No.:01 tcagagtattgaaagcggacga PCR引物
SRY-R SEQ ID No.:02 tgccggaagcaaattctgtg PCR引物
ZFX-F SEQ ID No.:03 tgtgttgcttggttctctgg PCR引物
ZFX-R SEQ ID No.:04 acacacactcttcagccctt PCR引物
SRY-sgR-1 SEQ ID No.:05 atttctactgttgtagatcgacggacaatcatagctcaaacg sgRNA序列
SRY-sgR-2 SEQ ID No.:06 atttctactgttgtagatacgtccatcgtttgagctatgatt sgRNA序列
ZFX-sgR-1 SEQ ID No.:07 atttctactgttgtagataaagtgtgccttggcagcggtgac sgRNA序列
ZFX-sgR-2 SEQ ID No.:08 atttctactgttgtagatactggtcaagcttttccttagagg sgRNA序列
SRY-sgR-1R SEQ ID No.:09 cgtttgagctatgattgtccgtcgatctacaacagtagaaat 体外转录引物
SRY-sgR-2R SEQ ID No.:10 aatcatagctcaaacgatggacgtatctacaacagtagaaat 体外转录引物
ZFX-sgR-1R SEQ ID No.:11 gtcaccgctgccaaggcacactttatctacaacagtagaaat 体外转录引物
ZFX-sgR-2R SEQ ID No.:12 cctctaaggaaaagcttgaccagtatctacaacagtagaaat 体外转录引物
(1)DNA样本的采集：选用实验室保存的猪全基因组DNA(一公一母)，用Zfx、Sry 基因引物对对全基因组DNA进行PCR扩增后胶回收试剂盒回收Sry基因片段，之后再用 pMDTM18-T载体克隆试剂盒(Takara)进行T-A克隆构建PMD18T-Sry以及PMD18T-Zfx质粒。
质粒构建的具体步骤为：
①用Zfx与Sry基因的特异引物对扩增基因片段：实验体系为50μL，其中Extaq Mix25μL，雌性和雄性基因组DNA(约50ng)，上下游引物各10pmoL。PCR扩增反应程序分别设置为： 94℃30s,51℃30s、72℃30s共进行30个循环，最后72℃延伸5min。
②胶回收：PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠)进行回收。
③连接：连接体系为10μL，其中回收产物(约80ng)，solutionⅠ5μL(TAKARA)，PMDTM-18T载体1μL(TAKARA)，共10μL。反应程序为：16℃30min。④转化。将10μL 连接产物与30μL的感受态(全式金)轻柔混匀，冰上静置5min，42℃90s,冰上静置2min。
⑤涂板：取20μL转化产物均匀涂布到含有氨苄(50mg/ml)的固体LB培养基上，培养箱37℃放置12-16h。
⑥挑菌：挑取单个菌落至含氨苄的700μL液体培养液中(氨苄50mg/ml),摇床摇菌206rpm,4-6h。
⑦测序：取200μL菌液送往公司测序(擎科)，剩余部分暂时保存于4℃。
⑧提质粒：比对测序结果，将测序结果正确的相应菌液样品加入10ml含氨苄的LB液体培养液中，摇床206rpm 12-16h，用小提质粒DNA试剂盒提取质粒(天漠)。
(2)体外转录sgRNA：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold的质粒作为模板，用T7-crRNA-F和不同sgRNA-R引物(Sry-sgR-1R,Sry-sgR-2R)(表1)，利用PCR技术扩增用于sgRNA体外转录用的模板。实验反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，sgRNA空载体的模板为1μL(约10ng)。反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃ 5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠)进行回收。依据HiScribeTM Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，反应条件为：37℃下，反应约12h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，测定浓度后分装冻存于-80℃长期保存。
(3)PCR扩增靶标基因片段：分别以雄性或雌性基因组DNA(约50ng)、PMD-19T-Zfx(雌雄)及PMD-19T-Sry质粒作为模板(约1ng)，Ex taq Mix 25μL，分别用10pmoL Zfx 及Sry基因特异上下游引物扩增上述模板，总体系为50μL。PCR反应程序设置为：94℃30s, 51℃30s、72℃25s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。分别取3μL上述PCR产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。
(4)Cas12a酶切反应:在20μL反应体系中，加入步骤2中纯化的sgRNA (0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，步骤1中提取的质粒DNA 1μL(约10ng)，ssDNA-reporter (JOE-N12-BHQ1)(300nM)，10x NEB buffer 2.1 2μL。阴性对照设置为不加检测目标基因模板，即模板为水。阳性对照设置为仅加1μL ssDNA activitor(对应的sgRNA反向引物)，即 Sry-sgR-1R，Sry-sgR-2R。37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。
(5)结果：用Sry引物对扩增质粒或全基因组DNA后，凝胶电泳结果见图1，图中可见，只有雄性个体及PMD18T-Sry质粒有相应的扩增条带(410bp)，以此确定了我们设计的引物为靶向Sry基因的特异引物，可以用于后续实验。
由于实验过程需要确定一个可用且活性高的sgRNA来增强实验效果。因此，我们对构建好的载体进行CRISPR-Cas12a酶切反应，并将反应结束后的PCR管直接置于蓝光仪或琼脂糖凝胶成像仪中观察；结果如图2所示(图中，试管1为ssDNA activator，即Sry-sgR-1R或Sry-sgR-2R，试管2为PMD-18T-Zfx(female)，试管3为PMD-18T-Zfx(male)，试管4为 PMD-18T-Sry，试管5为非模板对照组)；图中可见：PMD18T-Sry质粒及阳性对照有荧光，说明两个sgRNA都具有特异性。不过从荧光强度来看，Sry-sgR-1组强于Sry-sgR-2组，表明 sgRNA1的活性更高，故筛选sgRNA1作为CRISPR-Cas12a可视化检测Sry基因的sgRNA。
实施例2：
筛选靶向Zfx基因的高活性sgRNA
为了保证检测性别决定基因Sry的准确性，我们应首先确保检测的核酸样品的质量。因此我们选择了雌雄都具有的Zfx基因作为参照基因，同时我们也对靶向Zfx基因的sgRNA进行了筛选。靶向Zfx基因的引物对及sgRNA设计方法见实施例1，设计的序列信息见表1。筛选靶向Zfx基因的sgRNA过程如下：
(1)DNA样本的采集：选用实验室保存的猪全基因组DNA(一公一母)，用Zfx、Sry 基因引物对对全基因组DNA进行PCR扩增后用天漠胶回收试剂盒回收Sry基因片段，之后再用pMDTM 18-T载体克隆试剂盒(Takara)进行T-A克隆构建PMD18T-Sry与PMD18T-Zfx 质粒。
(2)体外转录sgRNA：以含有T7 promoter和sgRNA scaffold的质粒作为模板，用T7-crRNA-F和不同sgRNA-R引物(Zfx-sgR-1R,Zfx-sgR-2R)(表1)，利用PCR技术扩增用于sgRNA体外转录用的模板。实验反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL，上下游引物各10pmoL，sgRNA空载体的模板为1μL(约10ng)。反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃ 5s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天漠)进行回收。依据HiScribeTM Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)合成sgRNAs，反应条件为：37℃下，反应约16h。将转录出的sgRNAs用酚氯仿法纯化，测定浓度后分装冻存于-80℃长期保存。
(3)PCR扩增靶标基因片段：分别以雄性或雌性基因组DNA(约50ng)、PMD-19T-Zfx(雌雄)及PMD-19T-Sry质粒作为模板(约1ng)，Ex taq Mix 25μL，分别用10pmoL Zfx 及Sry基因特异上下游引物扩增上述模板，总体系为50μL。PCR反应程序设置为：94℃30s, 51℃30s、72℃30s，共进行30个循环，最后72℃延伸5min。分别取3μL上述PCR产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。
(4)Cas12a酶切反应:在20μL反应体系中，加入步骤2中纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a (0.25μM)，步骤1中提取的质粒DNA 1μL(约10ng)，ssDNA-reporter (JOE-N12-BHQ1)(300nM)，10x NEB buffer 2.1 2μL。阴性对照设置为不加检测目标基因模板，即模板为水。阳性对照设置为仅加1μL ssDNA activitor(对应的sgRNA反向引物)，即Zfx-sgR-1R，Zfx-sgR-2R。37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。
(5)结果：用Zfx引物对扩增质粒或全基因组DNA后，凝胶电泳结果见图3，只有PMD18T-Sry质粒没有扩增条带，其余均出现了相应条带(596bp)。表明我们的基因组DNA 质量没有问题，所以佐证了结果1真实可靠，同时也说明靶向Zfx引物对具有特异性，可以用于后续实验。
由于实验过程需要筛选出可用且活性高的sgRNA。因此，我们对构建好的载体进行CRISPR-Cas12a酶切反应，并将反应结束后的PCR管直接置于蓝光仪或琼脂糖凝胶成像仪中观察。结果如图4所示(图中，试管1：ssDNA activator，即Zfx-sgR-1R或Zfx-sgR-2R，试管2.PMD-18T-Zfx(female)，试管3：PMD-18T-Zfx(male)，试管4：PMD-18T-Sry，试管5：非模板对照组；由图4的结果可以看出两组sgRNA都只有PMD18T-Zfx质粒及阳性对照有荧光，说明两个sgRNA都具有特异性。不过从荧光强度来看，Zfx-sgR-1组强于Zfx-sgR-2组，表明sgRNA1的活性更高，故筛选Zfx-sgRNA1作为CRISPR-Cas12a可视化检测Zfx基因的 sgRNA。
实施例3：
建立基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a相结合检测Sry基因的方法及灵敏度评估
为了评估基于PCR扩增与CRISPR-Cas12a相结合鉴定猪性别的灵敏度，将雄性全基因组 DNA进行倍比稀释后作为模板进行PCR扩增，扩增后取3μL扩增产物进行CRISPR-Cas12a 可视化检测。具体步骤如下：
(1)DNA样品的采集：用实验室冻存的雄性猪成纤维细胞提取猪全基因组DNA(天根)，对提取的DNA进行倍比稀释，稀释浓度分别为：2×104copies/μL，2×103copies/μL，2×102copies/μL，2×101copies/μL，2×100copies/μL。
(2)PCR扩增：分别以不同稀释倍数的DNA及水为模板，用Sry-F和Sry-R引物进行PCR扩增(表1)。反应体系为50μL，其中Extaq Mix 25μL,上下游引物各10pmol,模板1μL。按94℃30s,51℃30s、72℃30s,共进行30个循环,最后72℃延伸5min，扩增后取3μL扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。
(3)Cas12a酶切反应：在20μL反应体系中，加入步骤2中的扩增产物(3μL),纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N12-BHQ1)300nM，2μL 10x NEBbuffer 2.1。在37℃反应30min，然后98℃2min终止反应。
(4)定量PCR收集荧光值：将步骤2中3μL扩增产物加入CRISPR-Cas12a检测体系后，立即放入定量PCR仪中检测荧光值。定量PCR程序设置为37℃，99个循环。每90s收集一次荧光信号(即一个循环)。
(5)结果如图5-7所示：
从图5的凝胶电泳图可以看出：其检测的极限为2×102拷贝/μL；
从图6的可视化检测图可以看出：经CRISPR-Cas12a可视化检测，发现反应30min后检测灵敏度极限也为2×102拷贝/μL；到2×101拷贝/μL之后，肉眼基本分辨不出荧光
从图7的定量PCR仪实时收集的荧光值来看；随时间延长(约1.5h)可视化检测灵敏度可达到2×101拷贝/μL。说明通过该方法鉴定猪性别灵敏度可以为琼脂糖凝胶电泳检测的1-10 倍，还不能检测出100拷贝/μL，无法达到检测要求。
实施例4：
优化提高灵敏度
根据上一实验结果来看，基于PCR扩增与CRISPR-Cas12a相结合鉴定猪性别的方法灵敏度还不理想，因此我们需要找寻更灵敏的方法，同时还需要精简检测仪器。所以接下来对猪的雄性基因Sry基因的引物进行改进，根据筛选的sgRNA序列设计相应引物进行恒温扩增，引物序列如表2所示。
表2优化的扩增引物对
Figure BDA0002960019870000091
(1)DNA样品的采集：用实验室冻存的雄性猪成纤维细胞提取猪全基因组DNA(天根)，对提取的DNA进行倍比稀释，稀释浓度分别为：2×104copies/μL，2×103copies/μL， 2×102copies/μL，2×101copies/μL，2×100copies/μL。
(2)扩增：分别以不同来源的基因组DNA和水(阴性对照)为模板，分别采用表2所示的Sry引物组和Zfx引物组进行扩增：扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为1μL、10×IsothermaL AmpLification Buffer II为2μL、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTP Mix、Sry引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL；其中，Sry引物组混合液中，Sry-1引物对：Sry-2引物对：Sry-3引物对的质量比为：1:8:2；反应条件为：65℃40min，80℃，10min。反应结束后取3μL扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。
(3)Cas12a酶切反应：在20μL反应体系中，加入步骤(2)中的扩增产物(3μL)，纯化的sgRNA(0.5μM)，Cas12a(0.25μM)，ssDNA-reporter(JOE-N12-BHQ1)300nM，2μL 10x NEBbuffer 2.1。在37℃反应30min，然后98℃2min终止反应。其中，sgRNA为Sry基因的sgRNA，其核酸序列为5’-atttctactgttgtagatcgacggacaatcatagctcaaacg-3’；
(4)定量PCR收集荧光值：将步骤2中3μL扩增产物加入CRISPR-Cas12a检测体系后，立即放入定量PCR仪中检测荧光值。定量PCR程序设置为37℃，99个循环。每90s收集一次荧光信号(即一个循环)。
(5)结果如图8所示，该图为Sry基因的可视化检测图(图中试管1为：2×104copies/μL，试管2为：2×103copies/μL，试管3为：2×102copies/μL，试管4为：2×101copies/μL，试管 5为：2×100copies/μL，试管6：为NTC非模板对照组)，图8中可以看出：反应30min后， 2×100copies/μL在蓝光或紫外光下均有荧光强度；说明其灵敏度可达到2×100copies/μL，灵敏性较PCR扩增增加了100倍，符合检测需求。
同时结合图9的凝胶电泳图(泳道1为：2×104copies/μL，泳道2为：2×103copies/μL，泳道3为：2×102copies/μL，泳道4为：2×101copies/μL，泳道5为：2×100copies/μL，泳道6：为NTC非模板对照组)，观察各泳道发现，1-5均出现了阶梯状条带，而泳道6未发现阶梯状条带。
通过图10，即检测灵敏度极限图；图中为基于CRISPR-Cas12a技术检测Sry基因的荧光曲线图；其中，曲线1：2×104copies/μL，曲线2：2×103copies/μL，曲线3：2×102copies/μL，曲线4：2×101copies/μL，曲线5：2×100copies/μL，曲线6：为NTC非模板对照组；图中显示通过上述引物扩增我们的灵敏度可达到2×100拷贝/μL。
由此可见，采用上述引物进行扩增并结合CRISPR-Cas12a检测可有效排除非特异性污染；应用该方法不仅可增强检测的准确度，同时还能保证检测的灵敏度，是一个核酸检测的优势选择。
实施例5
检测引物对的设计：
如果仅采用猪的雄性特异性基因Sry进行检测并不能很好的保证样本的质量，因此需要结合其连锁基因Zfx基因进行联合检测，以保证Sry基因的准确性，为此，根据实施例4的引物设计思路，分别针对Sry基因和Zfx基因的sgRNA序列设计相应引物进行恒温扩增，引物序列如表3所示：
表3优化的扩增引物对
Figure BDA0002960019870000111
实施例6：
本实施例在实施例5的基础上设计检测试剂盒；试剂盒包括实施例5的检测引物、采用实施例4的反应体系，具体为：
所述试剂盒包含表3的引物组；整个试剂盒的扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为 1μL、10×IsothermaL AmpLification Buffer II为2μL、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTPMix、 Sry引物组或Zfx引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL；其中，Sry引物组混合液中，Sry-1引物对：Sry-2引物对：Sry-3引物对的质量比为：1:8:2；Zfx引物组混合液中，Zfx-1引物对：Zfx-2引物对：Zfx-3引物对的质量比为：1:8:2。
实施例7：
采用实施例5的引物或者实施例6的试剂盒进行性别鉴定的凝胶电泳鉴定方法：
为了确保本发明中的鉴定方法具有可行性，我们应用多个个体(5个)、不同来源基因组DNA(肌肉、耳组织、成纤维细胞、胚胎细胞)进行性别鉴定测试。具体实施步骤如下：
(1)DNA样品的采集：取实验室冻存的雄性猪成纤维细胞(n＝1)及耳样(n＝2)、雌性猪成纤维细胞(n＝1)及肌肉组织(n＝1)提取猪全基因组DNA(天根)；
(2)引物扩增：分别以不同来源的基因组DNA或水为模板，利用表3所示引物对Sry基因和/或Zfx基因进行扩增，扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为1μL、10×IsothermaLAmpLification Buffer II为2μL、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTP Mix、Sry引物组和/或Zfx 引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL；其中，Sry引物组混合液中，Sry-1 引物对：Sry-2引物对：Sry-3引物对的质量比为：1:8:2；Zfx引物组混合液中，Zfx-1引物对：Zfx-2引物对：Zfx-3引物对的质量比为：1:8:2。反应结束后取3μL扩增产物在浓度为1.5％的琼脂糖胶上进行电泳鉴定。鉴定结果如图11、图12所示，其中，图11为Zfx基因的扩增图，图12为Sry基因的扩增图；从两图中可见：Zfx基因扩增后都出现了阶梯状条带，而Sry 基因扩增后仅雄性个体有阶梯状条带。
实施例8：
采用实施例5的引物或者实施例6的试剂盒进行性别鉴定的可视化检测：
(1)DNA样品的采集：取实验室冻存的雄性猪成纤维细胞(n＝1)及耳样(n＝2)、雌性猪成纤维细胞(n＝1)及肌肉组织(n＝1)提取猪全基因组DNA(天根)；
(2)引物扩增：分别以不同来源的基因组DNA或水为模板，利用表3所示引物对Sry基因和/或Zfx基因进行扩增，扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0为1μL、10×IsothermaLAmpLification Buffer II为2μL、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTP Mix、Sry引物组和/或Zfx 引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL；其中，Sry引物组混合液中，Sry-1 引物对：Sry-2引物对：Sry-3引物对的质量比为：1:8:2；Zfx引物组混合液中，Zfx-1引物对：Zfx-2引物对：Zfx-3引物对的质量比为：1:8:2。
(3)Cas12a酶切反应：反应体系为：0.5μM的纯化的Sry基因或Zfx基因的sgRNA、3μL的步骤(2)的LAMP扩增产物、0.25μM的Cas12a、300nM的ssDNA-reporter(JOE-N12-BHQ1)、 2μL的10x NEB buffer 2.1、以超纯水补足至20μL；放入定量PCR仪中进行反应，反应条件为：PCR程序设置为37℃，99个循环、每90s收集一次荧光信号；在37℃反应15min，然后98℃2min终止反应。
(4)定量PCR收集荧光值：将步骤2中3μL扩增产物加入CRISPR-Cas12a检测体系后，立即放入定量PCR仪中检测荧光值。定量PCR程序设置为37℃，99个循环。每90s收集一次荧光信号(即一个循环)。
(5)结果如图13所示，图中可见，雌性个体的仅Zfx基因在蓝光或紫外光下均有荧光强度；而雄性个体的Zfx基因和Sry基因在蓝光或紫外光下均有荧光强度；这与实施例7凝胶电泳的检测结果一致。
综上所述，采用本申请鉴定方法，能有效区分猪的组织样本、胚胎性别，经过条件摸索和引物优化，本申请的扩增方法具有准确性高、灵敏度高的特点，是一种快速、精确的性别检测方法，在性别检测过程中，可视化方法判断结果比凝胶法更为简便，在可视化检测过程中优选为蓝光仪检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广西扬翔股份有限公司
华中农业大学
<120> 一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 1
tcagagtatt gaaagcggac ga 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 2
tgccggaagc aaattctgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 3
tgtgttgctt ggttctctgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 4
acacacactc ttcagccctt 20
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 5
atttctactg ttgtagatcg acggacaatc atagctcaaa cg 42
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 6
atttctactg ttgtagatac gtccatcgtt tgagctatga tt 42
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 7
atttctactg ttgtagataa agtgtgcctt ggcagcggtg ac 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 8
atttctactg ttgtagatac tggtcaagct tttccttaga gg 42
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 9
cgtttgagct atgattgtcc gtcgatctac aacagtagaa at 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 10
aatcatagct caaacgatgg acgtatctac aacagtagaa at 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 11
gtcaccgctg ccaaggcaca ctttatctac aacagtagaa at 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 12
cctctaagga aaagcttgac cagtatctac aacagtagaa at 42
<210> 13
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<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 13
gcttctgcta tgttcagagt 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 14
cctttgatca cgagacca 18
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 15
gtgaggagcc tttccccaag aaagcggacg attacagc 38
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 16
tcaaacgatg gacgtgaaac tagacacaat gaaagcgttc atgg 44
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 17
tttgctgctg tgccgc 16
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 18
ggaagtggta gagagagtgg cc 22
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 19
ggttctctgg gaatctca 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 20
gacacagatt gctggatc 18
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 21
actgcactga aatatcaccc ttctcacatt ctaggattcc tcta 44
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 22
tgacagcacc ctaggacttt gtttcctatt agtgagtctg g 41
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 23
tttgactggt caagcttttc ct 22
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪属猪(Sus scrofa)
<400> 24
gcaaattctc agccccacc 19

Claims (4)

1.一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组，其特征在于，所述引物组包括Sry引物组和Zfx引物组：
Sry引物组：
Sry-1引物对： 上游外引物序列：5’-gcttctgctatgttcagagt-3’；
下游外引物序列：5’-cctttgatcacgagacca-3’；
上游内引物序列：5’-gtgaggagcctttccccaagaaagcggacgattacagc-3’；
下游内引物序列：5’-tcaaacgatggacgtgaaactagacacaatgaaagcgttcatgg-3’；
上游环引物序列：5’-tttgctgctgtgccgc-3’；
下游环引物序列：5’-ggaagtggtagagagagtggcc-3’；
Zfx引物组：
Zfx-1引物对： 上游外引物序列：5’-ggttctctgggaatctca-3’；
下游外引物序列：5’-gacacagattgctggatc-3’；
上游内引物序列：5’-actgcactgaaatatcacccttctcacattctaggattcctcta-3’；
下游内引物序列：5’-tgacagcaccctaggactttgtttcctattagtgagtctgg-3’；
上游环引物序列：5’-tttgactggtcaagcttttcct-3’；
下游环引物序列：5’-gcaaattctcagccccacc-3’。
2.一种快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述引物组；所述试剂盒的扩增体系为25μL，其中8U的Bst 3.0 为1μL、10 × IsothermaLAmpLification Buffer II为2μL 、6mM的MgSO4、1.4mM的dNTP Mix、Sry引物组或Zfx引物组混合液2.5μL、模板1μL、以超纯水补足至25μL。
3.一种应用如权利要求1所述快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组和权利要求2所述快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒检测猪早期胚胎性别的方法，其特征在于，所述方法为：
（1）采集并提取猪早期胚胎的DNA；
（2）采用如权利要求2所述的扩增体系和权利要求1所述的引物组在65℃ 40min，80℃10 min的反应条件下扩增得到扩增产物；提取扩增产物在浓度为1.5%的琼脂糖胶上进行电泳鉴定，当琼脂糖电泳检测出Zfx基因阳性、Sry基因阴性时为雌性；当检测出Zfx基因和Sry基因均为阳性时为雄性。
4.一种应用如权利要求1所述快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组和权利要求2所述快速鉴定猪早期胚胎性别的试剂盒检测猪早期胚胎性别的可视化检测方法，其特征在于，所述方法为：
（1）采集并提取猪早期胚胎的DNA；
（2）采用如权利要求2所述的扩增体系和权利要求1所述的引物组在65℃ 40min，80℃10 min的反应条件下扩增得到扩增产物；
（3）然后将步骤（2）获得的扩增产物进行Cas12a酶切反应；反应体系为：0.5μM的纯化的Sry基因或Zfx基因的sgRNA、3μL的步骤（2）的扩增产物、0.25μM的Cas12a、300nM的ssDNA-reporter、2μL的10 x NEB buffer 2.1 、以超纯水补足至20μL；放入定量PCR仪中进行反应，反应条件为：PCR程序设置为37℃，99个循环、每90s收集一次荧光信号；在37℃反应15min，然后98℃ 2min终止反应；所述ssDNA-reporter的结构为JOE-N12-BHQ1；
（4）当在蓝光或紫外光下同时检测出Zfx基因和的Sry基因的荧光信号时，证明样本性别为雄性；当检测出Zfx基因的荧光信号，未检测出Sry基因的荧光信号时，证明样本性别为雌性；
所述Sry基因的sgRNA核酸序列为：5’-atttctactgttgtagatcgacggacaatcatagctcaaacg-3’；所述Zfx基因的sgRNA核酸序列为：5’-atttctactgttgtagataaagtgtgccttggcagcggtgac-3’。
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GR01 Patent grant
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