CN112442541A - 一种鸡性连锁矮小基因的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡性连锁矮小基因的检测方法。本发明提供了用于检测鸡性连锁矮小基因的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；所述引物1为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列A和SEQ ID No.1的第22‑42位的单链DNA；所述引物2为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列B和SEQ ID No.2的第22‑46位的单链DNA；所述引物3为SEQ ID No.3所示的单链DNA。本发明KASP引物能对鸡的性连锁矮小基因进行准确基因型鉴定，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，对于通过在地方鸡种中引入性连锁矮小基因，进行矮小型配套系的选育和开发具有重要的生产和研究意义。
Description
技术领域
本发明涉及动物遗传育种分子标记辅助选择技术领域，特别涉及一种鸡性连锁矮小基因的检测方法。
背景技术
鸡性连锁矮小基因(dw基因)是已知的8种矮小基因中被认为是唯一对鸡本身的健康无害，对人类有利的隐性、伴性突变基因，引起广泛关注并应用于实际生产之中。dw基因能够抑制鸡生长发育，成年母鸡体重减轻30％，成年公鸡体重减轻40％，胫骨缩短1/3左右。由于矮小鸡具有基础代谢率低、耗料少、饲养密度大、适应性和抗应激强等优势，通过在地方鸡种中引入矮小基因，进行矮小型配套系的选育和开发具有重要的生产和研究意义。
但矮小型纯合子、矮小型杂合子与正常型个体在幼龄时无法通过体型、外貌进行区分，需至8周龄左右时通过体重、胫长等指标加以区分矮小型纯合子鸡(ZdwZdw)与正常型鸡(ZDwZDw和ZDwZdw)。此外，对于正常型杂合子鸡(ZDwZdw)与正常型纯合子鸡(ZDwZDw)在成年鸡中也不能通过体尺外貌加以准确区分。
鸡GHR基因定位在Z染色体短臂上，共编码608个氨基酸(包括16个氨基酸的信号肽)，其中外显子1长度不一，调控转录的起始；翻译起始位点位于外显子2上，该外显子编码前体蛋白的信号肽；cGHR基因缺少外显子3(和人的GHR基因比较)；外显子4～7编码GHR蛋白的细胞外结构域；外显子8编码蛋白的跨膜结构域；外显子9～10编码细胞内结构域。缺失突变是目前导致矮小鸡的主要原因之一，Agarwal(1994)发现正常鸡中的一个6.0kb的条带在矮小鸡中被一个4.3kb的条带取代。并认为这1.7kb的缺失是导致矮小鸡的原因，这一缺失出现在外显子10区和3’UTR区。国内李宁等(1997)对GRH基因进行了克隆，对其5’端部分序列进行了分析，并对矮小鸡GHR基因位点进行了多态性分析，发现在其3’端的一段6.0kb的区域中，矮小鸡仅为4.1kb。
目前通过分子生物学方法进行的检测主要是在生长素受体(GHR)基因缺失片段两端设计特异性引物进行扩增，但由于该基因缺失片段较长，使得模板DNA对引物形成竞争，导致杂合子中只能检测到缺失后的片段而检测不到完整的片段，从而难以准确鉴定杂合子公鸡与正常公鸡。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡性连锁矮小基因的检测方法。
第一方面，本发明要求保护一种用于检测鸡性连锁矮小基因的KASP引物。
本发明所要求保护的用于检测鸡性连锁矮小基因的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列A和SEQ ID No.1的第22-42位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物2为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列B和SEQ ID No.2的第22-46位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物3为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA。
进一步地，所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一可为荧光序列FAM，另一可为荧光序列HEX。
第二方面，本发明要求保护一种用于检测鸡性连锁矮小基因的试剂盒。
本发明所要求保护的用于检测鸡性连锁矮小基因的试剂盒含有前文所述的KASP引物。
进一步地，所述试剂盒中还可含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B。
所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。
所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。
更进一步地，所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一可为FAM(对应于所述荧光序列FAM)，另一可为HEX(对应于所述荧光序列HEX)；所述荧光淬灭基团为BHQ。
第三方面，本发明要求保护一种检测或辅助检测鸡的性连锁矮小基因的基因型的方法。
本发明所要求保护的检测或辅助检测鸡的性连锁矮小基因的基因型的方法，可包括如下步骤：以所述待测鸡的基因组DNA为模板，采用前文所述试剂盒中的所述KASP引物进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测鸡的性连锁矮小基因的基因型：
若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因纯合子，记为oo基因型；
若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为非性连锁矮小基因纯合子，记为OO基因型；
若所述PCR产物显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因杂合子，记为Oo基因型。
在本发明的具体实施方式中，上述第一方面中所述特异荧光序列A具体为荧光序列FAM；所述特异荧光序列B具体为荧光序列HEX；所述荧光序列FAM具体为SEQ ID No.1的第1-21位；所述荧光序列HEX具体为SEQ ID No.2的第1-21位(即所述KASP引物具体为由SEQID No.1所示的单链DNA分子、SEQ ID No.2所示的单链DNA分子和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物)。相应的，在第二方面中所述荧光报告基团A具体为FAM，所述荧光报告基团B具体为HEX。
相应的，在第三方面中的所述方法A中，若所述PCR产物显示蓝色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因纯合子(即oo基因型)；若所述PCR产物显示红色，则所述待测鸡为非性连锁矮小基因纯合子(即OO基因型)；若所述PCR产物显示绿色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因杂合子(即Oo基因型)。
第四方面，本发明要求保护一种培育具有目标性状的矮小鸡的方法。
本发明所要求保护的培育具有目标性状的矮小鸡的方法，可包括如下步骤：采用不具所述目标性状、通过前文所述的方法检测得到的性连锁矮小基因为oo基因型的矮小鸡作为供体亲本，采用具有所述目标性状的鸡作为轮回亲本，进行回交，并将回交后代进行自交，从自交后代中获得具有所述目标性状、通过前文所述的方法检测得到的性连锁矮小基因为oo基因型的矮小鸡。
第五方面，本发明要求保护如下任一应用：
(A1)前文第一方面所述KASP引物或前文第二方面所述试剂盒在检测或辅助检测鸡的性连锁矮小基因的基因型中的应用；
(A2)前文第一方面所述KASP引物或前文第二方面所述试剂盒或前文第三方面和第四方面所述方法在鸡的遗传育种中的应用；
(A3)前文第一方面所述KASP引物或前文第二方面所述试剂盒或前文第三方面和第四方面所述方法在鸡的矮小型配套系的选育中的应用；
(A4)前文第一方面所述KASP引物或前文第二方面所述试剂盒或前文第三方面所述方法在培育具有目标性状的矮小鸡中的应用。
实验证明，本发明所提供的KASP引物能够对鸡的性连锁矮小基因进行准确的基因型鉴定，本发明可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率。本发明对于通过在地方鸡种中引入性连锁矮小基因，进行矮小型配套系的选育和开发具有重要的生产和研究意义。
附图说明
图1为30只哈勃德白羽肉鸡的性连锁矮小基因的基因型检测结果。
图2为60只黄羽肉鸡的性连锁矮小基因的基因型检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、KASP法检测鸡性连锁矮小基因
本实施例是通过对性连锁矮小基因和非性连锁矮小基因的核苷酸序列比对后设计KASP引物，FAM标记的引物1与性连锁矮小基因特异匹配，HEX标记的引物2与非性连锁矮小基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。FAM标记的引物1与性连锁矮小基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为性连锁矮小基因纯合子，记为oo；HEX标记的引物2与非性连锁矮小基因特异匹配后扩增，仅检测到HEX荧光即为非性连锁矮小基因纯合子，记为OO；如果同时检测到FAM和HEX信号，则为非性连锁矮小基因杂合子，记为Oo。
一、KASP引物
引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCCTTGTGCTCAATGCAAAC-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光序列FAM)；
引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTTCTTACTCTGTTTCTATTGCCA-3’(SEQ IDNo.2，下划线部分为特异荧光序列HEX)；
引物3：5’-GCGAATAATGGCTTGTGTGAC-3’(SEQ ID No.3)。
上述SEQ ID No.1所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增性连锁矮小基因的片段。
上述SEQ ID No.2所示的单链DNA分子与SEQ ID No.3所示的单链DNA分子扩增非性连锁矮小基因的片段。
二、性连锁矮小基因的基因型检测方法
提取待测鸡的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用上述引物组(SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3)进行PCR扩增。
PCR扩增体系如下：模板DNA 2.5μl，2×KASP reaction mix 2.5μl，三条引物混合物0.07μl。
其中，2×KASP reaction mix为LGC公司产品(货号为LGC-KBS-1016-002)。2×KASP reaction mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等组成。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGG TCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACT CCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。
PCR扩增程序为：94℃ 15min；94℃ 20s，61-55℃(每次循环降0.6℃)60s，10个循环；94℃ 20s，55℃ 60s，26个循环。
将得到的PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据，仅显示蓝色图像(近X轴，对应FAM荧光)则所述待测鸡为性连锁矮小基因纯合子(即oo基因型)；仅显示红色图像(近Y轴，对应HEX荧光)则所述待测鸡为非性连锁矮小基因纯合子(即OO基因型)；显示绿色图像(同时检测到FAM和HEX信号)则所述待测鸡为性连锁矮小基因杂合子(即Oo基因型)。
三、实际应用
1、30只哈勃德白羽肉鸡检测及结果判定
采用步骤二的方法检测30只哈勃德白羽肉鸡的性连锁矮小基因的基因型。
经检测30只哈勃德白羽肉鸡全部为仅检测到FAM荧光(近X轴，蓝色图像)，为性连锁矮小基因纯合子(即oo基因型)。如图1所示。该检测结果全部与性状相符(oo基因型表现为胫骨缩短1/3左右)。
2、60只黄羽肉鸡检测及结果判定
采用步骤二的方法检测60只黄羽肉鸡的性连锁矮小基因的基因型。
经检测60只黄羽肉鸡中，30只为仅检测到FAM荧光(近X轴，蓝色图像)，为性连锁矮小基因纯合子(即oo基因型)。30只为仅检测到HEX荧光(近Y轴，红色图像)，为非性连锁矮小基因纯合子(即OO基因型)。如图2所示。该检测结果全部与性状相符(oo基因型表现为胫骨缩短1/3左右；OO基因型胫部表现正常)。
<110> 北京康普森农业科技有限公司
<120> 一种鸡性连锁矮小基因的检测方法
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Claims (10)
1.用于检测鸡性连锁矮小基因的KASP引物，由引物1、引物2和引物3组成；
所述引物1为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列A和SEQ ID No.1的第22-42位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物2为自5’端到3’端依次为特异性荧光序列B和SEQ ID No.2的第22-46位核苷酸所示的单链DNA；
所述引物3为核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的KASP引物，其特征在于：所述特异荧光序列A和所述特异荧光序列B，其一为荧光序列FAM，另一为荧光序列HEX。
3.根据权利要求2所述的KASP引物，其特征在于：所述荧光序列FAM的核苷酸序列为SEQID No.1的第1-21位；所述荧光序列HEX的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-21位。
4.根据权利要求3所述的KASP引物，其特征在于：所述引物1为核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示的单链DNA；所述引物2为核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
5.用于检测鸡性连锁矮小基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-4中任一所述的KASP引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；
所述荧光探针A为与所述特异荧光序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；
所述荧光探针B为与所述特异荧光序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光报告基团A和所述荧光报告基团B，其一为FAM，另一为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。
8.一种检测或辅助检测鸡的性连锁矮小基因的基因型的方法，包括如下步骤：以所述待测鸡的基因组DNA为模板，采用权利要求5-7中任一所述试剂盒中的所述KASP引物进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，然后按照如下确定所述待测鸡的性连锁矮小基因的基因型：
若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因纯合子，记为oo基因型；
若所述PCR产物仅显示SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为非性连锁矮小基因纯合子，记为OO基因型；
若所述PCR产物显示SEQ ID No.1所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子5'端连接的特异荧光序列对应的荧光报告基团的颜色，则所述待测鸡为性连锁矮小基因杂合子，记为Oo基因型。
9.一种培育具有目标性状的矮小鸡的方法，包括如下步骤：采用不具所述目标性状、通过权利要求8所述的方法检测得到的性连锁矮小基因为oo基因型的矮小鸡作为供体亲本，采用具有所述目标性状的鸡作为轮回亲本，进行回交，并将回交后代进行自交，从自交后代中获得具有所述目标性状、通过权利要求8所述的方法检测得到的性连锁矮小基因为oo基因型的矮小鸡。
10.如下任一应用：
(A1)权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-7中任一所述的试剂盒在检测或辅助检测鸡的性连锁矮小基因的基因型中的应用；
(A2)权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-7中任一所述的试剂盒或权利要求8或9所述的方法在鸡的遗传育种中的应用；
(A3)权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-7中任一所述的试剂盒或权利要求8或9所述的方法在鸡的矮小型配套系的选育中的应用；
(A4)权利要求1-4中任一所述的KASP引物或权利要求5-7中任一所述的试剂盒或权利要求8所述的方法在培育具有目标性状的矮小鸡中的应用。
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2019
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