CN110157811B

CN110157811B - 一种与猪背膘厚关联的ghr基因内sine转座子多态分子标记、检测方法及应用

Info

Publication number: CN110157811B
Application number: CN201910409360.XA
Authority: CN
Inventors: 陈才; 宋成义; 郑尧; 顾浩; 王宵燕; 高波; 沈丹; 王赛赛; 王亚丽; 李奎
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110157811A

Abstract

本发明公开了一种与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记、检测方法及应用。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自GHR基因，该序列的200到493位点存在一个反向SINE转座子的插入多态性位点，该位点表现为SINE^+/+、SINE^+/‑或SINE^‑/‑三种基因型，纯合插入基因型（SINE^+/+）的个体背膘厚显著小于纯合无插入基因型（SINE^‑/‑）的个体。本发明的GHR基因内SINE转座子多态分子标记可以用于家系选育的早期选择，也可在选配中提供分子依据。将会对背膘性状的选育提供强有力的辅助作用，加快育种进程，减少育种成本。本发明的GHR基因内SINE转座子多态分子标记为筛选猪的背膘厚提供了新的方法。

Description

一种与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记、检测方法及应用

技术领域

本发明属于动物遗传育种领域，同时涉及生物信息学及分子生物学领域，具体涉及一种与猪背膘厚相关的GHR基因内SINE转座子多态分子标记、其获取方法及应用。

背景技术

在猪基因组中，反转录转座子是基因组的主要组成成分，占猪基因组中的37.10％，占重复序列的91.49％。由于转座子在基因组中的高覆盖率以及它们具有移动的能力，从而认为转座子是基因组结构变异的重要贡献者，并可能在多个水平上影响宿主基因的活性。已有超过100种反转录转座子介导的插入导致了人类遗传疾病的报道(Hancksand Kazazian，Roles for Retrotransposon Insertions in Human Disease.2016)。在动物身上已经观察到许多由转座子插入引起的表型变化，例如SINE插入引起的体型变化和狗的毛色变化(Gray et al.The IGF1Small Dog Haplotype Is Derived from MiddleEastern Grey Wolves.2010；Clark et al.Retrotransposon Insertion in SILV IsResponsible for Merle Patterning of the Domestic Dog.2006；Murphy et al.2018)，以及ERV插入引起鸡的蛋壳颜色变化(Wang et al.An EAV-HP Insertion in 5′FlankingRegion of SLCO1B3Causes Blue Eggshell in the Chicken.2013)。在猪中也观察到两例因L1插入引起的性状变化(Giuffra et al.A Large Duplication Associated withDominant White Color in Pigs Originated by Homologous Recombination betweenLINE Elements Flanking KIT.2002；Sironen et al.L1Insertion within SPEF2Gene IsAssociated with Increased Litter Size in the Finnish Yorkshire Population2012)。

转座子插入多态(Transposon insertion polymorphism，TIP)揭示的是一个位点上的不同等位状态(即转座子的插入和缺失)，产生共显性标记。这种标记可以对特定位点有无转座子的插入进行检测，只需基因组为模板，不需要酶切、加接头等处理，利于自动化操作，特别适合大量样品的分析。TIP分子标记具有理想分子标记的诸多优点：如多态性高、共显性、基因组分布广泛、检测手段简单快速、重复性好和开发成本低等，同时检测结果带型特定、清楚便于判定，具有很高的应用价值。可应用于猪的分子辅助育种以及遗传进化分析等方面的研究。

背膘厚是家猪重要的经济性状，与瘦肉率具有高度相关性，已成为家猪育种的重要选择性状。生长激素受体基因(GHR)通过与生长激素基因(GH)共同作用对动物的生长发育及代谢产生影响，有研究表明GHR基因发生突变会引发矮小性状的产生(张清峰,许尚忠.牛GHR10基因HindⅢ酶切多态性与体尺、体重指标的相关性分析，2009)。但目前对GHR基因中是否存在的转座子插入多态的研究以及对背膘厚的影响未见报道，本发明结合课题组已有的转座子插入多态分子标记挖掘技术，在GHR基因中找到一个SINE转座子的插入多态，通过在大白猪群体中进行验证发现，此分子标记与猪的背膘厚具有显著相关性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记、检测方法及应用，通过寻找与猪背膘厚相关的转座子插入多态位点作为分子标记，并将其应用于猪的背膘厚性状的选育中，加快育种进程。

为了实现上述发明目的，本发明的的技术方案如下：

一种与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记，所述分子标记的核昔酸序列如SEQ ID NO:1所示，该核苷酸序列的第200到493位点存在一个反向SINE转座子的插入多态性位点(即插入多态性位点为SEQ ID NO:1第200到493位点的序列)，该位点为存在SINE序列的插入和缺失的不同状态。

所述的GHR基因内SINE转座子多态分子标记来自GHR基因ENSSSCG00000016866的第102258到102951位点。

一种获取前述的与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记的方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据SEQ ID NO:1中反向SINE转座子插入多态性位点两侧的序列设计PCR扩增引物；

(2)以待检测猪个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果判定基因型；

(4)将不同基因型与猪背膘厚性状进行关联分析，从而获取所述GHR基因内SINE转座子多态分子标记。

需要进一步说明的，步骤(2)中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。且不仅限于这对引物，以SEQ ID NO:1中第200到493位点构成的反向SINE转座子插入多态性位点两侧的的引物设计PCR引物均可。

步骤(3)中，所述基因型为SINE^+/+、SINE^+/-或SINE^-/-。

本发明又提供了所述的与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记在猪背膘厚性状筛选中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果：本发明提供了猪背膘厚性状相关的GHR基因内SINE转座子多态分子标记，针对GHR基因的SINE转座子插入多态性，设计特定的引物扩增包含SINE位点的基因片段，然后进行电泳检测分析，能够简单、快速、低成本、精确地检测其插入多态性。通过本发明的GHR基因内SINE转座子多态分子标记，可以用于家系选育中的早期选择，也可在选配中提供分子依据，为筛选猪的背膘厚提供了新的方法。

附图说明

图1 GHR基因内SINE转座子多态分子标记分型检测原理及预期结果示意图，A、GHR基因内SINE转座子多态分子标记基因分型检测原理示意图，B、基因分型预期结果示意图；

图2 GHR-STIP1分子标记基因分型检测代表电泳图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

以下结合在大白猪群体中进行多态检测及分析对本发明进行详细说明。

本发明的与猪背膘厚相关的GHR基因内SINE转座子多态分子标记，其来自GHR基因，位于GHR基因(ENSSSCG00000016866)的102258到102951位点，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该序列的第200到493位点(位点指碱基)存在一个反向SINE的插入多态，该位点为存在SINE序列的插入和缺失的不同状态，SEQ ID NO:1中SINE序列为插入状态；当SINE序列为缺失状态，SEQ ID NO:1的第200到493位点不存在，第199位点的碱基与第494位点的碱基直接相连。

针对上述GHR基因内SINE转座子多态分子标记，本发明还公开了其获取方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据SEQ ID NO:1序列中反向SINE转座子插入多态性位点两侧的序列设计PCR扩增引物；

其中步骤(2)中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。步骤(3)中，所述基因型为SINE^+/+、SINE^+/-或SINE^-/-。

本发明获取与猪背膘厚相关的GHR基因内SINE转座子多态分子标记的方法，具体包括以下步骤：

1、大白猪耳样的采集及DNA的提取

本发明的大白猪群体耳样采集自安徽身的某种猪育种公司，在相同的日粮水平下的大白猪群体，采集耳组织后记录耳号，-80℃保存备用。使用TAKARA的MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa，大连，中国)试剂盒从血液或耳组织中提取基因组DNA。主要步骤如下：(1)取2～25mg动物组织，用剪刀剪成碎块。或100μl抗凝全血加PBS补充至200μl。(2)加180μl Buffer GB、20μl蛋白酶K和10μl RNase A(10mg/ml)，吸打混匀，于56℃水浴温浴至组织裂解。全血水浴10分钟。(3)向裂解液中加入200μl 100％乙醇，充分吸打混匀。(4)将Spin Column安置于Collection Tube上，将(3)中溶液移Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。(5)向Spin Column中加500μl的Buffer WA，12000rpm离心1分钟，弃滤液。(6)向Spin Column中加700μl的Buffer WB，12000rpm离心1分钟，弃滤液，重复操作步骤(6)一次。(7)将Spin Column安置于CollectionTube上，12000rpm离心2分钟。(8)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入100μl的Elution Buffer，室温静置5分钟。(9)12000rpm离心2分钟洗脱DNA。提取得到的基因组DNA通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶进行DNA浓度和质量检测。

2、PCR检测

根据GHR基因序列，设计用于扩增反向SINE转座子插入多态性位点的引物，所述正向引物(即图1中的上游引物)和反向引物(即图1中的下游引物)的核苷酸序列如SEQ IDNO:2-3所示，以上述大白猪个体基因组为模板，在包含待测位点序列的正反向引物、TaqDNA聚合酶、缓冲环境、dNTPs存在的情况下，在PCR反应条件下进行扩增，SINE纯合插入(SINE^+/+)和纯合无插入(SINE^-/-)基因型的个体的产物大小分别为544bp和250bp，而杂合插入(SINE^+/-)基因型的个体的产物为两种大小(544bp、250bp)的产物同时存在。所述引物对序列如下：

正向引物序列为：5’-TTTTCACACATATGCTTCATGGCTA-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物序列为：5’-TGCCAGAACACTACATTCTACACT-3’(SEQ ID NO:3)

20μl的PCR反应体系主要包括10μl 2×TaqMix(Vazyme，南京，中国)，1μl模板(约50ng)，上下游引物各1μl(10μM)，超纯水补充到20μl体系。

PCR反应条件为：95℃预变性3分钟，然后95℃变性30秒，60/58℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环，72℃延伸5分钟。

3、琼脂糖凝胶检测

(1)制备2％(m/v)的琼脂糖凝胶。称取2.0g琼脂糖放入三角烧瓶中，加入100ml 1*TAE电泳缓冲液，置于微波炉中使之完全溶解后冷却至50℃-60℃时，将琼脂糖胶倒入插有胶梳的制胶板中，并检查有无气泡存在。室温放置待完全凝固后，小心拔出胶梳。

(2)用微量上样枪吸取6μl PCR扩增产物加入凝胶孔，同时上样5μl DNA标准分子量Maker作为参照。

(3)连接电泳槽与电泳仪，用120V的恒压电泳，根据指示剂的迁移位置，判断电泳情况。

(4)电泳结束后将凝胶置于盛有溴化乙锭溶液中，染色10min，然后使用凝胶电泳成像系统拍照观察。

4、基因分型

根据获取的电泳结果照片，判定在检测群体中该位点的基因型。电泳结果如图2所示，如果该样本是SINE^+/+(纯合SINE插入)则只有一条大带；如果该样本是SINE^+/-(杂合插入)，则能扩出一条含SINE的较大条带和一条不含SINE的较小条带；而如果该样本是SINE^-/-(两条染色体均无SINE插入)，则只扩增出一条较小条带。

5、关联分析

选取GHR-STIP1在大白猪群体中(432个个体)进行多态性检测，并将每个个体的生长繁殖性状与GHR-STIP1位点(即本发明的GHR基因内SINE转座子多态分子标记)多态性进行关联分析(表1)。并通过单因素方差分析进行差异显著性检测。

表1.GHR-STIP1插入多态与生长繁殖性状关联分析

注：同列相同字母表示组间差异不显著；不同字母表示组间差异显著(P＜0.05)。

校正背膘厚＝实测背膘厚×CF，式中，CF＝A/(A+(B×(实测体质量－100)))，其中，A_公猪＝12.402，B_公猪＝0.106530；A_母猪＝13.706，B_母猪＝0.119624。

在大白猪中，校正背膘厚与GHR-STIP1位点上是否有SINE插入呈显著性相关(P＜0.05)，纯合转座子插入基因型(SINE^+/+)的个体的校正背膘厚显著小于纯合无插入基因型(SINE^-/-)的个体。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种与猪背膘厚关联的GHR基因内SINE转座子多态分子标记、检测方法及应用

<130> xhx2019051501

<141> 2019-05-15

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tacctgccac ctagatgaat atatcaaaca taaacatttt tcacacatat gcttcatggc 60

tattgtttgt aaagaaacaa actgtgcagg taaatgtgaa gtccctaatt ttaccttctc 120

cagtctcact ctgctttctg ccattccaga ggataaaaat atcatatact ggcatttaca 180

cagtcctttt tgttgttgtt gttgttgttg tcttgtcttt ttagggccac acctgcggca 240

tgtggcagtt cccaggctag gggttcaatc ggagctgtag ccacctgcct atgccgcaac 300

cacaacaatg ccagacctga actatgtctg cgacctacac tacagcttac agcaatgccg 360

gatccttaac ccactgagcg aggcaacctc atggttccta gttggatttg tttctgctgt 420

gccacaatgg gaactccctg ggtttttttt caccatcctt ttttaatgct tttaaatttt 480

gctacataca tgaaatatgc ttattacata catgaaacat aatttgctta gttttaatgt 540

agatacgttt tactttaagt gtagaatgta gtgttctggc aattgctact tttactacca 600

aatacttgtt ttcattgtta tgttacccta gttcattttt aattgctctc tattactcca 660

tcttatgaaa atatcccaat ttatccattt cca 693

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttcacaca tatgcttcat ggcta 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgccagaaca ctacattcta cact 24

Claims

1.用于检测与猪背膘厚相关的GHR基因内SINE转座子多态分子标记的试剂在筛选猪背膘厚性状中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述SEQ ID NO: 1中SINE序列为插入状态，该序列的第200到493位点存在一个反向SINE的插入多态；当SINE序列为缺失状态，SEQ ID NO: 1的第200到493位点不存在，第199位点的碱基与第494位点的碱基直接相连；该核苷酸序列的第200到493位点之间存在一个反向SINE转座子的插入多态性位点；该位点表现为SINE^+/+、SINE^+/-或SINE^-/-三种基因型，纯合插入基因型SINE^+/+的个体背膘厚显著小于纯合无插入基因型SINE^-/-的个体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测方法包括以下步骤：

（1）根据SEQ ID NO: 1中反向SINE转座子插入多态性位点两侧的序列设计检测引物；

（2）以待检测猪个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

（3）将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并根据电泳结果判定基因型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，PCR扩增所用正向引物序列如SEQ ID NO: 2所示，反向引物序列如SEQ ID NO: 3所示。