CZ16199A3

CZ16199A3 - Gen receptoru prolaktinu jako genetický marker zvýšení velikosti vrhu u prasat

Info

Publication number: CZ16199A3
Application number: CZ99161A
Authority: CZ
Inventors: Max F. Rothschild; Amy L. Vincent; Christoper K. Tuggle
Original assignee: Iowa State University Research Foundation, Inc.
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 1999-06-16
Also published as: HUP0003264A2; RO120411B1; PL331353A1; WO1998003682A1; JP2001509006A; AU727542B2; EP0958376A4; CN1158390C; HUP0003264A3; NZ334097A; DK0958376T3; BR9710875A; EP0958376B1; CN1230227A; AU3513297A; US5935784A; CA2261158A1; KR20000067924A; HK1024269A1; DE69732536D1

Description

(57) Anotace:

Popisují se genetické markéry velikosti vrhu u prasat, způsoby stanovení takových markérů a způsoby testování prasat za účelem stanovení těch, které s větší pravděpodobností produkují větší vrhy. Tyto prasata se přednostně vybírají pro účely chovu. Markéry jsou založeny na přítomnosti nebo absebci polymofrismů v kódující oblasti genu receptoru prasečího prolaktinu.

AAOTCAACAA AOATGOAGCA CTOOCGTTOC TCCCAAAACA OCAGGAGAAC ^GCGACCGGC CGGAGAAGOC TOGCGCCCCT GAAACCAOCA AGGAATACG CCCAOGTOTC CCGGGTGATG GATAACCACA TCCTGGTGTT AGTOCAGGAT

CCGCGAGCTC GAAACGTGGC TCCGTTTGAA GAACCAACCA AGOAOACCCC

GCCATCCCGG CCGCAGAATC CAGCTGCOAA AOACCTGOCC G/AGCTTCACCA

COGCCCCGGO CCACTGCAGA CACCCCCTOG QTQOGCTGGA TTACCTCGAT

CCCGCAGOCT TTATGCACTC CTTTCAGTGA OAGCTTGGTT CATOGOATGA

TGGGTTACAA OGrGGGGTTT TTTTCAGGTC GCACTACGTO AAATOCACTC

TACCAGAGAA AGCTCGAAAA TCGGGTTAGA ATOACACTAC CCAGACTCAC aottcactcc vemATXíw ccArme/uV ccacttccctctt

G/A = β nebo A v polymorfním místě

CZ 161-99 A3 • 8 »8 888888 88 8« 8888 88 8 888 8 8 8 8 8

8 8 8 8 8 • 88 888» 8 4 •8 8888 88 88 88 88

8« 888 8 8«

Gen receptoru prolaktinu jako velikosti vrhu u prasat.

genetický markér zvýšení

Oblast techniky

Vynález se obecně týká detekce genetických rozdílů vzhledem k účinnosti reprodukce u prasat. Zvláště pak se týká použití genetického markéru genu receptoru prolaktinu, který nese dědičný rys zvýšeného počtu mláďat ve vrhu.

Dosavadní stav techniky

Hlavním limitujícím faktorem produkce vepřového masa je účinnost reprodukce, která se definuje jako počet prasat produkovaných chovnou prasnicí. V USA je průměrný počet živých narozených selat přibližně 9,5 selete ve vrhu. Dědičnost velikosti vrhu není podstatná (10 % až 15 %) a standardní genetické metody selekce chovných prasnic na základě velikosti vrhu nejsou účinné. Proto je třeba najít způsob, který umožní selekci na základě účinnosti reprodukce na úrovni buňky nebo DNA.

Čínská plemena jsou známy tím, že dříve dospívají a vykazují značnou velikost vrhu. Americká plemena vykazují vyšší rychlost růstu a mají nízký obsah tuku. Proto je žádoucí zkombinovat nej lepší charakteristiky obou typů, přičemž se zlepší účinnost produkce vepřového masa v USA. Toto úsilí se podpořilo objevem genů nebo genetických markérů, které vykazují spojitost se zvýšením velikosti vrhu u prasat.

V několika výzkumných skupinách používají při studiu DNA prasat analýzu RFLP. V publikaci Jung et al., Theor. Appl. Genet., 77: 271-274 (1989) se popisuje použití metody RFLP, aby se prokázala genetická variabilita dvou plemen prasat. U těchto plemen se prokázal polymorfizmus u genů antigenu třídy

I prasečích leukocytů (SLA). V publikaci Hogans et al.,

Abstract for Annual Meeting of _tMidwestern Section of the

American Society of Animal Science, March 26-28, 1990, se • 4 44 44 4444 «4 44 • 444 44 4 4 * 4 4

4444 444«

4 4 «444 44444444

44 4444 4 « ······ 44 «4 ·· *· upozorňuje na existenci polymorfismu genů prasečího hlavního komplexu histokompatibility (MHC) u čínských prasat. Tento polymorfismus se prokázal analýzou RFLP. V publikaci Jung et al., Animal Genetics, 26: 79-91 (1989) se popisuje analýza

RFLP genů SLA třídy I u určitých vepřů. Autoři uvádí, že výsledky naznačují spojitost mezi geny prasečí SLA/MHC třídy I a produkcí a projevením rysů. Autoři dále uvádějí, že použití restrikčních fragmentů SLA třídy I jako genetických markérů může mít potenciál zlepšit v budoucnosti růst prasat.

Dále patent USA č. 5,550,024 (Rothschild et al.,) dokládá polymorfismus u genu receptoru prasečího estrogenu, který se spojuje se zvýšením velikosti vrhu.

Jiným prasečím hormonem, který má vztah k úspěšné reprodukci, je prolaktin. Prolaktin (PRL) je hormon vylučovaný předním lalokem hypofýzy, který se účastní řady různých endokrinních aktivit a je podstatný při úspěšné reprodukci. Jednou z jeho nejlépe charakterizovaných funkcí je regulace produkce mléka u dospělých savců. PRL je nutný při stimulaci tvorby mléka nebo při syntéze mléčných proteinů. Toto působení zprostředkovává receptor prolaktinu (PRLR). Receptor prolaktinu (PRLR) patří do super-rodiny cytokin/GHR/PRLR. Když se receptor prolaktinu aktivuje prolaktinem spouští se signální cesta transdukce, která aktivuje transkripci genů, jako je gen β-kaseinu a α-laktalbuminu. Po aktivaci receptoru prolaktinu prolaktinem začíná signální cesta transdukce, která pravděpodobně zahrnuje tyrozinovou kinázu Jak2. Mutace karboxylového konce proteinu, které mění specifický fosfotyrozinový zbytek, brání receptoru aktivovat tyrozinovou kinázu Jak 2 a interferuje s aktivací transkripce genu βkaseinu (Lebrun, J., Ali, S., Groffin, V., Ullrich, A., Kelly, P. (1995). A Single Phosphotyrosine Residue of the Prolaktin Receptor is Responsible for Activation of Gene Transcription. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 4031-4035) . U krys, myší, králíků a lidí se charakterizovaly dlouhé a krátké formy

1* ~ < 4 4 4 4 * 4

4 4 4 4) 4 » 4 4 4 »49 ·

444 444 ·

4 «4 receptorového proteinu, stejně jako velikosti transkriptu ( Boutin, J., Edery, M., Shirota, M., Jolicoeur, C., Lesueur, L., Ali, S., Gould, D., Djiane, J., Kelly, P. (1989). Identification of cDNA Encoding a Long Form of Prolactin Receptor in Human Hepatoma and Brest Cancer Cells. Mol. Endocrinol.3, 1455-1461.; Edery, M., Jolicoeur, C., LeviMeyrueis, C., Dusanter-Fourt, I., Petridou, B., Boutin, J., Lesueur, L., Kelly., P., Djiane, J. (1989). Identification and Sequence Analysis of a Second From a Prolactin Receptor by Molecular Cloning of Complementary DNA From Rabbit Mammary Gland. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 2112-2116.; Lesueur, L., Edery, M., Ali, S., Paly, J., Kelly, P. (1991). The Prolactin/Growth Hormone Receptor on Prolactin-InducedMilk Protein Gene Transcription. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 824-828. ). Ukázalo se však, že krátká forma není schopna aktivovat transkripci genů mléčných proteinů. Mediátorová RNA pak pochází ze stejného primárního transkriptu a způsobuje alternativní sestřih zvláště u nepřekládaných oblastí u králíka a u člověka. V poslední době se také ukázalo, že PRL stimuluje in vitro produkci progesteronu ve velkých prasečích luteálních buňkách. Progesteron je nutný při udržení těhotenství. Uvažuje se, že PRLR zprostředkovává účinky injektovaného růstového hormonu (bST) v podobě vyššího výtěžku mléka u telat a proto může být také důležitý při kolísání výtěžku mléka u prasat. U lidí a myší leží receptor růstového hormonu (GHR) a PRLP blízko sebe (Arden et al., 1990; Baker et al., 1992), přičemž je pravděpodobné, že tyto dva geny jsou spojeny také u prasat. U prasat se GHR zmapoval na chromozomu 16, zatímco PRLP není zmapován. V případě PRLP se neuvádí genetická variabilita.

Vynález popisuje genetický markér založený na objevu polymorfizmů u genu receptoru prolaktinu, který se spojuje se zvýšením průměrné velikosti vrhu u prasat. To umožní u prasat provést genetické typování genů receptoru prolaktinu a ρ

• » ·

9 9 9

99

9 9

9 9 9

9 φ 9 • 9.9 9 99 9 ·

9 9 9 stanovit vztah specifických RFLP a zvýšené velikosti vrhu. To také umožni identifikaci jednotlivých samců a samic, které nesou gen způsobující větší vrhy. V případě samic je pak možné očekávat, že jejich vrh bude větší, než je průměr u jejich plemene. V případě samců se očekává, že jejich potomstvo samičího pohlaví bude vykazovat silnější vrhy než je průměr u daného plemene. Markér se pak stane selekčním nástrojem pro vývoj linie a plemene, které produkuje vrhy s vyšším počtem mláďat.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje způsob testování prasat za účelem vytypování těch, které s velkou pravděpodobností budou produkovat silné vrhy.

Vynález dále popisuje způsob identifikace genetických markérů velikosti vrhu u prasat.

Dále vynález popisuje způsob produkce genetických markérů velikosti vrhu u prasat.

Vynález také popisuje kit, který hodnotí vzorek prasečí DNA podle přítomnosti specifických genetických markérů velikosti vrhu.

Další předměty a výhody vynálezu jsou uvedeny v následujícím popisu vynálezu a částečně vyplývají z popisu nebo mohou vyplynout z použití vynálezu. Předmětů a výhod vynálezu se dosáhne prostřednictvím a kombinacemi způsobů uvedených v patentových nárocích.

Aby se dosáhlo jednotlivých předmětů vynálezu a v souladu s účelem vynálezu, jak se zde uvádí, se popisuje způsob testování prasat za účelem zjištění, která prasata pravděpodobněji produkují silnější vrh, když jsou březí, nebo za účelem selekce prasat, jenž nesou alely indikující slabší vrh. Termín „ vrhy se zvýšenou velikostí, (silnější vrhy) znamená podstatné zvýšení velikosti vrhu ve srovnání s průměrným vrhem dané populace. Tak vynález popisuje způsob « ♦

• · ·· ·· 8··· * 8 8 8 «8 ·

testování prasat za účelem zjištění, která prasata s větší nebo menší pravděpodobností produkují silnější vrhy. Tento způsob zahrnuje 1) získání vzorku genomové DNA z prasete; a 2) analýzu genomové DNA získané v kroku 1) za účelem stanovení, která(é) receptorová(é) alela(y) je (jsou) přítomny. Vzorek genetického materiálu se získal z prasete a analyzuje se za účelem stanovení přítomnosti nebo absence polymorfismu v kódující oblasti genu prolaktinového receptoru, který koreluje se zvýšenou velikostí vrhu.

V preferovaném provedení vynálezu termín polymorfismus znamená polymorfismus délek restrikčních fragmentů a test zahrnuje identifikaci genu receptoru prasečího prolaktinu v izolovaném prasečím genetickém materiálu; působení restrikčního enzymu na gen za vzniku restrikčních fragmentů genu o různých délkách; separaci restrikčních fragmentů za vzniku restrikčního paternu, přičemž separace se může uskutečnit elektroforézou nebo použitím HPLC; a srovnání výsledného paternu restrikčních fragmentů vytvořeného z genu receptoru prasečího prolaktinu, o kterém se ví, že nese nebo nenese požadovaný markér. Jestliže test přítomnosti markéru u prasete je pozitivní, prase se může zařadit do chovu. Jestliže test prasete není pozitivní, prase se vyřadí ze skupiny a použije se jiným způsobem.

V případě nejvíce preferovaného provedení se izoloval gen za použití primerů a DNA polymerázy za účelem amplifikace specifické oblasti genu, která vykazuje polymorfizmus. Dále amplifikovaná oblast se pak štěpí restrikčním enzymem a fragmenty se opět separují. Vizualizace paternu RFLP se uskutečnila jednoduchým barvením fragmentů nebo značením buď primerů nebo nukleosid-trifosfátů, které se používají při amplifikaci.

V případě jiného provedení vynález zahrnuje způsob identifikace genetického markéru velikosti vrhu u určité populace prasat. Chovají se samci a samice prasat stejného • ♦ ···· • · · ·

0 · · · · 4 • · » · 0 0<

plemene nebo kříženého plemena nebo podobné genetické linie, stanoví se počet potomků, které produkuje každá samice. Stanoví se polymorfismus genu receptoru prolaktinu každého prasete a stanoví se souvislost s počtem potomků. Upřednostňuje se, aby se pro stanovení polymorfismu použila analýza RFLP a nejvíce se upřednostňuje, aby se DNA štěpila restrikční endonukleázou Alul.

Je také možné stanovit spojení mezi specifickými alelami alternativních markérů DNA a alelami markérů DNA, o kterých se ví, že jsou spojeny s určitým genem ( např. zde diskutovaný gen receptoru prolaktinu), o kterém se už dříve zjistilo, že je spojen s určitým rysem. Pak v současné situaci je možné za použití genu receptoru prolaktinu nepřímo vybrat prasata, která pravděpodobně produkují slabé vrhy. Selekce se provádí na základě jistých alel markéru asociovaného s receptorem prolaktinu prostřednictvím selekce specifických alel alternativních markérů chromozomu 16.

markérů, o kterých se ví, že jsou prolaktinu na prasečím chromozomu 16, zahrnují SW1305, S0077,

S0006, SW2411, SW1035 a S0111. Uvedené markéry jsou mikrosatelity a receptor růstového hormonu (GHR).

Vynález dále zahrnuje kit vhodný pro hodnocení vzorku prasečí DNA na základě přítomnosti požadovaného genetického markéru v genu receptoru prasečího prolaktinu, který indikuje nedědičný rys, kterým je silný vrh. Kit tvoří přinejmenším kontejner s jedním nebo více činidly, která polymorfismus genu promotoru prasečího

Upřednostňuje se, aby činidlem byla sada ligonukleotidových primerů schopných amplifikovat fragment genu receptoru prasečího prolaktinu, který vykazuje polymorfismus.

Upřednostňuje se, aby kit dále obsahoval restrikční enzym, který štěpí gen receptoru prasečího prolaktinu alespoň v jednom místě. V případě nejvíce preferovaného provedení

Příklady takových spojeny s receptorem identifikuj í prolaktinu.

9· • 9 9 9 9 ► 9 9 9 9

9 999 999

9 9 » 9 9 9 9 ·· · · vynálezu je uvedeným restrikčním enzymem Alul nebo enzym, který rozeznává stejné místo štěpení.

Vynález popisuje genetické markéry velikosti vrhu u prasat. Dále popisuje způsob testování prasat za účelem stanovení, která prasata, na základě přítomnosti nebo absence polymorfismu v genu receptorů prolaktinu, který koreluje se zvýšením velikosti vrhu, budou pravděpodobně vykazovat silné vrhy. Termín „zvýšení velikosti vrhq¹¹ znamená biologicky podstatné zvýšení velikosti vrhu ve srovnání s průměrným vrhem dané populace.

Vynález se týká genetických markérů a způsobů identifikace těchto markérů u prasat určitého plemene, druhu, populace nebo skupiny, přičemž samice prasat s velkou pravděpodobností vykazuje vrh, který je podstatně větší (počet mláďat) ve srovnání s průměrným vrhem určitého plemene, druhu, populace nebo skupiny. Může se použít libovolný způsob identifikace přítomnosti nebo absence tohoto markéru, například analýza SSCP (polymorfizmus jednořetězcové konformace, RFLP annalýza analýza heteroduplexu, gelová elektroforéza s denaturačním gradientem a elektroforéza z teplotním gradientem, ligázová řetězcová reakce nebo dokonce přímé sekvenování genu receptorů prolaktinu a testováním paternu po štěpení restrikčním enzymem Alul ve 3 překládané oblasti.

Další možné metody zahrnují systémy, které neprobíhají na gelu, jako je TaqMan™ (Perkin Elmer). systému se oligonukleotidové primery lemovaly diskutované mutace a umožňují PCR amplifikaci oblasti. Třetí oligonukleotidová sonda se navrhuje tak, aby došlo k hybridizaci s oblastí obsahující základní subjekt, který je rozdílný u různých alel genu. Tato sonda je značena fluorescenčními barvivý na obou koncích 3' a 5'. Barviva se vybrala tak, že fluorescence jednoho barviva je, v případě, že se barviva nacházejí v takové blízkosti, utlumena druhým barvivém a není možné ji detekovat. Extenze pomocí Taq DNA

V případě uvedeného navrhují tak, aby ♦ · « · « · • · · · · · · * · • * · · · ♦ · o · · p ·« ··«» ·»«·««·· ^U · · » ·«·· 9 « * · t · ·· V · « · » · 9 9 polymerázy z primeru PCR umístěného na 5'-konci templátu vzhledem k sondě vede ke štěpení barviva připojeného na 5'konci navázané sondy prostřednictvím nukleázové aktivity Taq DNA polymerázy na 5'-konci. Tato skutečnost odstraňuje efekt tlumení fluorescence, což umožňuje detekci fluorescence uvolněné z barviva na 3' konci sondy. Diskriminace mezi různými sekvencemi DNA vzniká na základě skutečnosti, že jestliže hybridizace sondy s templátovou molekulou není kompletní, to znamená že zde existuje chybné párování některé z forem, neproběhne štěpení barviva. K odstranění jevu tlumení fluorescence dojde pouze v případě, že nukleotidové sekvence oligonukleotidové formy je zcela komplementární s templátovou molekulou, na kterou se váže. Reakční směs může obsahovat dvě sondy s různými sekvencemi, kdy každá je navržena proti různým alelám, které mohou být přítomny, což umožňuje detekovat obě alely v jedné reakci.

Použití RFLP je preferovaným způsobem detekce polymorfismu. Protože však použití analýzy RFLP závisí na polymorfismu a na restrikčních místech DNA na molekule nukleové kyseliny, mohou se použít i jiné způsoby detekce polymorfismu. Tyto způsoby zahrnují ty, které analyzují produkt polymorfního genu a detekují polymorfismus stanovením výsledných rozdílů v produktu genu.

Analýza RFLP je obecně metoda v oboru dobře známa. Popisuje se například v publikacích USA patentech č. 4,582,788 podaném 15. dubna 1986 (Erlich) a 4,666,828 podaného 19. května 1987 (Gusella), 4,772,549 podaném 20. září 1988 (Frossard) a 4,861,708 podaném 29. srpna 1989 (Frossard). Metoda zahrnuje způsob získání DNA za účelem studia, štěpení DNA restrikčními endonukleázami, separace výsledných fragmentů a detekci fragmentů různých genů.

Vzorky genetického materiálu prasete podle vynálezu se mohou získat z krve, tkáně, sperma atd. Obecně lze říct, že genetickým materiálem je DNA a jeho zdrojem jsou buňky

44 4444 44 44

4444 44 4 444«

4 Γ· 4 · 4 4 4 4

4 4 4*4 4 '» 4 444 444 «44 4444 4 4

4444 44 44 44 44 periferní krve. Aby bylo dostatek DNA k analýze je nutné získat dostatečné množství buněk. Odborník ví, jaké množství DNA je pro analýzu nutné nebo to může velmi snadno určit. K izolaci DNA z buněk krve se používají metody, které jsou v oboru dobře známy.

Dále se amplifikuje oblast, která zahrnuje polymorfismus, za použití primerů a standardních metod, jako je polymerázová řetězcová reakce. Tyto metody se popisují v publikacích patenty USA č. 4,683,195 podaném 28. července 1987 (Mullis et al.,), 4,683,202 podaném 28 července 1987, (Mullis), 4,800,159 podaném 24, ledna 1989 (Mullis, et al.), 4,889,818 podaném 26. prosince 1989 (Gelfand, et al.,) a 4,902,624 podaném 20. února 1990 (Clumbus, et al.,). Selekce primerů se diskutuje ve zde uvedených publikacích. Pomocí primerů se amplifikuje 3' kódující oblast a nepřekládaná oblast genu receptoru prasečího prolaktinu, jak zobrazuje obrázek č. 2. Na základě vynálezu a v kombinaci se svými znalostmi může odborník snadno navrhnout jiné takové primery.

Izolovaná DNA se pak štěpí restrikčními endonukleázami, které hydrolyticky štěpí DNA ve specifické nukleotidové sekvenci, která se nazývá restrikční místo. Takové endonukleázy, které se také nazývají restrikční enzymy, jsou v oboru dobře známy. V souladu s vynálezem je vhodné, vybrat ten enzym, který štěpí kódující oblast genu receptoru prolaktinu alespoň na jednom místě, za vzniku alespoň dvou fragmentů genu. Metodou známou v oboru ve spojení s obsahem vynálezu se stanoví, zda libovolný z takových fragmentů je či není polymorfní a zda libovolný polymorfismus (RFLP) je spojen s velikostí vrhu. Upřednostňovanou restrikční endonukleázou je Alul. Restrikční enzym Alul štěpí sekvenci dvouřetězcové DNA 5'-AGCT-3'. Odborník snadno na základě svých znalostí a informací uvedených v popisu vynálezu stanoví množství restrikčního enzymu, které je nutno přidat ke vzorku, který • · · 8 • 8 8 · · »8 8 • 8 ·8 8 88» • 8 8 » 8 8 • · · · • 8 8 8 • 8 Λ

8·· » 8 ·

8 8 · 8 8 • · 88 β · obsahuje prasečí DNA a vhodné podmínky, při kterých probíhá štěpení.

Restrikční fragmenty se pak analyzují metodami známými v oboru, které obecně zahrnují buď separaci fragmentů a vizualizaci barvením nebo následné blotování a hybridizaci, přičemž vzniká určitý patern, nebo stanovení různých velikostí fragmentů. Později se určují jeden nebo více fragmentů (markérů), které souvisí se zvýšením velikosti vrhu. Preferovanou metodou separace je gelová elektorforéza.

Při této metodě se aplikací elektrického pole separují výsledné fragmenty štěpení v podpůrném mediu na základě velikosti. Jako podpůrné medium se v obvyklém případě používají gely, jako jsou agarozové nebo akrylamidové gely. Buňky na jednom konci gelu se naplní vzorkem, který obsahuje restrikční fragmenty. Jako kontrola se na stejném gelu dělí jeden nebo více markérů velikosti, což umožní odhad velikosti restrikčních fragmentů. Tento postup obecně umožňuje stupeň rozlišení, který separuje fragmenty, které se od sebe liší například například pouze 1 nebo 2 páry baží.

U alternativního provedení vynálezu se fragmenty denaturují a fyzicky se přenášejí z gelu na pevnou podporu, upřednostňuje se nylonová membrána, přičemž dochází ke kontaktu gelu s filtrem za přítomnosti vhodných činidel a za vhodných podmínek, které podporují transfer DNA. Taková činidla a podmínky jsou v oboru dobře známa. Tak se udržují relativní pozice fragmentů DNA dosažené způsobem separace.

Dalším krokem je detekce různých kategorií velikostí fragmentů nebo v jiném případě detekce fragmentu určité velikosti. Tento fragment se později může stát zajímavým, protože může být genetickým markérem spojeným se zvýšenou velikostí vrhu. Barvení fragmentů se přednostně provádí za použití etidiumbromidu a podobně.

Jiným způsobem je použití hybridizační sondy. Takovou sondou je oligonukleotid nebo polynukleotid, který je • · dostatečně komplementární nebo homologní s fragmentem, se kterým hybridizuje za vzniku komplexu sonda-fragment. Upřednostňuje se, aby sondou byla cDNA sonda. Oligonukleotid nebo polynukleotid je značen detekovatelnou látkou. To umožňuje detekci restrikčních fragmentů, se kterými sonda hybridizuje. Sondy se značí standardními metodami značení, jako je radioaktivní značení, značení enzymem, fluorescenční značení, značení biotinem-avidinem a podobně. Metody značení se popisují v publikacích patentech USA č. 4,711,955 podaném

8. prosince 1987, (Ward et al., ) a 4,868,103 podaném 19. září 1989 (Stavrianopoulos et al.,).

Sondy jsou v kontaktu s nylonovou membránou, která obsahuje restrikční fragmenty, po dostatečnou dobu a za vhodných hybridizačních podmínek hybridizují s fragmenty. Upřednostňuje se, aby se promýváním filtru odstranily nenavázané sondy a jiné nežádoucí materiály.

Komplexy sonda-fragment, které jsou navázané na filtru, se pak detekují známými metodami. Je-li sonda například značena radioaktivně (³²P), při detekci se na nylonovou membránu přikládá kousek filmu, který je citlivý na radioaktivní zářeni. Po vhodné době expozice se zviditelní požadovaný fragment spolu s kontrolními fragmenty.

Při detekci vzniká patern, který je výsledkem separace fragmentů na základě velikosti. Srovnání těchto fragmentů s kontrolními fragmenty o známé velikosti, které se také dělily na stejném gelu, umožňuje odhadnout velikost různých skupin fragmentů. Na základě srovnání paternů z řady různých prasat připravených podobnou analýzou DNA se stanoví různé polymorfizmy u genu receptoru prasečího prolaktinu. V případě některých jednotlivých prasat se budou paterny lišit od obvyklých paternů, které vykazuje většina jiných prasat. To je způsobeno výskytem jednoho nebo více polymorfismů délky restrikčních fragmentů produkovaných nukleázou, která štěpí • · · · · · ·· ·· » * · · alternativní polymorfismu.

gen receptoru prasečího prolaktinu. Polymorfizmus indikuje u takových prasat různé sekvence párů baží.

Když se identifikoval určitý RFLP, to znamená restrikční fragment určité délky, může se za použití známé metody zkonstruovat sonda k tomuto fragmentu. To umožňuje a rychlejší úpravy pro detekci takového Jestliže se například štěpí DNA, může se použít formát sendvičové hybridizace. Takové testy se popisují v patentech USA č. 4,486,539 podáno 4. Prosince 1984 (Ranki, et al.,) a 4,563,419 podáno 7. Ledna 1986 (Ranki, et al.,). Vzorek přichází do kontaktu se sondou, která je imobilizována na pevném nosiči. Sonda se váže na fragment. Nosič se pak promyje a proběhne detekce značení sondy. Po dalším promytí se detekuje detekce sondy, čímž se demonstruje přítomnost požadovaného fragmentu.

V jiném provedení vynálezu v případě, když se stanovil RFLP patern nebo určitý polymorfní fragment, se srovnává se známým RFLP paternem nebo fragmentem, který koreluje se zvýšenou velikostí vrhu. Tento druhý patern nebo fragment se také stanovil v případě genu receptoru prasečího prolaktinu za použití stejné restrikční endonukleázy jako u prvního paternu a stejné sondy nebo jejího ekvivalentu za stejných podmínek.

V jiném provedení vynálezu se mohou restrikční fragmenty detekovat hybridizací v roztoku. V případě této metody se fragmenty nejdříve hybridizují se sondou a pak se separují. Separované komplexy sonda-fragment se pak detekují způsoby, které se zmiňují shora v textu. Takové komplexy se detekují na gelu, aniž se musí přenést na filtrační papír.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se polymorfismus detekuje PCR amplifikaci, aniž se použije libovolná sonda. Tento způsob je známý v oboru a popisuje se v patentech USA č. 4,795,699 s názvem „DNA Polymerase a v patentu USA č. 4,965,188 s názvem „Precess for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Sequences Using a Thermostable Enzyme.

» ·

Při tomto způsobu se musí zkonstruovat primery tak, aby se amplifikovala oblast, ve které leží polymorfismus. Co se týče primerů, které přednostně tvoří 4 až 30 bází, jsou vytvořeny na základě sekvence forward 5'primer a polymorfismu. Není obklopující polymorfismus a zahrnují reverzní nebo anti-sense primer 3' nutné, aby primery byly zcela komplementární. Přijatelné jsou také sekvence v podstatě ekvivalentní. Pak se přidá DNA polymeráza, jako je Taq polymeráza (v oboru je známa řada takových polymeráz a jsou také běžně dostupné) v přítomnosti čtyř nukleosid-trifosfátů. Reakce často zahrnuje pufrující činidlo. Detekce se provádí jednoduchým barvením separovaných produktů, jako je například barvení etidiumbromidem, aby se detekovaly předpovídané velikosti na základě velikosti amplifikované oblasti. Odborník dobře zná reakční čas, reakční činidla a sekvenci primerů. Uvedené parametry se popisují v uvedených patentech. Dále, PCR amplifikace se může použít v kombinaci s metodou polymorfismu jednořetězcové konformace (SSCP). Tento způsob se popisuje v publikaci „Detection of Polymorphism od Human DNA by Gel Electroforesis as Single-Strand Conformation Polymorfisms, Orita et al., PNAS 86 (8) April 1989 (2766 - 70); a Lessa et al., Mol. Ecol 2 (2) p. 119-29 duben 1993 „Screening Techniques for Detecting Allelic variation in DNA Sequences.

Ačkoli shora uvedené metody se popisují v souvislosti s použitím jednoho restrikčního enzymu a jedné sady primerů, metody však nejsou tímto omezeny. Jestliže je to nutné může se použít jeden nebo více dalších restrikčních enzymů a/nebo sond a/nebo primerů. Další enzymy, konstruované sondy a primery se mohou stanovit rutinními experimenty.

Genetické markéry velikosti vrhu u prasat se stanovily následovně. Páří se samci a samice prasete stejného plemene nebo zkříženého plemene nebo odvozené od podobných genetických linií. Stanovuje se počet potomků, které produkuje každá samice prasete. Analýza RFLP rodičovské DNA se provádí způsoby * 8 8 • «8

8 •8 #888

• 8

8

8 8 8 8 8 8

uvedenými shora v textu za účelem stanovit polymorfismus genu receptoru prolaktinu každého prasete. Polymorfismus se spojuje s počtem potomků. Pro tato stanoveni se používá alespoň 20 a přednostně alespoň 40 samic prasat. Každá samice vrhne alespoň jednou. Upřednostňuje se, aby samice vrhly dvakrát a s výhodou třikrát

Když proběhne uvedená analýza, pomocí PCR RFLP analýzy za použití restrikční endonukleázy Alul se stanoví polymorfismus a amplifikační primery se navrhnou za použití analogových známých sekvencí lidského nebo králičího prolaktinu, což umožňuje vysoká homologie v oblasti obklopující polymorfismus. Primery se mohou také navrhnout za použití dat známé sekvence genu prasečího prolaktinu, jak je uvedeno na obrázku č. 1, nebo se dokonce navrhují na základě sekvencí získaných z dat spojení genů, který přímo obklopují polymorfismus. Vybrala se sada primerů podle vynálezu, které amplifikuji fragment tvořený 457 bázemi (forward primer 5'- CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG -3' (SEQ ID NO: 1) a reverzní primer 5'- GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA -3' (SEQ ID NO: 2)) pak se vytvoří restrikčně polymorfní fragmenty, které přibližně obsahují 124, 110, 79, 77 a 67 párů baží. Polymorfní místo se nachází na fragmentu o velikosti 110 párů baží. Jestliže je přítomné polymorfní místo štěpení, vytvoří se fragment o velikosti 90 párů baží. Ukázalo se, že polymorfní fragmenty jsou alely a každá má spojitost se zvýšenou velikostí vrhu u různých plemen. Tak prase, které je heterozygotní v případě fragmentu Alul, bude vykazovat patern o velikosti fragmentů 124, 110, 90, 79, 77 a 67. Homozygot v případě polymorfního místa štěpení bude vykazovat patern o velikosti fragmentů 124, 90, 79, 77, 67, zatímco jiný homozygot vykazuje patern o velikosti fragmentů 124, 110, 79, 77, 67. Genotyp spojovaný s vyšší velikostí vrhu u různých plemen alternuje. Tento závěr je podobný situaci, která se popisuje v patentu USA 5,374,523 s názvem „Allelic variants of Bovine Somatotropin gene: Genetic markér for Superior Milk ·· ·99· » · 4 I ♦ · 44 (sada která

Production in Bovine, kde polymorfismus alely je gen somatotropinu a jedna forma alely je výhodou jerseyského skotu a alternativní forma je výhodou holsteinského skotu.

Činidla vhodná pro aplikaci metod podle vynálezu mohou být obsahem konvenčního kitu. Kit obsahuje nezbytné materiály zabalené do vhodných kontejnerů. Kit obsahuje alespoň činidlo, které identifikuje polymorfismus genu receptoru prasečího prolaktinu, který se spojuje se zvýšenou velikostí vrhu. Je výhodné, aby uvedeným činidlem byla sada pro PCR primerů, DNA polymeráza a č nukleosid-trifosfat) , hybridizuje s genem receptoru prasečího prolaktinu nebo její fragment. Je výhodné, aby kit zahrnoval sadu pro PCR a restrikční enzym, který štěpí gen receptoru prasečího prolaktinu alespoň na jednom místě. U zvláště preferovaného provedení vynálezu je primerem sekvence označená SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 2 a restrikčním enzymem je Alul. Upřednostňuje se, aby kit dále obsahoval činidla pro detekci nebo měření detekovatelné látky nebo obsahoval kontrolu. Jestliže se to požaduje, kit může zahrnovat jiná činidla používaná při hybridizací, prehybridizaci, extrakci DNA, vizualizaci atd.

Způsoby a materiály podle vynálezu se mohou také použít při hodnocení DNA prasat, při genetickém typováni jednotlivých prasat a při detekci genetickcýh rozdílů u prasat. Zvláště vzorek genomové DNA prasete se může hodnotit srovnáním s jednou nebo více kontrol, aby se stanovilo, zda je přítomen polymorfismus v genu receptoru prolaktinu. Upřednostňuje se, aby RFLP analýza proběhla s ohledem na gen receptoru prasečího prolaktinu a výsledky se porovnaly s kontrolou. Jako kontrola slouží výsledek analýzy RFLP genu receptoru prasečího prolaktinu různých prasat, o kterém se ví, že nese polymorfismus. Podobně se může stanovit genotyp receptoru prolaktinu u prasat tak, že se získá vzorek genomové DNA prasete a gen receptoru na DNA se podrobí RFLP analýze a výsledky se srovnají s kontrolou. Kontrolou je opět výsledek

99

9 9 9 9

4 4 4 9

444 994

9 4 4 ·· 4· 44

9 9 9 9 9

9 9 · ·

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 ···· 99

4444 analýzy RFLP genu receptorů prolaktinu u různých prasat. Výsledky geneticky typují prasata tím, že specifikují polymorfismus v jeho genech receptorů prolaktinu. Genetické rozdíly u prasat se mohou stanovit způsobem, který zahrnuje tento postup: získají se vzorky genomové DNA alespoň dvou prasat, určí se přítomnost nebo absence polymorfismu v genu receptorů prolaktinu a výsledky se porovnají.

Genetické markéry, způsoby a kity podle vynálezu se také používají v chovných programech za účelem zlepšení velikosti vrhu v rámci plemene, linie nebo populace prasete. Pokračující selekce a chov prasnic, které jsou vzhledem k polymorfismu spojované se zvýšením velikosti vrhu alespoň heterozygotní a s výhodou homozygotní, povede ke vzniku plemene, linie nebo populace, která vykazuje vysoký počet mláďat v každém vrhu samic uvedeného plemene nebo linie. Tak lze říct, že markéry jsou selekčními nástroji.

Rozumí se, že odborník je schopen aplikovat informace podle vynálezu na specifický problém nebo prostředí.

Zde přiložené obrázky ilustrují spolu s popisem slouží ke vysvětlení jedno provedení vynálezu a principů vynálezu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena sekvence 3' konce kódujíc! nepřekládnou oblast genu receptorů prasečího prolaktinu (SEQ ID NO: 3). Prasečí PCR fragment produkovaný pomocí králičích/lidských primerů se izoloval použitím filtrů Amicon Microcon (Amicon, lne.). Sekvenování se provedlo v instituci Iowa State University DNA Sequencing and Synthesis Facility. Oblast popsaná italikou reprezentuje dvojznačnost v sekvenci a může být ccaaaactac (SEQ ID NO: 3) —> prasečí PCR primery. Králičí/lidská sekvence.

Na obrázku č. 2 je zobrazen patern polymorfizmu produktu

PCR štěpený restrikčním enzymem Alul. Při PCR se používaly ·» ···· následující primery: forward primer 5'-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG-3'; reverzní primer 5'- GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA-3'. PCR proběhlo za následujících podmínek: teplota 93 °C po dobu 3 minut a 35 cyklů při teplotě 93 °C po dobu 30 vteřin, teplota 60 °C po dobu 1 minuty, teplota 7 0 °C po dobu 1 minuty a nakonec teplota 72 °C po dobu 3 minut. Naposledy, když se vzorky držely při teplotě 80 °C, se přidala Taq polymeráza.

Produkty PCR se štěpily restrikčním enzymem Alul (New England Biolabs) a separovaly se na 6% NuSieve (FMC) agarózovém gelu při napětí 120 voltů po dobu 4 hodin a teplotě místnosti. Gely se obarvily etidiumbromidem. V dráze 1 je markér velikosti, každý dílek znázorňuje 1 kb, dráhy 2 až 4 zahrnují tři rozdílné genotypy.

Obrázek č. 3 znázorňuje pozici PRLR na prasečím chromozomu

16. Spojení na více místech se provedlo za použití CriMap za účelem vytvořit mapu pohlaví. Za podstatné se považuje skoré LOD 3 nebo větší.

Obrázek č. 4 znázorňuje diagram fragmentů získaných z testu PCR za použití primerů SEQ ID NO: 1 a 2.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Na základě vysoké homologie a podobnosti při zpracování transkriptu sekvence lidské (Boutin, J., Edery, M., Shirota,

M., Jolicoeur, C., Lesueur, L., Ali, S., Gould, D., Djiane,

J., Kelly, P. (1989). Identification of cDNA Encoding a Long Form of Prolactin Receptor in Human Hepatoma and Brest Cancer Cells. Mol. Endocrinol.3, 1455-1461.) a králičí (Edery, M.,

Jolicoeur, C., Levi-Meyrueis, C., Dusanter-Fourt, I.,

Petridou, B., Boutin, J., Lesueur, L., Kelly., P., Djiane, J.

(1989). Identification and Sequence Analysis of a Second From a Prolactin Receptor by Molecular Cloning of Complementary

DNA From Rabbit Mammary Gland. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, ·· ···· • 4 44

4 4 4 4 4 •4 4 444 ····

IQ 444444 44 444 444 ^U 444 4444 4 4

4444 44 44 «4 ··

2112-2116.) cDNA kódující receptor prolaktinu, se tyto sekvence budou používat pro návrh degenerovaných primerů přesahujících 3' kódující a nepřekládanou oblast. Primery umožnily amplifikovat fragment o velikosti 500 párů baží ve vzorku prasečí genomové DNA a u lidského kontrolního vzorku. Při PCR za podmínek 93 °C po dobu 3 minut, 6 cyklů při teplotě 93 °C po dobu 30 vteřin, 47 °C po dobu 3 minut, 72 °C po dobu minut, 36 cyklů při teplotě 93 °C po dobu 30 vteřin, 53 °C po dobu 2 minut, 72 °C po dobu 5 minut a nakonec 72 °C po dobu 5 minut se použily forward primer 5'- TCA CAA GGT CAA C/TAA AGA TG-3' (SEQ ID NO: 4) a reverzní primer 5'- TGG/A AGA AAG/A AGG CAA G/ATG GT-3' (SEQ ID NO: 5). Nakonec, zatímco se vzorek udržoval při teplotě 80 °C, se přidala Taq polymeráza.

Fragmenty získané ze dvou zvířat se čistily a sekvenovaly v přímém a zpětném směru. Prasečí sekvence z kódující oblasti se překládaly na aminokyseliny a porovnaly se známými sekvencemi. Průzkumem databáze se zjistilo, že v králičí a lidské PRLR sekvenci jsou dvě nej lepší chybné párováni s 82 % respektive s 74 % pozitivy. Na základě sekvence prasečí DNA se navrhly primery (forward primer se sekvencí 5- CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3 (SEQ ID NO: 1) a reverzní primer se sekvencí 5'- GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA -3 (SEQ ID NO: 2)) za účelem amplifikace fragmentu o velikosti 457 baží ( obrázek č.

1). Ke štěpení amplifikovaného produktu se použily restrikční endonukleázy Taql, Sau3a, PvuII, MspI a Alul. Použitím restrikční endonukleázy Alul se zjistil polymorfismus v kódující oblasti genu. Fragmenty se rozdělily použitím elektroforézy na agarozovém gelu (obr. č. 2). Velikosti fragmentů byly přibližně 124, 110, 79, 77 a 67 párů baží, přičemž polymorfní místo se nachází na fragmentu o velikosti 110 párů baží. V případě, že je přítomno polymorfní štěpící místo vzniká fragment o velikosti 90 párů baží. Na obrázku č.

je možné vidět paterny fragmentů. Typovaly se geny referenčních rodin PiGMaP (Archibald, A., Haley, C., brown, • · • · · · · · ► · ····

J., Couperwhite, S., McQeen, H., Nicholson, M., Coppieters, W., van de Weghe, A., Stratil, A., Wintero, a., Fredholm, M., Larsen, N., Nielsen, V., Milan, D., Woloszyn, N., Robic, A., Dalens, M., Riquet, J., Gellin, J., Caritez, J.C., Burgaud, G., Olliver, 1., Bidanel, J.P., Vaiman, M., Renard, C., Gelderman, H., Davoli, R., Ruyter, D., Verstege, E., Groenen, M., Davies, W., Hoyheim, B., Keiserud, A., Andersson, L.,

Ellegren,

H,

Johansson,

Miller,

M., Merklund, L.

Anderson Dear, D., Signer, E.,Jeffreys, A., Moran, C., Le Tissier, P., Muladno, Rothschild, M., Tuggle, C., Vašek, D., Helm, J., Liu, H.C., Rahman, A., Yu, T.P., Larson, R.G., (1995) The PiGMaP Consortium Linkage Map of the

Schmitz, C.

Pig (Sus scofa)

Mamm. Genome 6, 157-175.

přičemž všechny dostupné rodiny jsou jako informační. Za použití software CriMap (Green, P., Falls, K., Crooks, S., (1990). Documentation for CRIMAP , version 2.4. Washington University School of Medicine, St. Louis.) se analyzovala přítomnost dvoubodového spojení genotypů, kde je podstatné skóre LOD větší než 3. Lokus PRLR je spojen se třemi markéry, které jsou mapovány na prasečím chromozomu 16 publikované mapy spojení PiGMaP. Aby se zhotovila co nej lepší mapa chromozomu 16 (obrázek č. 3) zahrnující všechny připojené markéry, provedla se také vícebodová analýza.

Příklad 2: Test PCR genetického markéru receptorů prolaktinu.

PCR amplifikační test se optimalizoval následujícími parametry.

Primery:

Forward primer: 5'- CCCAAAACAGCAGGAGAACG-3' (SEQ ID NO: 1) Reverzní primer: 5'- GGCAAGTGGTTGAAAATGGA-3' (SEQ ID NO: 2)

Podmínky PCR:

Reakční směs lOx PCR pufr (Promega) μΐ objem reakce 2,5 μΐ

I · · · · • · > · · • · ····

12,5 ng/μΐ DNA

Taq polymeráza

(Promega)	2, 0	μΐ
(Boehringer Mannheim)	0, 5	μΐ
forward primerů	0, 5	μΐ
reverzního primerů	0, 5	μΐ
voda	17,.	5 μ]
DNA	1,5	μΐ

0,125 μΐ kapkou sterilního termálního cykleru

Smíchá se prvních šest činidel a do každé zkumavky se přidá 18,5 μΐ této směsi. Pak se přidá DNA a směs se zalije minerálního oleje. Zkumavky se umístí a udržují se při teplotě polymeráza se smíchá se zbývající reakční směsí zkumavky se přidá 5 μΐ, přičemž se špička pipety musí ponořit pod vrstvu oleje..

80°C. Taq a do každé

Program termálního cykleru:

1.	teplota	93	°C	PO	dobu 3	minut
2.	teplota	93	°C	PO	dobu 30 vteřin
3.	teplota	60	°C	po	dobu 1	minuty
4.	teplota	72	°C	PO	dobu 1	minuty
5.	zpět na	krok 2	: opakuje	se po 34
6.	teplota	72	°C	PO	dobu 3	minut
7.	udržuj e	se	teplota 4°C

Za účelem kontroly produktu PCR 5 μΐ produktu PCR a 2 μΐ 6x koncentrovaného barviva nanese na 1 % agarozový gel. Elektroforéza proběhne proběhne za podmínek 120 V a po dobu 30 minut a gel se obarví etidiumbromidem.

Štěpení restrikční endonukleázou Alul:

• · • · · · ·* · · · · • · ·· ··

Štěpící směs (na 20 μΐ produktu PCR) lOx NE pufr 2 (New England Biolabs)

U/μΙ Alul μΐ (New England Biolabs) dd sterilní voda každý

2,5 μΐ

0,5 μΐ

2,0 μΐ

Činidla se smíchají a do každé zkumavky se přidá 5 μΐ. Vzorky se inkubují přes noc při teplotě 37 °C.

Gelová elektroforéza:

Fragmenty se separovaly na 6 % agarozovém gelu, kam se nanesl štěpený produkt a 5 μΐ 6x koncentrovaného barviva NuSeive (EMC) . Elektroforéza proběhla při napětí 120 voltů po dobu 3 hodin při teplotě místnosti. Velikosti fragmentů PCR-RFLP jsou přibližně 124, 110, 79, 77 a 67, přičemž polymorfní místo se nachází na fragmentu o velikosti 110 párů baží. V případě, že je přítomné polymorfní štěpící místo vzniká fragment o velikosti 90 párů baží. Heterozygot bude mít pruhy o velikosti 124, 110, 90, 79, 77 a 67. Zatímco homozygoty budou vykazovat pruhy o velikosti 124, 90, 79, 77 a 67 respektive 124, 110, 79 a 67.

Obrázek č. 4 je diagram fragmentů získaný z testu PCR (A je alela bez restrikčního místa Alul, B je alela s restrikčním místem Alul).

Příklad 3: Spojitost genotypu s velikostí vrhu.

Test PCR se provedl, jak se detailně popisuje v příkladu 2, na několika prasnicích získaných z Pig Iprovement Company, (PIC). Použitá zvířata byla prasnice PIC linie 19, která vrhla mláďata v časovém období šesti měsíců a prasnice, které se narodily během této doby se použily na chov. Posbíraly se krevní nebo tkáňové vzorky a zaslaly se do laboratoře, kde se •8 *8 · • 8 • 8 8 ·

88 8 • · ·

8 8 8 8 8

8 8 8

88 *8 ·(«»

88 * 8 8 8 tt 8 8 8

888 8 8 8 • 8

88 extrahovala DNA a použila se v testu PRLP PCR. Pro analýzu se použily jeden až tři záznamy samic. Odhadovaná hodnota množeni pro celkový počet narozených (BV TNB) se odhadl za použití smíšeného lineárního modelu, kde následná parita prasnice je považován za opakovaný záznam. Použily se pouze první tři parity prasnice. Model parity zahrnuje ko-variace věku, při kterém dochází k vrhu, fixní účinky parity, typ ošetřování (přirozený nebo AI), měsíc vrhu a náhodné permanentní účinky prostředí a účinky zvířat. Současná hodnota h² je 0,10 a hodnota opakovatelnosti je 0,21. Průměrný počet narozených mláďat (AV NB) se vypočítal tak, že se vzal pro každou prasnici aritmetický průměr všech parit (1 až 3). Srovnání genotypů se udělalo v případě (BV TNB) a (AV NB) tak, že se udělal průměr hodnot BV TNB a AV NB u každého genotypu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1: Průměrné hodnoty u vzorku zvířat L19 s genotypem PRLR

Genotyp BB
(n=18)	BV TNB	AV NB
průměr	0,2036	10, 32
Standarní odchylka	0,3984	1,746193
Standardní chyba	0,0939	0,411838

Genotyp AB
(n=75)	BV TNB	AV NB
Průměr AB	0,1203	9, 66
Standarní odchylka AB	0,5317	2,77238
Standardní chyba 7KB	0,0622	0,320136

Genotyp 7KA
(n=109)	BV TNB	AV NB

• « « · • · · ·

Průměr AA	0,0755	9, 75
Standarní odchylka AA	0,5757	2,513279
Standardní chyba AA	0,0551	0,243064

Příklad 4: Shrnutí analýz receptoru prolaktinu u Velké bílé linie, „Meishan syntetické linie a „Landrace linie.

Do analýzy velikosti vrhu se zahrnulo všech 2 714 záznamů vrhu od 1 077 prasnic. Vlastnosti zahrnují celkový počet narozených mláďat a počet živě narozených mláďat (NBA) z pěti různých linií PIC. Mezi pět testovaných linií patří „Large White (dva různé původy) a „Landrace linie, stejně jako syntetické linie zahrnující 3/4 „Duroc, 1/4 „Large White a „Large White/Meishan Ukázalo se, že genotyp PRLR vysvětluje statisticky podstatné variace velikosti vrhu u třech testovaných linií. Dvě z linií nevykazují žádný statisticky podstatný účinek (P>0,l, výsledky nejsou uvedeny). V tabulce č. 2 jsou shrnuty střední hodnoty nejmenších čtverců TNB a NBA pro každou ze tří statisticky podstatných linií.

DNA se extrahovala z krve nebo z tkáně ocasu. DNA se podrobila analýze, jak se popisuje shora v textu v příkladu 2.

Modely zahrnovaly stejné vlivy: sezónu chovu, typ ošetření, receptor prolaktinu, parita (1, 2, 3+) a ESR (receptor estrogenu) a náhodné účinky: chovný samec.

Testovala se také podstatnost interakce mezi chovem, ESR a receptorem prolaktinu. Dědičnost v případě rysů vrhu se odhaduje jako 0,10 a opakovatelnost jako 0,21. Účinky substituce alely se odhadly substituováním genotypu PRLR heterozygota, který zahrnuje počet přítomných alel A (0,1 nebo

2) . Dominatní účinky se odhadly jako odchylky průměru heterozygota z průměrného homozygotního genotypu.

Hlavní závěry:

• 9 9 9 9 9

4 · · · · • · 9 4 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 tt 9 9 9 9 4 4

9 9 9 9 99

9 9 9 9 • · · 4 9 • · 4·· 444

4 4 4

C4 44 44 • linie „Large White synthetic • Indikace dominantního účinku Vzorek obsahoval 400 prasnic s 1 197 záznamů vrhu. Zvířata typu AA vykazují hodnotu Počet živě narozených mláďat (NBA) o 0,66 selete/vrh vyšší než u dvou dalších genotypů (p<0,05). Existují indikace dominantního účinku alely B.

• Linie „Meishan Synthetic • Podstatný dominantní účinek (nadměrná dominance) u všech parit, ale hlavně u první parity.

Vzorek zahrnuje 261 prasnic s 832 záznamy vrhu. U této linie existuje důkaz aditivního účinku v případě hodnot TNB (P<0,05) a NBA ((P<0,05) a účinek nadměrné dominance v případě NBA (<0,01).

• Linie „Landrace Synthetic • Indikace aditivního účinku.

Vzorek zahrnuje 416 prasnic s 685 záznamy vrhu. V případě TNB (P<0,08) a NBA (P<O,0) se detekoval mezi dvěma homozygotními genotypy rozdíl ve vrhu mláďat větší než jedno prase na vrh, přičemž favoritní je alela A.

Účinky na TNB vykazují pro každou populaci stejné trendy jako NBA. Výsledky uvedené v tabulce č. 2 indikují, že u tří běžně dostupných linií, měřeno TNB a NBA, má PRLR podstatný účinek na velikost vrhu. Je zřejmé, že genetické vybavení každé rozdílné linie je součást způsobu a velikosti jakou je rys ovlivněn. U libovolné z testovaných linií nebyly nalezeny žádné podstatné rozdíly v hodnotě průměrné váhy mláďat po narození. V normálním případě existuje inverzní vztah mezi velikostí vrhu a průměrnou váhou při narození. Alela receptorů prolaktinu může proto poskytnout způsob zvýšení váhy při narození větších vrhů.

• · • · · · · • · · · ·

Tabulka č. 2: Střední hodnoty nejmenších čtverců u každého genotypu PRLR u všech parit v případě TNB, NBA a průměrné váhy při narození (ABW) u všech tří běžných linií prasat.

Běžná linie	Genotyp PRLR	TNB	NBA
„Large White	AA	12,51	12,39
Synthetic	AB	12,35	11,73
	BB	12,71	11,73 P<0,05
účinky	a	0,10	- 0,33^b
	d	- 0,26	- 0,33^a
„Meisham	AA	13, 64	12,94
Synthetic	AB	14,35	13, 74
	BB	13, 96	13,27
		P<0,05	P<0,05
účinky	a	0, 16^b	0, 16^b
	d	0, 55^b	0, 63^c
„Landrace	AA	12,13	11,33
Synthetic	AB	11,72	10, 92
	BB	10,98	10, 31
		P<0,08	P<0,10
účinky	a	0, 51^b	0, 47^b
	d	0, 17	0, 10

a = aditivní účinek; d = dominanntí účinek; účinky jsou podstatné při ^aP < 0,1, ^bP < 0,05, ^CP < 0,01.

Příklad 5: Odlišnosti mezi různými chovy.

Typovaly se vzorky ze sedmi chovů, mezi něž se zahrnuly americké chovy Chester White, Duroc, Hampshire, Landrace a Yorkshire; the Chinese Meishan; a European Large White (Tabulka č. 3).

Tabulka č. 3

Chov	Frekvence genotypu	Frekvence alel
	AA	AB	BB	A	B
Landrance n = 9	0, 56	0, 33	0, 11	0, 72	0, 28
Duroc n = 10	0, 5	0, 5	0	0, 79	0, 21

φ · • φ φφφ φ φ φ

Φ Φ φ φ φφ φφφφ • ΦΦΦ φ φ · φ φ φφφφ φ φφφ φφφφ φφ ···· ·· · φ φ ·

Yorkshire n - 12	0	0, 75	0,25	0, 37	0, 63
Chester White n = 10	0,1	0, 3	0, 6	0,25	0, 75
Hampshire n = 11	0	0, 09	0, 91	0,05	0, 95
Meishan n = 9	0, 33	0, 44	0, 22	0, 56	0, 44
Large White n = 11	0, 09	0, 46	0,45	0, 32	0, 68

U některých plemen existují rozdíly ve frekvencích genu PRLR. Zajímavá je existence polymorfizmu, která se nachází v 3' oblasti genu, protože je možné pozorovat v této oblasti genu alternativní sestřih PRLR u jiných druhů. Rozdíly frekvence alel mezi chovy naznačuje, že jedna alela může být v některých populacích na rozdíl od jiných selektována.

Citace:

Jammes, H.,Schirar, A., Djiane, J. (1995) Differential Patterns in Luteal Prolactin and LH Receptors During Pregnancy in Sows and Ewes. J. Reprod. Fertil. 73, 27-35.

Kelly, P., Djiane, J., Postel-Vinay, M., Edery, M. (1991). The Prolactin/Growth Hormone Receptor Family. Endocrin. Rev. 12.235-251.

Rothschild, M., Jacobson, C., Vaske, D., Tuggle, C., Wang, L., Short, T., Eckardt, G., Sasaki, S., Vincent, A., McLaren, D., Southwood, 0., van der Steen, H., Mileham, A., Plastow, G. (1996). The Estrogen Receptor Locus is Associated With a Major Gene Influencing Litter Size in Pigs. Proč. Nati. Acad. Sci. 93, 201-205.

0000

Rui, H., Djeu, J., Evans, G

Kelly, P., Farrar, W. (1992)

Prolactin Receptor Triggering. J. Biol. Chem. 267, 2407624081.

Yuan, W., Lucy, M. (1996). Effects of Growth Hormone, Prolactin, Insulin-Like Growth Factors, and Gonadotropins on Progesterone Secretion by Porcine Luteal Cells. J. Anim. Sci. 74, 866-872.

w 4*4

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob testování prasat k určení těch, která s větší pravděpodobností vykazují větší vrhy, vyznačující se tím, že se z prasete získá vzorek genetického materiálu; a v uvedeném vzorku se testuje přítomnost polymorfizmu v genu receptoru prolaktinu, který je spojován se zvýšenou velikostí vrhu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený testování se vybralo ze skupiny, která zahrnuje analýzu polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP), heteroduplexovou analýzu, polymorfismus konformace jednořetězcové DNA (SSCP), gelová elektroforéza s denaturačním gradientem (DGGE) a gelová elektroforéza s teplotním gradientem (TGGE).

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že test přítomnosti uvedeného polymorfismu zahrnuje štěpení uvedeného genetického materiálu restrikčním enzymem, který štěpí gen receptoru prasečího prolaktinu alespoň v jednom místě; separaci fragmentů získaných uvedeným štěpením; detekci restrikčního paternu, který tvoří uvedené fragmenty; a srovnání uvedeného paternu s druhým restrikčním paternem genu receptoru prasečího prolaktinu získaného použitím uvedeného restrikčního enzymu, přičemž uvedený druhý restrikční patern je spojován se zvýšenou velikostí vrhu.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený restrikční enzym je Alul.

5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená separace se provádí gelovou elektroforézou.

6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že srovnání uvedených restrikčních paternů zahrnuje identifikaci velikosti specifických fragmentů a porovnání velikostí uvedených fragmentů.

7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že před uvedeným štěpením se amplifikuje množství genu receptoru prasečího prolaktinu nebo jeho část, která obsahuje uvedený polymorfismus.

8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus je polymorfní restrikční místo Alul.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedené restrikční místo se nachází ve 3'kódující oblasti genu receptoru prasečího prolaktinu.

10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že amplifikace zahrnuje selekci sekvence přímého a zpětného primerů schopného amplifikovat oblast genu receptoru prasečího prolaktinu, který obsahuje polymorfní místo Alul.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený přímý a zpětný primer je vybrán ze a založen na sekvenci SEQ ID NO: 3.

12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, sekvence SEQ ID NO: 4a SEQ ID NO:

13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, se vybral ze skupiny zahrnující se

NO: 4 a uvedený zpětný primer je vybrán ze skupiny zahrnující ž e uvedené primery jsou ž e uvedený přímý primer kvence SEQ ID NO: 1 a SEQ ID

sekvence SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 5. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, ž e uvedená sada primerů zahrnuje SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2. 15. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se tím, ž e detekce různých

velikostí uvedených fragmentů zahrnuje separaci uvedených fragmentů na základě velikosti za použití gelové elektroforézy v přítomnosti kontrolního fragmentu DNA, jehož velikost je známa; kontakt uvedených separovaných fragmentů se sondou , která hybridizuje s uvedenými fragmenty za vzniku komplexů sonda-fragment; a stanovení velikosti separovaných fragmentů detekcí přítomnosti komplexů fragment-sonda a stanovení jejich relativní polohy vzhledem k uvedenému kontrolnímu fragmentu DNA.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený restrikční enzym je Alul a uvedený RFLP se extrahoval ze skupiny zahrnující fragment s 110 páry baží a fragment s 90 páry baží.

17. Způsob identifikace genetického markéru velikosti vrhu u prasat, vyznačující se tím, že zahrnuje množení samců a samic prasat stejného plemene nebo kříženého • · · · · · • · · · · · 8 · · ··· ··· • · · · · • · · · · · plemene nebo odvozených od podobných genetických linií; stanovení počtu mláďat produkovaných každou samicí prasete; stanovení polymorfizmu v genu receptoru prolaktinu u každé samice prasete; a stanovení spojitosti počtu mláďat produkovaných každou samicí prasete s uvedeným polymorfismem, přičemž se identifikuje polymorfismus velikosti vrhu prasete.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále zahrnuje výběr prasat pro chov, u kterých se předpovídá na základě uvedeného markéru zvýšená velikost vrhu.

19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedená analýza zahrnuje štěpení PCR amplifikované DNA restrikčním enzymem Alul.

20. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus spojovaný se zvýšenou velikostí vrhu se detekoval použitím prvního a druhého primerů, které obsahují alespoň 4 konsekutivní báze v sekvencích SEQ ID NO: 1 a 2.

21. Sada pro hodnocení vzorku prasečí DNA, vyznačující se tím, žev kontejneru obsahuje činidlo, které identifikuje polymorfismus v genu receptoru prasečího prolaktinu.

22. Sada podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedené činidlo je primer, který amplifikuje gen receptoru prasečího prolaktinu nebo jeho fragment.

• · ·

23. Sada podle nároku 24, vyznačující se tím, že dále obsahuje DNA polymerázu, restrikční enzym, který štěpí gen receptoru prasečího prolaktinu alespoň v jednom místě; a první a druhý primer schopný amplifikovat oblast genu receptoru prasečího prolaktinu, který obsahuje polymorfní místo.

24. Primer pro testování přítomnosti polymorfního místa Alul v genu receptoru prasečího prolaktinu, vyznačující se tím, že uvedený primer obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4a SEQ ID NO: 5.

25. Genetický markér spojovaný se zvýšenou velikostí vrhu u prasat, vyznačující se tím, že obsahuje polymorfismus v genu receptoru prasečího prolaktinu.

26. Genetický markér podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus je restrikční místo Alul.

27. Markér podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený polymorfismus se nachází ve 3'překládané a nepřekládané oblasti genu receptoru prasečího prolaktinu.

28. Sekvence DNA ze 3'překládané a nepřekládané oblasti genu receptoru prasečího prolaktinu, přičemž uvedená sekvence zahrnuje SEQ ID NO: 3.

29. Primer navržený pro amplifikaci polymorfního restrikčního místa Alul v genu receptoru prasečího prolaktinu, vyznačující se tím, žejej tvoří nepřetržitá

00 0000

0 0 řada čtyř nebo více bází, které pocházejí ze sekvence SEQ ID NO: 3.

30. Primer navržený pro amplifikaci polymorfního restrikčního místa Alul v genu receptoru prasečího prolaktinu, vyznačující se tím, žeje reverzním primerem generovaným ze sekvence SEQ ID NO: 3.

31. Způsob testování prasat ke stanovení těch, které s větší a/nebo s menší pravděpodobností produkují větší vrhy, Primer navržený pro amplifikaci polymorfního restrikčního místa Alul v genu receptoru prasečího prolaktinu, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení alel receptoru prolaktinu přítomných u prasete; stanovení alel jiných markérů genů známých tím, že ovlivňují velikost vrhu; a selekci zvířat s příznivými kombinacemi alel před zvířaty, které nesou nepříznivé kombinace.

32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že druhý gen, který určuje velikost vrhu je ESR.

33. Způsob podle nároku 31,