KR20010102957A - 부모로부터 각인된 특성에 의한 동물 선별법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 원하는 유전 형질 또는 잠재적인 표형 형질, 구체적으로 근육량 및/또는 지방 축적에 관련된 특성의 여부에 대해기 위해 사육 가축 또는 도살된 가축을 선별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 소망하는 유전 형질 또는 잠재적인 표현 형질에 대해 돼지를 선별하는 방법으로, 위치 2p1.7에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체에 위치하는 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 대해 상기 돼지에서 얻은 샘플을 실험하는 단계를 포함한다.
Description
지금까지 가축에 대한 번식 계획은 사육 성공 특성(farm performance traits) 및 육질에 초점이 맞추어져 왔다. 이는 번식의 성공, 우유 생산, 살코기/지방 비율, 다산성, 성장률 및 사료 효율과 같은 특징들에 있어서의 실질적인 향상을 가져왔다. 비교적 간단한 성능 테스트 데이터가 이러한 개선들에 대해 근거가 되며, 선택된 특징들은 다수의 유전자들, 각각의 작은 작용(극소 유전자 모델)에 의해 영향을 받는 것으로 여겨진다. 현재, 이러한 분야에서 중요한 몇 가지 변화가 일어났다. 첫째, 몇몇 사육 유기체의 사육 목적이 "전통적인" 생산성 외에도 육류의 품질 기여도를 포함하기 시작했다. 둘째, 기존까지와 다른 새로운 사육 목적이 지금까지 믿어져 왔던 극소 모델에 상반되는 것으로서, 비교적 큰 이펙트(effect)(주유전자로 알려짐)와 관련되어 있을 수 있다는 증거가 쌓이고 있다.
현대의 DNA-기술은 이들 주유전자를 연구할 기회를 제공하고, 이러한 연구는 특히 잠재적인 사육 동물에 대해서 직접적인 육류의 품질 평가가 불가능하기 때문에 육류의 품질 개선에 대해 매우 확실한 경로이다. 또한, 살코기/지방 비율, 성장률과 사료 효율과 같은 그 밖의 특징에 대하여 현재 DNA 기술이 매우 효과적이다. 또한, 이러한 특징들은 언제나 살아 있는 동물에서 용이하게 측정할 수 있는 것은 아니다.
즉, 어떠한 DNA 마커 정보도 없이 격리 분석을 사용하여 몇몇 거대 유전자에 대한 증거가 독창적으로 얻어졌다. 후에, 분자 수준의 연구가 수행됨으로써 유전자 지도상에서 이들 유전자의 위치가 검출되었다. 사실, 매우 큰 이펙트의 대립 유전자를 제외한 DNA 연구에는 경제적으로 중요한 대부분의 형질에 대한 유전자 특성의 분석이 요구된다. DNA 마커는 코트 색상과 같은 정성적인 형질에 기여하는 유전자 또는 대립 유전자의 위치를 확인하는 데 사용될 수 있고, 성장률, IMF 등과 같은 정량적인 형질에 대한 실질적인 이펙트를 가지는 유전자 또는 대립 유전자를 검출하는데 사용될 수도 있다. 이러한 연구는 QTL(정량적인 형질 유전자 자리) 지도 작성이라 일컬어지며, 여기서 QTL은 상기 정량적인 형질에 영향을 줄 수 있는 (상기 동물 내 또는 그들 자손 내의) 유전자 정보가 위치하는 동물의 핵산 게놈의 적어도 일부를 포함한다. DNA 수준의 정보는 특정 거대 유전자를 군집 내에 고정할 뿐 아니라 이미 선택된 정량적인 형질의 선택을 조력할 수 있다. 표현 형질에 대한 데이터 이외의 분자 정보는 선택의 정확성을 증가시키고, 이는 선택 반응을 증가시킬 수 있다.
육질 또는 도체(carcass)의 품질에 있어서의 개선은 단지 연하고 마블링(marbling)과 같은 형질의 변화 정도뿐 아니라 균질성을 증가시킨다. 주유전자의 존재는 원하는 방향으로 육질 개선에 있어 커다란 진보를 하도록 훌륭한 기회를 제공한다. 둘째, 본 발명자들은 산물 내에 관련 유전자를 고정할 수 있기 때문에, 변이가 감소될 것이다. 다른 관점은 주유전자를 선별하여 특정 시장을 위해 차별화하는 것이다. 몇몇 종, 특히 돼지, 양, 사슴 및 식용 소에서 연구가 수행된다.
특히, 육류 생산에 대한 집중적인 선택은 몇몇 가축종들에 있어 과도한 근육질 및 살코기를 가지는 동물로 귀착시켰다. 최근, 이러한 표현 형질을 초래하는 몇몇 유전자의 유전자 지도 작성 및 클로닝, 보다 효율적인 표지 보조 선택의 구현, 표적화된 약품 개발(성능 향상 제품) 및 형질전환(transgenesis)이 용이해졌다. 리아노딘(ryanodine) 수용체 내의 돌연변이(Fuji 등, 1991; MacLennan와 Phillips, 1993) 및 마이오스타틴 내의 돌연변이(Grobet 등, 1997; Kambadur 등, 1997; McPherron과 Lee, 1997)는 돼지 및 소 각각에서 근육의 이상 비대를 초래하는 것으로 밝혀졌으며, 예를 들면 근육질 및/또는 지방 축적에 대해 주된 작용을 미치는 유전자는 돼지의 4번 염색체(Andersson 등, 1994) 및 양의 18번 염색체(Cooket 등, 1996)에 유전자 지도가 작성되었다.
그러나, QTL가 동정되었다 하더라도, 현재는 정보가 상업적인 사육 프로그램 내에서 사용이 제한되고 있다. 당업자들은 QTL의 기초가 되는 특정 유전자를 동정할 필요가 있다는 결론에 이르렀다. 일반적으로 QTL 부위는 비교적 크고 많은 유전자들을 함유할 수 있기 때문에, 이는 실질적으로 힘든 작업이다. 따라서, 포함될 수 있는 많은 것들로부터 관련 유전자를 동정하는 것이 동물 사육에 있어 상당한 장애물로 남아있다.
본 발명은 원하는 유전 형질 또는 잠재된 표현 형질, 구체적으로 근육량 및/또는 지방의 축적 특성에 대해 사육 가축(breeding animal) 또는 도살될 가축(animal destined for slaughter)을 선별하는 방법에 관한 것이다.
도1은 Wild Boar/Large White 이종 교배에서 염색체 2의 QTL 분석에서 얻어진 테스트 통계 곡선을 나타내는 도면이다. 그래프는 표시된 특징의 염색체에 따라 주어진 위치에서 단일 QTL의 가설을 테스트하는 F 비율을 표현한다. Kosambi centiMorgan에서 마커간의 거리를 가진 마커 맵이 X 측에 주어진다. 수평선은 유전자가 유의적이라는 것을 나타내고 햄에서 특징적인 살코기의 암시적인 수준이고;유사한 유의성 문턱치가 다른 특징에서 얻어진다는 것을 나타낸다.
도 2는 특징적인 근육 비대성을 가진 Pietrain 돼지를 나타내는 그림.
도 3은 6개의 근육량을 표현하는 6개의 표현형과 돼지 염색체 2에서 지방 축적에 대해 표현형 Pietrain X Large White 이종 교배에서 얻은 막대 그래프 곡선이다. 마이크로새틀라이트 마커 지도에 대한 결합 분석에 의해 결정되는Igf2및MyoD유전자의 가장 가능성 있는 위치가 나타나 있다. H0는 QTL이 없는 null-가설로 정의되는 것이고, H1은 멘델학파의 QTL의 존재에 대해 시험한 것이고, H2는 부계 발현된 QTL의 존재에 대해 시험한 것이고, H3은 모계 발현된 QTL의 존재에 대해 시험한 것이다. 3a: log10(H1/H0), 3b: log10(H2/H0), 3c: log10(H3/H0)
도 4a는 인간ref. 17에 따라서 의Igf2유전자의 구조와 ref.16으로 기재된 성숙한 돼지의 간 cDNA 서열을 나타내는 도면이다.nt421(G-A)변이 및Swc9마이크로새틀라이트의 위치가 나타나 있다. 도 4b는 10-주된 태아의 골격근 및 간에서 해당하는 마커를 사용하여Igf2의 단일 대립 유전자(부계) 발현을 설명하는 도면이다. 유전자의 DNA에서nt421(G-A)다형질 및Swc9마이크로새틀라이트의 PCR 증폭에서는 태아의 단일 접합을 명확하게 보여주지만, 부계의 대립 유전자만이 간의 cDNA(nt 421(G-A) 및Swc9) 및 근육의 cDNA(Swc9)에서 검출된다. 태아의 근육에서 유래한nt421(G-A)의 RT-PCR 산물의 부재는 이 조직에서 엑손 2를 포함하는 mRNA의 분재를 가리킨다. 태아의 대립 유전자의 부계 유래는 수퇘지와 암퇘지의 유전자형으로부터 결정된다(데이터는 나타나지 않음).
도 5는 BAC-PIgf2-1(INS 및Igf2유전자를 포함) 및 BAC-PIgf2-2(Igf2및 H19 유전자를 포함)의 상대적인 위치를 나타내는 NotⅠ 제한 지도를 나타내는 도면이다.
도 6은 표준 과정 및 자동 서열기를 이용한 무차별 서열화된 BAC-PIgf2-1에서 유도된 콘티그 1 내지 콘티그 115의 핵산 서열을 나타내는 도면이다.
도 7은 도 6의 돼지의 콘티그와 인간의 오르소로그 서열 사이의 유사성을 나타내는 도면이다.
도 8은 EZ::TN 트랜스포손 어프로치 및 ABI 자동 서열기를 이용하여 서열화되고 서브클론화된 BAC-PIgf2-2(BAC-PIgf2-1에서는 존재하지 않는 24Kb NotⅠ 단편)에서 유래된 콘티그 1 내지 콘티그 7의 핵산 서열을 나타내는 도면이다.
도 9는 도 8의 돼지 콘티그와 인간에서 오르소로그 서열 사이의 유사성을 나타내는 도면이다.
도 10은 Pietrain, Large White, 및 Wild Boar 개체에서 격리된 유전자 DNA로부터Igf2및 플랭킹 위치에서 DNA 서열 다형성을 나타내는 도면이다.
본 발명은 원하는 유전 형질 또는 잠재된 표현 형질을 가지는 가축을 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 부모로부터 각인된 정성적인 또는 정량적인 형질의 유전자 자리(QTL)의 존재에 대해 상기 동물들을 테스트하는 단계를 포함한다. 여기서, 가축은 원하는 유전 형질 또는 잠재된 표현 형질에 대해 선별된 것이거나 또는 선별된 동물에서 유래된 동물로 정의된다.
가축은 유전자 및 표현 형질의 변종의 풍부한 자원이며, 전통적인 가축 사육은 원하는 유전 형질 또는 잠재된 표현 형질을 가지는 동물 또는 그들의 자손을 선별하는 과정을 수반한다. 이러한 선별 과정은 지난 세기 동안 사육 경험 및 멘델의 유전법칙을 이용함으로써 활용되었다. 가축 사육 프로그램에 있어 가장 큰 문제 중 하나는 재생산 용량과 생산 형질간의 부정적인 유전적 상호관계이다. 예를 들면, 소의 경우에는 일반적으로 우유 생산성이 높으면 암소와 황소가 살이 여위고, 가금류의 경우, 브로일러 계통은 달걀 생산성이 낮고 알 낳는 닭의 경우에는 일반적으로 근육 성장률이 매우 낮다. 또한 돼지의 경우에는 다산성 암퇘지는 일반적으로 지방이 많고 비교적 살코기가 적으며, 반면 양의 경우 다산성 품종은 도살체의 품질이 낮다. 본 발명은 부모로부터 전해진 다양한 형질의 특징에 대한 지식이 예를 들면 근육 생산 또는 성장과 관련된 부모로부터 물려받은 QTL에 대한 조상 혈통의 상동성을 선별하도록 함을 제공하고, 이러한 형질에 대한 선별은 재생산 품질을 위한 조상주에 있어서 덜 엄격할 수 있다. 지금까지 유전적 또는 어버이로부터 물려받은 현상은 가축을 선별하는 데 사용되지 않았으며, 이는 실제 사육 프로그램에서 알기 어려운 유전자 특성을 사용하려고 생각하지도 않았다. 본 발명은 사육 프로그램을 제공하며, 여기서 본 명세서에서 입증되는 바와 같이 원하는 형질의 어버이로부터 물려받은 특징에 대한 지식은 변형된 동물 모델을 사용하는 사육 프로그램, 예를 들면 BLUP 프로그램으로 귀착된다. 이는 종래의 사육 프로그램에 비해 사육 가치 견적의 정확성을 높이고 선별 속도를 증가시켰다. 지금까지, 종래의 BLUP 프로그램의 평가에 있어 어버이로부터 물려받은 형질의 영향은 경시되었다. 본 발명에 의해 제공되는 바와 같이 원하는 형질의 어버이의 특징을 사용하고 이해하면 DNA 테스트 없이도 어버이로부터 이어받았을 지를 선별할 수 있다. 예를 들면, 어버이로부터 이어받은 것에 의해 특징지어지는 유전자를 선별하면 균질성을 증가시킬 수 있고, 다른 어버이의 대립 유전자를 고려하지 않고도 "양호한 또는 원하는" 대립 유전자에 대한 (말단의) 어버이 상동성을 모든 자손에게 전달되고, 그 자손은 원하는 어버이의 대립 유전자를 모두 발현할 것이다. 이는 보다 균일한 자손을 초래한다. 모계로부터 유래되는 관심있거나 유망한 대립 유전자 또는 종종 모계로부터 유래되는 대립 유전자에 대해 반대 이펙트를 가지는 대립 유전자, 예를 들면, 돼지와 같은 육류 동물에서, 근육 내 지방 또는 근육량과 같은 육질 형질과 관련된 대립 유전자는 어미주에 고정될 수 있는 반면, 감소된 등 지방과 관련된 대립 유전자는 아비주에 고정될 수 있다. 그 밖의 원하는 조합으로는 예를 들면, 암컷주에 있어서의 번식력 및/또는 우유의 수율과 수컷주에 있어서의 성장률 및/또는 근육량이 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 원하는 유전 형질 및 잠재된 표현 형질을 가지는 가축을 선별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 동물로부터 얻어진 핵산 샘플에 대해 어버이로부터 물려받은 정량적인 형질의 유전자 자리(QTL)의 존재를 테스트하는 단계를 포함한다. 핵산 샘플은 일반적으로 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 동물 신체의 다양한 부분으로부터 채취될 수 있다. 핵산 테스트 용도로 사용되는 통상적인 샘플은 혈액 샘플 또는 피부나 점막 표면 샘플이지만, 기타 조직으로부터 얻어지는 샘플도 사용될 수 있으며, 특히 정자 샘플, 난모 또는 태아 샘플이 사용될 수 있다. 이러한 샘플에서, DNA 또는 RNA일 수 있는 특정 핵산의 존재 및/또는 서열은 당 기술분야에 공지된 혼성화나 핵산 증폭 또는 서열화 방법과 같은 당 기술분야에 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있다. 본 발명은 핵산의 존재에 대해 이러한 샘플을 테스트하는 방법을 제공하며, 이 때 그것과 관련된 QTL 또는 대립 유전자는 부모로부터 물려받은 현상과 관련이 있으며, 예를 들면, 상기 QTL의 부계 또는 모계 대립 유전자가 상기 동물 내에서 우세하게 발현될 수 있는 지의 여부가 결정된다.
가축의 사육 프로그램의 목적은 동물의 유전자 조성을 개선시킴으로써 이들 동물의 성능을 향상시키는 것이다. 본질적으로, 이러한 개선은 관심이 되는 성능 특징에 영향을 주는 대립 유전자 대한 가장 유망한 대립 유전자의 빈도를 증가시킴으로써 발생된다. 이들 유전자를 QTL이라 한다. 90년대 초반까지 기초적인 QTL에대한 분자학적인 지식 없이 생물 측정법의 사용을 통해 유전학이 발전되었다.
90년대 초반부터 게놈에서의 최근의 발전으로 인하여, 관심 형질을 기초로 하는 QTL의 동정이 착안 가능하게 되었다. 본 발명은 정량적인 형질의 유전자 자리 지도를 작성하여 가축을 선별하는 데 유용한 부모로부터 각인된 QTL를 동정하고 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 유전적 또는 부계의 각인 현상이 가축을 선별하는 데 전혀 활용된 적이 없었고, 실제적인 사육 프로그램에서 배타적인 유전 특성을 채용할 수 있다는 것이 고려된 것이 없었다. 예를 들면, Kovacs and Kloting (Biochem. Mol. Biol. Int. 44:399-405, 1998)에서, 부모로부터 각인이 언급되지 않았으며 제안조차 되지 않았고, 암컷 래트에서 형질의 결합을 발견하였지만, 수컷 래트에서는 발견되지 않았으므로, 염색체 영역과 관련된 성특이성의 가능성을 제안하지 않았고, 따라서 부모의 각인, 하나의 부모의 각인된 형질이 바람직하지만 암컷 또는 수컷의 자손에서 성특이적으로 발현되는 현상을 발표하는 것은 포함하지 않았다.
본 발명은 유전자 마커에 의해 결합 분석을 하여 게놈에서 부모에 의해 각인된 QTL의 초기 국지화 및 부모로부터 각인된 유전자 및 그 안의 임의의 돌연변이의 실제적인 동정을 제공한다. 상기 부모로부터 각인된 QTL의 분자학적인 지식은 효과적인 사육 설계를 제공하도록 한다. 부모로부터 각인된 QTL의 분자학적 지식이 사육 프로그램에 적용되는 것에는: 관심의 모집단에서 기능적으로 독특한 부모로부터 각인된 QTL 대립 유전자의 격리를 확인하기 위한 마커 보조 격리 분석, 선별의 정확성, 선별의 강도를 높여주거나 또는 부모로부터의 각인 현상의 이해를 이용한세대 간격을 줄임으로써 유전자 반응을 향상시키도록 혈통 내에서 실행되는 마커 보조 선별(MAS), 도너로부터 수여 집단으로 바람직한 부모의 각인 QTL 대립 유전자를 전달하기 위해 마커 보조 유전자 이입(MAI), 동정된 부모로부터의 QTL의 유전공학, 및 형질전환 기술을 이용한 사육되는 가축의 유전적 변형, 상기 QTL의 분자학적 지식을 연구하는 표적화된 약물 개발을 이용하여 성능이 향상된 제품의 개발을 포함된다.
본 발명자는 QTL의 부모로부터 각인의 실질적인 용도를 결정하기 위해 2개의 개별적인 연구를 실행하였다.
첫 번째 실험에서는 이전에 기재된 Pietrain X Large White 이종 교배에 실시되는 것으로, 이 데이터의 가능성은 부계(부계의 대립 유전자만이 발현됨)와 모계 각인(모계의 대립 유전자만이 발현됨)의 모델에서 계산되어 종래의 "멘델의" QTL의 모델의 자료의 가능성과 비교하였다. 결과에서는 QTL가 부계로 발현되고 F1 암퇘지에서 유전된 QTL 대립 유전자(Pietrain 또는 Large White)가 F2자손의 도체 품질 및 정량에 대해 어느 정도 효과가 없다는 사실이 현저히 드러났다. 부계로 발현된 QTL의 존재에 대해 시험한 경우, 매우 현저한 로드스코어(lodscore)가 얻어지지만, 암퇘지에 의해 전달된 염색체에 관한 연구한 경우, QTL의 격리에 대해서는 전혀 증가가 없는 것으로 보인다. 동일한 각인된 유전자가 다른 형질에 대해 관찰된 효과에 대해 반응하는 것으로 보이는 모든 형질에 대해 동일한 경향이 얻어졌다. 표 1은 유전된 부계의 QTL 대립 유전자에 의해 정리된 F2자손에 대한 최대 가능한(ML) 표현형 평균을 기록하고 있다.
Wild Boar X Large White로 실행한 2번째 실험에서 도체 조성, 지방, 육질, 및 성장 특징의 QTL 분석을 각인된 작용의 존재를 시험하는 통계적 모델을 사용하여 염색체 2 지도로 실시하였다. 2p의 최말단의 선단에 위치한 부계 발현된 QTL의 뚜렷한 증거가 얻어졌다(도 1; 표 1). QTL의 뚜렷한 부계 발현은 부계로 유전되는 대립 유전자의 군집 유래에 따라 2개의 계급으로 나뉘어지는 최소 제곱 평균으로 설명된다(표 1). 주어진 부계로 각인된 QTL에 대해, QTL에 연결된 유전적 마커, QTL과 결합 불균형인 유전적 마커를 이용하거나, 또는 QTL내에 실재의 임의의 돌연변이를 이용하여, 격리 분석, 마커 보조 선별(MAS), 및 마커 보조 유전자 이입(MAI)을 도와주는 마커를 삽입하였다.
QTL에 특징이 있는 기원의 부모 작용에 대해 이해하는 것으로, 사육 프로그램에서 이의 최적 사용을 가능하게 한다. 또한, 부모의 각성 모델에서 마커 보조 격리 분석은 QTL 대립 유전자 작용의 우수한 측정치를 제공할 것이다. 또한, QTL을 적절하게 연구하기 위한 특이한 사육법의 적용을 가능하게 한다. 한 실시예에서, 가장 바람직한 QTL 대립 유전자는 사육 동물 혈통에서 고정된 것이고, 예를 들면 마커 보조 선별(MAS: 혈통 내) 및 마커 보조 유전자 이입(MAI, 혈통 간)에 의해 상업적인 이종 교배된 수컷을 발생시키는 데 사용될 것이다. 다른 실시예에서, 최악의 QTL 대립 유전자는 MAS(혈통내) 및 MAI(혈통 사이)에 의해 상업적이 이종 교배된 암컷을 발생시키는 데 사용된 동물의 혈통에 고정될 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 동물은 돼지이다. 예를 들면 본 발명에서 제공된 바와 같이 상업적으로 인기가 있는 Pietrain X Large White의 이종 교배된 수퇘지에서 나온 자손의 절반이 바람직하지 않은 Large White 근육질 QTL을 유전하여 상당한 손실을 초래하고, 따라서 본 발명은 예를 들면 이점에서 군집의 보다 낮은 절반을 선별할 수 있는 가능성을 제공한다. 그러나, 수퇘지에서 바람직하지 않은 대립 유전자로 강화된 상업적인 암퇘지 혈통을 선별하여, 암퇘지가 예를 들면 생식의 목적으로 보다 바람직한 다른 대립 유전자를 가지도록 할 수 있도록 한다.
본 발명에 의해 제공된 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 QTL은 돼지에서 염색체 1에 위치한 QTL에 해당하는 위치에 존재한다. 예를 들면, 돼지와 사람 사이에 비교적인 지도 작성 데이터에서 공지된 것으로 이방향의 염색체 패인팅을 포함하고, SSC2p는 HSA11pter-q1311,12에 균일한 것이다. HSA11pter-q13은 한 클러스터의 각인된 유전자:IGF2, INS2, H19, MAH2, P57KIP2, KLQTL1, Tapa1/CD81, Orct12, Impt1, 및 Ip1을 품는 것으로 알려져 있다. HSA11pter-q13에 위치한 각인된 유전자의 클러스터는 8개의 모계 발현된 유전자인 H19, MASH2, P57KIP, KyLQTL1, TAPA1/CD81, ORCTL2, IMPT 및 IP1, 및 2개의 부계 발현된 유전자:IGF2및 INS에 의해 특징이 있는 것이다. 그러나 Johansonet al(Genomics 25: 682-690, 1995) 및 Reiket al(trends in Genetics, 13:330-334, 1997)은 이들 유전자 자리 어디쯤인지 명확하지 않다는 것을 밝혔다. 예를 들면 HSA11 및 MU7 자리는 각각에 대해해당하는 것이 아니고, MMU7 및 SSC2 위치는 해당하는 것이 아니지만, HSA11 및 SSC2 위치는 해당하는 것 같고, 예를 들면 하나 이상의 상기 확인된 부모로부터 발현된 개별 유전자가 3가지 종의 염색체에서 국지화 된다는 안내가 제공되지도 않는다.
각인된 유전자의 클러스터 또는 QTL을 고정하는 다른 유전자에서 유사한 영역을 가지는 소, 양, 가금류 및 어류와 같은 다른 가축에서, 본 발명은 사육 프로그램에서 부계의 각인 현상을 다른 가축의 오르소로그(orthologous) 영역에 사용하는 용도를 제공한다. 돼지에서, 염색체 2의 위치 2p1.7 주변에서 상기 클러스터 지도를 작성하지만, 상기 모계 또는 부계로 발현되는 오르소로그 또는 호모로그 유전자 또는 QTL을 채용하는 본 발명에 의해 제공된 방법이 다른 동물에서 바람직하게 사용되고 사육 및 선별 목적에서도 사용된다. 예를 들면 방법은 상기 QTL이 잠재적인 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되는 경우 상기 동물의 육질 및 1일 체중의 증가와 같은 다른 형질에 대한 제한된 특성과 함께 제공된다. 또는 상기 QTL은 인슐린-유사 성장 인자-2(Igf2) 대립 유전자의 적어도 일부를 포함한다. Reiket al(Trends in Genetics, 13:330-334, 1997)은 인간에서, 이 유전자가 임신의 진행에서 중요한 역할을 하는 경우, 인간의 태아에서 가장 흔하게 발견되는 부계 각인된 질병 증상인 Beckwith-Wiedemann 증상과 관련된다는 것을 기재하고 있다. 동물(가축)에서 근육의 발달 또는 지방과 관련된 출산후 발달을 보여주거나 제안하는 발표는 없었다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 바람직한 유전자형 또는 잠재적인 표현형형질을 가지는 돼지를 선별하는 방법으로, 2p1.7 위치에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체 2에 위치한 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 따라 상기 돼지를 선별하는 단계를 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 돼지에서 도체의 산출량 및 품질에 영향을 미치는 부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 마커 선별(MAS)에서 돼지의 염색체 2p의 말단 소립의 유전자의 마커를 사용하는 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다형성 및 마이크로새틀라이트(microsatellite) 및 도 4 내지 10에 도시된 바와 같은 핵산 서열의 다른 특징과 같은 돼지에서 MAS에서Igf2위치와 관련된 유전자의 마커의 사용에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 도체의 품질 및 함량, 구체적으로 근육량, 및 지방의 축적의 다양한 측정치에 대한 작용을 가지는Sus scrofa염색체 2의 말단의 선단에 위치한 QTL을 제공한다.
첫 번째 실시예에서, Wild Boar X Large White 이종 교배를 한 200마리의 F2개체에서 QTL 지도 분석을 실시하였다. F2동물을 적어도 80 ㎏의 생체중에 도달하고 최대 생후 190일에 도달하면 도살하였다. 출생 체중, 성장, 지방 축적, 도체 조성, 내장의 중량, 및 육질에 대한 표현형 데이터를 수집하고, 표현 형질의 상세한 기재는 Anderssonet al 1및 Andersson-Eklundet al 4에서 제공되어 있다.
근육량에 대해 완만한 효과를 가지는 염색체 2의 근위 말단에서 비특이적인 위치에 있고, 부모로부터 각인된 QTL로부터 30cM 떨어진 위치에 있는 QTL(end 지방에 대한 현저한 작용 없음)은 본 발명자에 의해 이전에 발표되었지만; 본 명세서에서 제공되는 QTL은 매우 큰 효과를 가지는 것으로 적어도 20-30%의 변이를 설명하는 것으로, 본 발명의 QTL을 상업적으로 매력적이게 하여, 본 발명의 QTL이 부모로부터 각인된 것이기 때문에 더욱 그러하다. 염색체 2p의 마커 맵은 전체 염색체 팔을 포괄하기 위해 마이크로새틀라이트 마커를 첨가함으로써 본 발명의 일부로서 이용되었다, 다음의 마이크로새틀라이트 마커:Swc9, Sw2443, Sw2623, 및 Swr2516, 2p7의 원위 말단에서 모든 것이 사용되었다. 신체 조성, 지방, 육질, 및 성장 형질의 QTL 분석을 새로운 염색체 2 지도로 실시하였다. 2p에서 매우 먼 선단에 위치한 QTL의 현저한 증거를 얻었다(도 1; 표 1). QTL은 햄에서 살코기 함량에 매우 커다란 영향을 미치고 F2모집단에서 남은 표현형 변수의 30%를 설명한다. 최장 후방 근육의 면적, 심장의 중량, 및 등-지방의 두께(피하 지방)에 대한 커다란 영향도 또한 기록되었다. 육질 특성의 하나인 반사값에 대한 완만한 효과도 표시되었다. QTL은 복부 지망, 출생 체중, 성장, 간, 신장, 또는 비장의 중량에 대한 별다른 영향을 주지 않았다. 이 QTL에서 Large White 대립 유전자는 이 품종과 Wild Boar 모집단 사이에 차이와 일치하여 근육량을 증가하고 등 지방의 두께를 감소시키는 것과 관련되었다.
두 번째 실시예에서, 1125 F2자손을 포함하는 Pietrain X Large White 이종 교배를 실시하였다. Large White 및 Pietrain 부모 혈통은 다수의 경제적으로 중요한 표현형에서 다르다. Pietrain은 특별한 근육량 및 살코기8(도 2)로 유명하지만,Large White는 우수한 성장능력을 보여준다. 성장성(5), 근육성(6), 지방 축적(6), 및 육질(4)을 측정하는 21개의 독특한 표현형이 모든 F2자손에서 기록되었다. 이들 혈통 사이의 유전적 차이에 관한 QTL 지도 작성을 하기 위해, 677F2개체의 초기 샘플에 마이크로새틀라이트 마커를 사용하여 전체 게놈 스캔을 실시하였다. 다음의 마이크로새틀라이트 마커 지도는 사용하여 염색체 2를 분석한다: SW2443,SWC9, 및 SW2623, SWR2516-(0,20)-SWR783-(0,29)-SW240-(0,20)-SW776- (0,08)-S0010-(0,04)-SW1695-(0,36)-SWR308. 최대 가능성 다점 알고리듬을 사용한 돼지 염색체 2의 분석에서는 염색체 2의 짧은 팔의 원위 말단에서 근육성을 측정하는 6개의 표현형 중 3개(% 살코기 부분, % 햄, % 옆구리) 및 지방 축적을 측정하는 6개의 표현형 중 3개(% 등 지방 두께(BFT), % 등지방, % 지방 부분)에서 매우 현저한 로드스코어(20 까지)를 나타냈다(도 1). 양의 로드스코어를 남은 5개의 근육성 및 지방성 표현형에서 얻었지만, 경험상 유의성 문턱치(α= 5%)에는 도달하지 않았다. 성장성(출생 체중 포함) 또는 기록된 육질 측정치에 대한 해당 QTL의 효과에 대한 증거는 없다(데이터는 없음). 이러한 발견을 확인하기 위해, 355 F2자손의 남은 샘플을 4개의 가장 먼 2p 마커에 대해 유전자 타이핑하였고, QTL 분석을 첫 번째 분석에서 가장 높은 로드 스코어를 제공하는 형질에 대해 실시하였다. 2.1 내지 7.7 범위의 로드 스코어는 이 지역의 주요 QTL의 존재를 확실하게 확인시켜 주었다. 표 2는 3개의 유전자형 평균 및 남은 변수의 ML 예상치를 기재한다. 마커 보조 격리 분석에 기준한 증거는 Pietrain 군집 내에서 이 지점에서 남은 격리에 대해 지적한다.
따라서, 이들 실험에서는 돼지 유전자 팔 2p의 말단 소립에서 몸체의 품질 및 정량에 대한 중요한 역할을 하는 QTL의 존재를 명확하게 지시하였다. 적어도 3가지 대립 유전자로 이 QTL에서 대립 유전자 시리즈: Wild Boar < Large White < Pietrain의 존재가능성 및 Pietrain 혈통 내에서 관찰된 격리가 더욱 제공될 것이다.
확인된 QTL의 근육량 및 지방 축적에 대한 작용은 육질에 대한 관련된 악화 작용없이 CRC 자리에 대해 보고된 것과 동일한 크기로 주요한 것이다. 본 발명자들은 위치들이 근육성과 살코기에 대해 Pietrain 대 Large White 혈통 차이의 50%에 근접하게 해명한 것으로 추정한다. QTL은 햄에서 살코기 함량에 대한 매우 커다란 작용을 하고, F2집단에서 남은 표현형 변수의 30%를 해명하였다. 최대 후방 근육의 면적, 심장의 중량, 및 등지방의 두께(피하 지방)에 대한 커다란 작용도 또한 기록하였다. 한 육질 특성인 반사값에 대한 완만한 효과가 인식되었다. QTL은 복부 지방, 출생 체중, 성장, 간, 신장 또는 비장의 중량에는 유의적인 효과를 미치지 않았다(데이터는 나타나지 않음). 이 QTL에서 Large White 대립 유전자는 Wild Boar 대립 유전자에 비교한 경우, 이 품종과 Wild Boar 군집 사이의 차이에 일치하는 등의 지방 두께의 감소 및 근육의 증가와 관련이 있다. 모든 영향을 받은 형질에 대해 관찰된 강한 각인 효과가 단일 원인이 되는 위치가 있다는 것을 나타낸다. 골격근 중량 및 심장 크기에 대한 다면발현 작용은 근육량이 클수록 심장출력이 더 클 것을 요구한다는 생리학적 관점에서 적용가능한 것으로 나타난다.
추가의 실시예에서, 본 발명은 바람직한 유전자형 또는 잠재적인 표현형 형질을 가지는 돼지를 선별하는 방법으로, 2p1.7 위치에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체 2에 위치한 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 따라 상기 돼지를 선별하는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 QTL은 적어도 일부의 Sus scrofa 인슐린 유사 성장 인자-2(Igf2) 대립 유전자의 적어도 일부 또는 다형질성 또는 마이크로새틀라이트 및 도 4 내지 10에 기재된 바와 같은 다른 특징적인 핵산 서열과 같이 이와 밀접하게 관련된 게놈의 영역을 포함한다. 출생전 발생에 대한Igf2의 중요한 역할은 넉-아웃 생쥐로부터 잘 알려진 것14이고, 인체의 Beckwith-Wiedemann 증상에서 원인이 되는 역할을 한다는 것도 잘 알려진 것15이다. 본 발명에서 에서는 출생후 성장에서Igf2-영역의 중요한 역할을 설명하고 있다.
Igf2의 역할을 나타내기 위해, 본 발명자는 다음의 3가지 시험을 실시하였다:
돼지의 BAC 라이브러리를 검색함으로써 유전자Igf2클론을 격리하였다. 이 BAC 클론에 의한 FISH 분석은 염색체 2p의 말단 부분에서 강한 동일성 시그널을 제공한다.
다형의 마이크로새틀라이트는 쥐(GenBank U71085), 인간(GenBank S62623), 및 말(GenBank AF020598)에서Igf2의 3'UTR에 위치한다. 해당하는 돼지의 마이크로새틀라이트의 존재가능성을 BAC 클론을 사용한Igf23'UTR의 직접 서열화에 의해검사하였다. 콤플렉스 마이크로새틀라이트를 중지 코돈의 약 800 bp 하류에서 확인하였고; 서열 비교에서는 이 마이크로새틀라이트가 이전에 기재된 무명의 마이크로새틀라이트인Swc9와 동일하다는 것이 밝혀졌다6. 초기 QTL 지도 작성 시험에 이 마커를 사용하고 유전자 지도에서 이의 위치는 Pietrain X Large White 및 Large White X Wild Boar 혈통모두에서 QTL의 가장 가능성이 T는 위치에 해당한다.
돼지의 IGFII 유전자 및Swc9의 제2 엑손에서nt241(G-A)전환에 대한 10주된 태아 이종 접합의 골격근과 간의 cDNA의 분석은 IGFII 유전자가 돼지에서 이들 기관에 각인되고 부계 대립 유전자로 부터만 발현된다는 것을 보여준다.
출판된 성숙한 돼지의 간 cDNA 서열16을 기준으로, 성숙한 골격근 cDNA로부터 리더 222 bp 및 트레일러 서열 280 bp를 가진 전체Igf2코딩 서열을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계하였다. Pietrain 및 Large White RT-PCR 산물을 서열화하여 코딩 서열이 혈통과 출판된 서열 모두와 동일하다는 것을 알 수 있다. 그러나 DA 전환을 인간에서 엑손 2에 해당하는 리더 서열에서 발견하였다. 다음의 종래의 명명법에서, 다형성은nt241(G-A)로 칭해질 것이다. 결착 증폭 반응(LAAR)을 기준으로 하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 대한 검색 테스트를 개발하여, 혈통 물질에 대한 유전자타이핑을 가능하게 하였다. 이들 데이터를 기준으로Igf2를Swc9마이크로새틀라이트 마커(θ= 0%)로 공통 국지화 하도록 나타내어서, QTL의 가장 가능성이 있는 위치와 실질적으로 해당하고, 95% QTL의 서포트 간격 내에 위치하도록 나타내었다. 이어진 서열 분석에서는 마이크로새틀라이트 마커인Swc9가실제로Igf2유전자의 3'UTR 내에 위치한다는 것을 설명하였다.
이전에 언급한 바와 같이, 이러한 QTL의 지식은 개선된 도체 이점을 가진 돼지와 같은 동물을 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시예는: 관심의 모집단에서 기능적으로 독특한 QTL 대립 유전자의 격리를 확인하기 위해 마커 보조 격리 분석; 선별의 정확성, 선별의 강도를 높여주거나 또는 세대 간격을 줄임으로써 유전자 반응을 향상시키도록 혈통 내에서 실행되는 마커 보조 선별(MAS); 도너로부터 수여 집단으로 바람직한 QTL 대립 유전자를 효과적으로 전달하기 위해 마커 보조 유전자 이입(MAI)를 포함하는 것으로, 수여 집단에서 유전자 반응을 향상시킨다. 실시예에서, 마커 보조 격리 분석, 마커 보조 선별(MAS) 및 마커 보조 유전자 이입(MAI)은 QTL에 연결된 유전자 마커; QTL로 결합 불균형이 되는 유전자 마커를 이용하여 QTL내에서 실제적인 임의의 돌연변이를 실행할 수 있다.
추가의 실시예에서, 본 발명은 바람직한 유전자형 또는 잠재적인 표현형 형질을 가지는 돼지를 선별하는 방법으로, 2p1.7 위치에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체 2에 위치한 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 따라 상기 돼지를 선별하는 단계를 포함한다. 여기에서 QTL은 부계 발현, 즉 부계 대립 유전자로부터 발현된다. 인간 및 마우스에서,Igf2는 각인되고 여러 가지 조직에서 부계 대립 유전자로부터 배타적으로 발현되는 것으로 알려졌다. SNP 및/또는Swc9에 대한 돼지 이종 접합에서 얻은 골격근의 cDNA의 분석에서는 동일 각인이 돼지에서도 이 조직에서 유지된다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 제공되는 바와 같이 QTL을 특정화하는 부모 유래 작용을 이해하는 것으로 사육 프로그램에서 최적의 사용을 가능하게 한다. 또한, 현재 상업적으로 인기가 있는 Pietrain X Large White 이종 교배된 수퇘지에서 얻은 자손의 절반은 바람직하지 않은 Large White 대립 유전자를 유전하여 상당한 손실을 초래한다. 본 발명에 의해 제공된 방법을 이용하는 것으로 이 문제를 회피한다.
본 발명은 또한, 분리된 및/또는 재조합 핵산 또는 그의 기능적인 단편을 제공하는 것으로, 부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL) 또는 하나의 부모의 대립 유전자에 의해 우선적으로 발현될 수 있는 그의 단편을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 상기 핵산을 가지는 것은 바람직한 유전자가 하나의 부모의 대립 유전자에 의해 배타적으로 또는 우선적으로 발현될 수 있는 형질전환된 동물을 구성하도록 하여, 소망하는 형질에 대해 상기 동물의 동종 교배의 자손이 발현되는 부모의 대립유전자와 관련된 소망하는 형질을 가지도록 한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 분리된 및/또는 재조합 핵산 또는 그로부터 유도된 단편을 제공하는 것으로, 부모로부터 각인된 합성의 정량적인 형질 유전자 자리(QTL) 또는 적어도 하나의 염색체로부터 유도된 그의 기능적 단편을 포함한다. 본 명세서에서 합성은 부모로부터 발현된 QTL을 설명하는 것으로, 여기서 다양한 인자를 결합하여 하나 이상의 동물의 유전자로부터 독특한 위치에 유래하는 결합을 하는 것이다. 본 발명은 재조합 핵산을 제공하고, 여기서 하나의 QTL의 부모의 각인과 관련된 서열은 유전자 또는 제2 QTL의 바람직한 대립 유전자에 관한 서열과 결합한다. 상기 유전자 구성은 형질 전이된 동물을 얻는 데 사용하기 바람직한 것으로 여기서 제2 QTL은 제2 QTL이 유도된 천연 동물에서 유전 패턴에 대해 반대되는 부계 각인으로 설정된다. 상기 제2 QTL은 예를 들면 부모의 각인 영역이 위치하는 동일한 염색체에서 유래할 수 있으나, 동일하거나 심지어 다른 특성에서 다른 염색체로부터 유도될 수도 있다. 돼지에서 제2 QTL는 에스트로겐 수용체(ESR)-유전자(Rotherschildet al, PNAS, 93, 201-201, 1996) 또는 FAT-QTL(Andersson, Science, 263, 1771-1774, 1994)에 관계될 수 있고, 예를 들면 염색체 4와 같은 다른 염색체로부터 유도된다. 제2 또는 추가의 QTL은 다른 (가축)동물 또는 인간에서 유래할 수도 있다.
본 발명은 또한 위치 2p1.7에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체 2에 위치되는 돼지의 QTL에 적어도 부분적으로 해당하는 분리 및/또는 재조합 핵산 또는 이의 유도된 기능적인 단편을 제공한다. 여기서, 상기 QTL은 상기 돼지의 부계 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되거나 및/또는 상기 QTL은 Sus scrofa 인슐린-유사 성장 인자-2(Igf2) 대립 유전자의 적어도 일부, 바람직하게 INS와 H19 사이의 영역을 적어도 연장하거나 또는 Pietrain, Meishan, Duroc, Landrace, 또는 Large White와 같은 가축 돼지에서 유래되거나 또는 Wild Boardptj 유래된 것을 포함한다. 예를 들면 게놈의Igf2클론은 돼지의 BAC 라이브러리를 검색함으로써 격리되었다. BAC 클론에 의한 FISH 분석은 염색체 2p의 말단 일부에서 강한 상동성 신호를 제공한다. 다형성 마이크로새틀라이트는 쥐(GenBank U71085), 인간(GenBank S62623), 및 말(GenBank AF020598)에서Igf2의 3'UTR에 위치한다. 해당 돼지의 마이크로새틀라이트 존재의 가능성은 BAC 클론을 이용한Igf23'UTR의 직접 서열화에 의해 조사되었다. 서열비교에서 마이크로새틀라이트는 이전에 기재된 무명의 마이크로새틀라이트인Swc9와 동일하다는 것이 밝혀졌다. PCR 프라이머가 설계되고 마이크로새틀라이트(Igf2ms)는 2마리 Wild Boar 파운더 중에서 3가지 다른 대립 형질 및 8마리의 Large White 파운더 중에서 2가지를 가진 매우 다형성이라는 것이 밝혀졌다.Igf2ms는 혈통의 기원 및 부모의 기원이 각 F2동물에서 각 대립 유전자를 신뢰하는 데 결정될 수 있기 때문에 이종 교배에 대해 완전한 정보를 제공하였다.
이종 교배 혈통을 이용한 결합 분석은Igf2ms 및 마이크로새틀라이트 Sw2443, Sw2623, 및 Swr2516, 2p7의 원위 말단에서 모두로 실시하였다.Igf2는 높은 유의성의 로드 스코어(Swr2516에 대해 Z=89.0, θ=0.003)에 의해 2p로 확실하게 설정되었다. 이전 형태의 염색체 2 마커를 포함하는 다점 분석에서는 다음 순서의 위치(Kosambi cM에서 sex-평균 맵 거리): Sw2443/Swr2516-0.3-Igf2-14.9-Sw2623 -10.3-Sw256이 나타났다. 재조합은 Sw2443과 Sw2516 사이에서 관찰되지 않고, 이 위치에 대해Igf2의 제안된 근위 위치는 보고된 순서에 0.8의 로드 스코어 지지를 제공하는 단일 재조합물에 기준한 것이다. 이전 QTL 연구에서 가장 말단의 마커인 Sw256은 결합기의 말단 끝에서 약 25 cM에 위치한다.
본 발명은 또한 핵산 또는 본 발명에 따르는 그의 유도된 기능성 단편을 본 발명에 따르는 방법에서 사용하는 용도를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따르는 방법의 용도로는 소망하는 유전 형질 또는 잠재적인 표현 형질에 대해 사육 동물 또는 도살될 동물, 또는 이들 동물에서 유래된 배아 또는 정액을 선별하는 것을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 형질이 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되어 있는 용도를 제공한다. 본 발명에서 제공된 바와 같은 QTL은 집단 내에 마커 보조 선별 또는 하나의 집단에서 다른 집단으로 바람직한 대립 유전자의 마커 보조 형질 이입에 의해 예를 들면 살코기 함량 또는 등지방 두께를 향상시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 QTL을 사용한 마커 보조 선별의 예는 결합된 마커로 또는 불균형한 마커로 기능적으로 독특한 QTL 대립 유전자를 확인하는 마커 보조 격리 분석의 용도이다. 또한, QTL에서 원인의 돌연변이의 동정은 이제 가능하게 되어서, 기능적으로 독특한 QTL 대립 유전자를 확인하도록 한다. 골격근, 심장의 크기, 및 등지방 두께에 대한 지대한 작용을 하진 염색체 2p의 원위 선단에 위치한 상기 기능적으로 독특한 QTL 대립 유전자도 본 발명에 의해 제공된다. Large White X Wild Boar 및 Pietrain X Large White 이종 접합에서 유사한 QTL 작용의 관찰은 적어도 3가지의 독특한 기능적 대립 유전자 존재의 증거가 된다. 또한, 마커 보조 격리 분석을 기준으로 하는 예비 증거는 Pietrain 군집 내에 이 위치에서 잔류 격리에 대해 지적한다(데이터는 나타나지 않음). 대립 유전자 시리즈의 발현은 미묘한 조정 돌연변이라기 보다는 총체적인 유전자 변경이라는 -관찰된 작용의 정량적인 상태를 기준으로 함- 원인의 다형성을 확인하도록 할 수 있다. Pietrain 돼지가 Large White 돼지보다 더욱 근육질이고, Large White는 Wild Boar보다 살코기 함량이 더 많다는 발견은 동일한 순서로 3가지 대립 유전자의 근육량에 대한 작용이 랭크된다. 본 발명은 또한 본 발명에 의해 제공된 바와 같이 혈통내 선별 내 또는 결합된 마커를 사용한 마커 보조 유전자 이입, 불균형의 마커 또는 원인성 돌연변이를 포함하는 대립 유전자에 대한 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 방법을 사용하여 선별된 동물을 제공한다. 예를 들면 위치 2p1.7에서 지도 작성하는 Sus scrofa 염색체 2에 위치하는 QTL에서 대립 유전자의 동종 접합되는 것이 특징인 돼지를 선별할 수 있고, 따라서 본 발명에 의해 제공된다. 상기 QTL이 상기 돼지의 잠재적인 근육량 및/또는 지방 축적에 관련되고, 상기 QTL이 적어도 일부의 Sus scrofa 인슐린-유사 성장 인자-2(Igf2) 대립 유전자를 포함하기 때문에, 선별된 돼지를 사육 또는 도살에 이용하는 것을 선택할 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따르는 동물은 수컷이 제공된다. 각기 수컷 또는 그의 유래된 정자 또는 배아는 사육 동물에 사용되어 혈통을 창출하거나 최종적으로 도살되는 사육 동물로 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 이러한 용도의 바람직한 실시예에서는, 대립 유전자로 동종 접합이 되도록 선별되어 극단의 근육 비대 및 살코기를 만들게 되는 수컷, 또는 이의 정자가 대립유전자와 같은 동종 교배의 자손을 생산하는 데 사용된다. 상기 대립 유전자의 부계 발현 때문에, 상기 자손은 어미 부모가 다른 유전적 배경을 가지고 있더라도 예를 들면 근육량과 관련된 바람직한 형질을 보이게 된다. 또한, 다른 형질, 예를 들면 번식성과 관련된 형질을 가지는 암컷을 선별된 수컷에서 유래한 대립 유전자에서 유전되는 근육량 특성에 부정적인 영향을 주지 않고도 선별할 수 있다는 것도 가능하다. 예를 들면 이전에도 상기 수컷을 Pietrain 돼지와 교배하는 것도 때때로 있었지만, 사육 프로그램에서 이러한 특성을 적합하게 사용하는 것은 알려지지 않았다.
또한, 본 발명은 형질전환 동물, 그로부터 유래된 정자, 및 배아를 제공하는 것으로, 본 발명에서 제공되는 바와 같이 부모로부터 각인된 QTL 또는 기능적인 그의 단편을 포함한다. 즉, 바람직한 재조합 대립 유전자를 도입하기 위해 본 발명에서 제공되는 것으로, 예를 들면 에스트로겐 수용체 자리를 도입하는 것은 조부모 동물의 부모로부터 각인된 영역에서 동종 접합 동물의 리터 크기를 증가시키는 것에 관련된다(예를 들면 영역이 부계로 각인되고 조부모는 수퇘지일 경우 하이브리드 암퇘지의 아비). 바람직한 지방 관련된 대립 유전자 또는 근육량 관련된 재조합 대립 유전자를 부계로 각인된 영역에 도입하는 것이다. 재조합 대립 유전자는 모계에서 관심이 있거나 바람직한 재조합 대립 유전자 또는 종종 부계에서 얻은 대립 유전자에 반대 작용을 하는 것이다. 예를 들면 돼지와 같은 육종 동물에서 근육간 지방 또는 근육량과 같은 육질 특성과 연관된 재조합 대립 유전자는 어미주에서 고정되지만, 등지방을 감소시키는 것과 관련된 재조합 대립 유전자는 아비주에 고정될 수 있다. 다른 바람직한 조합은 예를 들면 암컷주에서 번식력 및/또는 우유 생산과 수컷주에서 성장속도 및/또는 근육량에 대한 것이다.
실시예 1
야생 수퇘지와 라지 화이트의 이종교배
방법
Igf2BAC 클론 및 형광 in situ 혼성화(FISH)의 분리. 마지막 엑손의 일부를 PCR 증폭시키기 위한Igf2프라이머(F: 5'-GGCAAGTTCTTCCGCTAATGA-3' 및 R:5'-GCACCGCAGAATTACGACAA-3')는 돼지의Igf2cDNA 서열(GenBank X56094)을 기준으로 설정되었다. 프라이머를 사용하여 돼지의 BAC 라이브러리를 검색하고 클론 253G10을 격리하였다. 미완성의 BAC DNA를 참고자료 24에 기재된 바와 같이 준비하였다. BAC DNA를 EcoRV에 의해 직선화하고 QIAEXII(QIAGEN GmbH, 독일)로 정제하였다. GIBCO-BRL Nionick 표지 시스템(BRL18246-015)를 이용하여 클론을 바이오틴-14-dATP로 표지하였다. 표준 기술을 이용하여 임파구가 자극된 미국자리공(Seromed)에서 돼지 메타페이즈 염색체를 얻었다. 슬라이드를 실온에서 이틀간 방치하고 이후 사용 시까지 -20℃로 유지하였다. FISH 분석을 참고자료 25에 기재된 바와 같이 실시하였다. 혼성화 믹스에서 프로브의 최종 농도는 10 ng/㎕였다. 돼지 유전자 DNA의 표준 농도로 반복성 서열을 억제하였다. 혼성화후의 세척후, 바이오틴화된 프로브를 2층의 아비딘-FITC(Vector A-2011)로 검출하였다. 염색체를 0.3 ㎎/㎖ DAPI(4,6-디아미노-2-페닐인돌; Sigma D9542)로 대조 염색하여 G-밴딩 유사 패턴을 만들었다. 염색체 2는 밴딩없이도 용이하게 인지할 수 있기 때문에, 혼성화후 밴딩은 필요하지 않다. IMAC-CCD S30 비데오 카메라와 연결되고 ISIS 1.65(Metasystems) 소프트웨어가 장치된 Olympus BX-60 형광 현미경으로 총 20 메타페이즈의 스프레드를 실험하였다.
서열, 마이크로새틀라이트, 및 결합 분석
직선화되고 정제된 BAC DNA 약 2㎍을 1 pmole의 프라이머 및 BigDye Terminator 화학(Perkin Elmer, 미국)으로 직접 서열화하는 데 사용였다. DNA 서열화는 마지막 엑손의 3' 말단에서 UTR의 3'말단을 향해 마이크로새틀라이트가 검출될 때까지 실행하였다. 프라이머 세트(F: 5'-GTTTCTCCTGTACCCACACGCATCCC-3' 및 R: 5'-플루오로세인-CTACAAGCTGGGCTCAGGG-3')는 약 250 bp의 길이이고 중지 코돈에서 하류로 약 800 bp에 위치하는Igf2마이크로새틀라이트의 증폭을 위해 설정되었다. 형광 표지된 프라이머를 이용하여 마이크로새틀라이트를 PCR 증폭하고, ABI377 서열 및 GeneScan/Genotyper 소프트웨어(Perkin Elmer, 미국)를 사용하여 유전자타이핑을 실시하였다. 2점 및 다점 결합 분석을 Cri-Map 소프트웨어 26으로 실시하였다.
동물 및 표현형 데이터
이종 교배 혈통에는 2마리의 European Wild Boar 수컷과 8마리의 Large White 암컷, 4마리의 F1수컷과 22마리의 F1암컷, 및 200마리의 F2자손1을 포함한다. F2동물은 적어도 생체중 80 ㎏ 이상 또는 최대 나이 190일 이하에서 도살하였다. 출생 체중, 성장, 지방의 축적, 신체 조성, 내장의 중량, 및 육질에서 표현형의 데이터를 수집하여; 표현형 특징의 상세한 설명은 Anderssonet al 1형 및 Andersson-Eklundet al 4에 의해 제공된다.
통계 분석
이종 교배 혈통(outbred lines27) 사이의 교차점을 분석하기 위해 개발된 최소 제곱값(least square) 방법으로 QTL 존재에 대한 일정 간격 맵핑(interval mapping)을 실행하였다. 이 방법은 2개의 분포선(divergent lines)이 대체적인 QTL 대립 유전자에 대해 고정된다. 각 위치에는 대립 유전자의 조부모 유래로 간주되는 F2세대에서 4가지 가능한 유전형이 있다. 부가, 우성, 및 각인2의 3가지 작용을 맞추는 것을 가능하게 한다. 후자는 2가지 형태의 이형 접합체(F1아비를 통한 Wild Boar 대립 유전자를 받는 것과 F1어미에서 받는 것) 사이의 차이에 기인하는 것으로 추축된다. 이 모델( 3 d.f.) 대 염색체의 각 cM에 대한 QTL 효과없이 감소된 모델을 사용하여 F-비율을 계산한다2. QTL의 가장 가능성 있는 위치를 가장 높은 F-비율을 제공하는 위치로 하였다. 유전자-형 유의성 문턱치는 2에 기재된 바와 같이 순열 테스트28에 의해 경험적으로 얻었다. 각인 효과를 포함하는 QTL 모델은 각인(1 d.f.) 없는 모델과 비교하여 각인 효과가 현저한지에 대해 실험하였다.
통계 모델은 또한 각기 특성에 대응하는 고정 작용 및 공분산을 포함하였다: 사용된 통계 모델의 더욱 상세한 설명을 위해서는 Andersson-Eklundet al.4참조. 기본적인 유전자 작용 및 모계의 작용을 고려하기 위해 가족을 포함하였다. 상관있는 특징에 대한 QTL 작용을 식별하기 위해 공분산으로 도체의 중량을 포함하였다. 따라서 도체 조성에 관한 모든 결과는 동일한 중량에서 비교하였다.IGF2위치에서 각 유전자형 군에 대한 최소-제곱 평균은 SAS의 Procedure GLM을 사용하여 단일점 분석으로 예측하였다. 이 모델에는 인터벌 맵핑 분석에 사용된 것과 동일한 고정 작용 및 공분산을 포함하였다. QTL은 기원-특이적인 발현의 명확한 부모를 보여주고, 맵 위치는 인슐린-유사 성장인자 Ⅱ 유전자(IGF2)의 것과 일치하여,IGF2가 원인 유전자라는 것을 지시한다. 매우 현저한 격리 왜곡(Wild Boar-유래된 대립 유전자의 과잉)이 이 위치에서 관찰되었다, 이 결과는 출생후의 성장에서IGF2영역의 중요한 작용을 설명하는 것이고, 인간 및 설치류 모델의 유기체에서 아버지로부터 발현된IGF2-연결된 QTL이 존재가 실험 설계 또는 데이터의 통계 처리에 기인하여 지금까지 간과되었을 가능성이 있다. 이 연구는 또한 정량적인 유전자 이론 및 실질적인 돼지 사육에 중요한 의미를 가진다.
돼지 염색체 2p와 인간 염색체 11p사이의 관찰된 유사성 때문에IGF2는 이 QTL을 위한 위치 후보 유전자로 확인되었다. 돼지의 BAC 라이브러리를 검색함으로써 유전자IGF2는 클론을 격리하였다. 이 BAC 클론에 의한 FISH 분석은 염색체 2p의 말단 부분에서 강한 동일성 시그널을 제공한다(도 1). 다형의 마이크로새틀라이트는 쥐(GenBank U71085), 인간(GenBank S62623), 및 말(GenBank AF020598)에서Igf2의 3'UTR에 위치한다. 해당하는 돼지의 마이크로새틀라이트의 존재가능성을 BAC 클론을 사용한IGF2s'UTR의 직접 서열화에 의해 검사하였다. 콤플렉스 마이크로새틀라이트를 중지 코돈의 약 800 bp 하류에서 확인하였고; 서열 비교에서는 이 마이크로새틀라이트가 이전에 기재된 무명의 마이크로새틀라이트인Swc9와 동일하다는 것이 밝혀졌다6. PCR 프라이머를 설정하고 마이크로새틀라이트(Igf2ms)가 2의 Wild Boar 파운더들 사이에 3개의 상이한 대립 유전자 및 8의 Large White 파운더 사이의 다른 2개의 대립 유전자와 매우 다형인 것이 밝혀졌다. 기원의 품종 및 기원의 부모가 각 F2가축에서 각 대립 유전자에 대해 신뢰성을 가지고 측정할 수가 있기 때문에IGF2ms는 이종 교배에서 충분한 정보를 제공한다,
이종 교배 혈통을 이용한 결합 분석은Igf2ms 및 마이크로새틀라이트 Sw2443, Sw2623, 및 Swr2516, 2p의 원위 말단에서 모두로 실시하였다.Igf2는 높은 유의성의 로드 스코어(Swr2516에 대해 Z=89.0, θ=0.003)에 의해 2p로 확실하게 설정되었다. 이전 형태의 염색체 2 마커8를 포함하는 다점 분석에서는 다음 순서의 위치(Kosmbi cM에서 sex-평균 맵 거리): Sw2443/Swr2516-0.3-Igf2-14.9-Sw2623 -10.3-Sw256이 나타났다. 재조합은 Sw2443과 Sw2516 사이에서 관찰되지 않고, 이 위치에 대해Igf2의 제안된 근위 위치는 보고된 순서에 0.8의 로드 스코어 지지를 제공하는 단일 재조합물에 기준한 것이다. 이전 QTL 연구에서 가장 말단의 마커인 Sw256은 결합 기의 말단끝에서 약 25 cM에 위치한다.
도체 조성, 지방, 육질, 및 성장 특성의 QTL 분석은 새로운 염색체 2 지도를 가지고IGF2에 대해 예상된 각인 효과의 존재하는 가능성에 대해 시험하는 통계학적 모델을 사용하여 실시하였다. 2p의 말단 선단에 위치하는 아버지로부터 발현된 QTL의 뚜렷한 증거를 얻었다(도 1; 표 1). QTL은 햄에서 살코기 함량에 대우 지대한 영향을 미치고 F2군집에서 남은 표현형 변이의 놀라운 30%를 설명한다. 최장 후방 근육의 면적, 심장의 중량, 및 등 지방(피하 지방)의 두께에 대한 지대한 효과도 인지되었다. 한 육질 특성인 반사값에 대한 완만한 효과가 인식되었다. QTL은 복부 지방, 출생 체중, 성장, 간, 신장 또는 비장의 중량에는 유의적인 효과를 미치지 않았다(데이터는 나타나지 않음). 이 QTL에서 Large White 대립 유전자는 대형 근육과 관련되고, 이 품종과 Wild Boar 군집 사이의 차이에 일치하는 등의 지방 두께를 감소시켰다. 모든 영향을 받은 특성에 대해 관찰된 강한 각인 효과가 단일 원인 장소를 강하게 제안한다. 골격근 중량 및 심장 크기에 대한 다면발현 작용은 근육 중량이 클수록 심장 출력이 더 클 것을 요구한다는 생리학적 관점에서 적용가능한 것으로 나타난다. 이 QTL의 뚜렷한 부계 발현은 최소 제곱 평균이 부성으로부터 유전된 대립 유전자의 다음의 군집 오리진 다음의 2개의 군으로 나뉘어 떨어지는 것으로써 설명된다. 2개의 이종접합 군, 구체적으로 최장 도리시의 면적에 대한 예상된 효과에 대해 극단의 값으로 덜 다가갈수록 유의적이지 않다는 것 기억할 가치가 있는 것이다. 이것은 아미도 기회 때문일 것이지만, 예를 들면 모계의 유전된 대립 유전자의 일부 발현 또는 문제의 특성에 대한 사소한 작용을 가진 결합되고, 각인되지 않은 QTL과 같은 생물학적 설명도 가능하다.
염색체에서Igf2-결합된 QTL 및 FAT1 QTL은 Wild Boar 이종 교배에서 몸체 조성 및 지방 분리에 대해 커다란 효과를 가진 멀리 떨어진 2개의 영역이다.Igf2QTL은 우선적으로 근육량을 조절하지만, FAT1은Igf2QTL에 의해 영향을 받지 않는복부 지방을 포함하는 지방 축적에 커다란 영향을 미친다(도 2). 2개의 영역 사이에 유의적인 상호작용은 밝혀지지 않았고, 이들은 F2세대에서 표현형 변수의 가장 큰 비중을 제어한다. 양쪽의 QTL을 포함하는 모델은 햄에서 살코기 백분율의 변수는 33.1%이고, 등에서 살코기와 벼의 백분율은 31.3%이고, 평균 등의 지방 깊이는 26.2%로 나타난다(염색체 2 효과만을 포함하는 모델과 비교한 경우, 표 1). Large White 가축 돼지에서 2가지 QTL은 살코기의 성장 및 근육량에 대해 선별하는 동안 응답에 주요한 역할을 해야만 한다.
매우 유의적인 격리 왜곡이 표 1에 도시된 바와 같이Igf2영역(과잉의 Wild Boar-유래된 대립 유전자)에서 관찰되었다(χ2=11.7, d.f.=2, P=0.003). Wild Boar-유래된Igf2대립 유전자의 빈도는 예상된 50%와는 달리 59%이고, 이것은 다수의 "Wild Boar"와 "Large White" 단일 접합체의 2배이다. 이러한 편차는 말단의 선단 3개의 위치 모두에서 관찰되고, 따라서 타이핑 실수에 기인한 것은 아니다. 이러한 효과는 다른 위치에서도 관찰되었으나, 왜곡의 정도는 염색체의 말단 선단까지의 거리의 함수로 감소되었다. DNA 제조를 위한 혈액 샘플을 12주 연령에서 수집하고 예상된 멘텔의 비율에서 편차가 혈액 체취 전에 손살된 동물의 개수가 이 크기의 편차를 일으키기에는 충분하지 않았기 때문에 출생시 존재한다는 것을 알게되었다. 이 혈통에서 분석된 250 위치 이상의 다른 것은 이러한 현저한 격리 왜곡을 보여주지 않았다(L. Andersson, 출판되지 않음). 격리 왜곡은 이종 교잡의 2가지의 상호간 형태의 빈도가 동일(표 1)하기 때문에 각인효과는 보이지는 않았다.이것은 QTL 작용과 격리 왜곡이 동일한 위치에 의해 제어된다는 가능성을 배제한 것은 아니다. 격리 왜곡은 F1부모에서 Wild Boar 수컷이 아비가 되기 때문에, 아마도 배우자형성 동안 부계에 의해 발현되는 대립 유전자에 호의적인 메이오틱 드라이브(meiotic drive)에 기인한 것일 수도 있다. 다른 가능성은 격리 왜곡이 임의의 조직에서 및/또는 배아 발생의 중요한 단계동안 모계와 부계의 대립 유전자의 공동 우성의 발현에 기인한 것일 수도 있다. 이종 대립 유전자의Igf2발현은 인간의 성장10,11동안 어느 정도 발생하는 것으로 보고되었고, 흥미롭게도Igf2발현에서 부성의 강한 영향이 Mus musculus 및 Mus spretus12사이의 교차점에서 최근 발견되었다.Igf2에 매우 가깝게 연결된 인슐린 유전자에서 VNTR 다형성은 인간 의 출생시 크기와 연관이 있다13는 것도 흥미롭다. 돼지에서Igf2-결합된 QTL은 출생 체중에 미미한 영향을 미치지만, 본 발명의 데이터에서는 유의적이지 않고(도 2) 각인 효과의 표시는 없었다.
이 연구는Igf2자리의 생리학적 주요성에 관한 일반적 지식에 진일보한 것이다. 출생전 발생에 대한Igf2의 중요한 역할은 넉-아웃 생쥐로부터 잘 알려진 것14이고, 인체의 Beckwith-Wiedemann 증상에서 원인이 되는 역할을 한다는 것도 잘 알려진 것15이다. 이 연구에서는 출생화 발생에서Igf2-영역의 중요한 역할을 설명하고 있다. 이종 번식 군집 사이의 상호교잡이 다중 요인의 특징에 대한 기원-특이적인 작용에서 부모의 QTL을 검출하기에 특히 효과가 있는 것이라는 것을 강조되어야 한다. 다중 대립 유전자(또는 단일형)가 격리되기 때문이고, 따라서 본 발명자는 이종 교잡의 F2동물이 F1수컷 또는 암컷에서 Wild Boar 대립 유전자를 받았을 지를 연역할 수 있다. 오직 2가지 대립 유전자만이 각 자리에서 격리되었기 때문에 비만과 같은 특성에 영향을 미치는 부계로 발현된Igf2-연결된 QTL의 격리가 인간의 연구 또는 2가지 동족번식 혈통 사이의 이종 교배에서 간과되었을 가능성이 상당히 있다. 따라서 본 발명의 결과는 동족번식의 설치류 모델을 이용한 복잡한 특징의 유전적 절개뿐 아니라 인슐린-Igf2영역 및 타입 I 당뇨병16에서 유전자의 다형성과 출생 체중에서 변수13사이의 관련성을 미래에 분석하는 유의적인 결과를 가진다. 가축 돼지와 이의 야생 조상 사이의 상호 교잡을 일으키는 중요한 힘은 선별에 반응하는 주요한 위치 지도 작성하고 확인하는 가능성을 연구하고자 하였다. 본 발명은 비로소 염색체 2(본 발명)와 41,2에서 2개의 단일 QTL이 F2세대에서 살코기 함량에 표현형 변수의 1/3정도를 기여한다는 것을 밝혀냈다. 이것은 정량적인 유전자 이론에서 고전적인 극미한 모델에서 지지하는, 즉, 정량적인 특징은 극미한 효과를 가진 각 위치의 무한 수에 의해 제조된다는 가설에서 나온 총편차이다. 2개의 다른 군집(예를 들면 Wild Boar와 Large White) 사이의 유전적 차이의 대부분은 소수의 자리에 의해 조절된다. 선별은 커다란 효과를 가진 QTL 대립 유전자를 빠르게 고정하여 선별의 플래토우를 유도한다는 것을 가정한다. 그러나 효과적인 군집 크기가 합리적으로 큰 경우18, 우수한 지속되는 장기간의 선별 반응이일반적으로 얻어지는 선별 실험 또는 동물 사육 프로그램에서 실험이 아니다. 이러한 모순에 대해 2개의 군집 사이의 유전적 차이점의 대부분을 조절하는 QTL 대립 유전자가 여러 가진 연속하는 돌연변이에 기인할 것이라는 설명도 가능하다. 즉, 동일한 유전자 또는 동일한 특성에 영향을 미치는 여러 개의 밀접하게 연결된 유전자에서 돌연변이가 생길 수 있다. 새로운 돌연변이는 장기간 선별반응19에 888+8+-8+++8+/+살잘족?? 가요허자먼 이러한 돌연변이의 유전자 분포는 알려지지 않았다.
단일 원인성 돌연변이에 대한 조사는 마우스에서 유전적 결함 및 인간에서 단일 유전적 이상의 분석에 관한 예가 된다. 본 발명에서는 가축, 곡식, 또는 천연 군집에서 다수의 세태에 대한 선별되는 장소에 대한 경우가 되지는 않는다고 제안되었다. 이 가설은 주요 QTL에서 다중 대립 유전자의 존재를 예상한다. 돼지의 코트 색상 변수의 최슨 특성에 의해 지지된다. 본 발명은 또한 가축의 백색에 대한 대립 유전자와 검은 점에 대한 대립 유전자 모두가KIT및MC1R위치, 각각20, 21에서 표현형 작용을 가지는 적어도 2가지 연속적인 돌연변이에서 해당 야생형 대립 유전자와는 다르다는 것을 발견하였다. 이점에서, 부가된 실시예에서는Igf2-연결된 QTL에서 제3의 대립 유전자를 확인하였다. 3개의 대립 유전자의 근육량에 대한 효과는 이들이 발견되는 사육으로 동일 순서로 랭크된다. 즉, Pietrain 돼지는 Large White 돼지 보다 더욱 근육이 많아서 살코기가 함량이 Wild Boar보다 많다.
Igf2가 새로이 보고된 QTL의 원인이 되는 유전자라고 판단하는 좋은 이유가있다. 우선, 지도 위치화에서 완전 동일하다(도 2). 2번째로,Igf2는 QTL과 같이 쥐, 인간, 및 현재 돼지에서 부계로 발현된다는 것이 밝혀졌다. 쥐와 인간에서Igf2의 인접한 몇 개의 다른 각인 유전자(Mash2, INS2, H19, KVLQT1, TAPA1/CD81, 및 CDKN1C/p57KIP2)가 있으나, 오직Igf2만이 성숙한 조직22에서 부계에 의해 발현된다. 본 발명자는 이 자리는 QTL의 분자 특성화의 독특한 기회를 제공한다고 믿어진다. 뚜렷한 부계의 발현을 사용하여 유전자의 이 모드를 보여주지 않는 유전자를 제외시킨다. 또한, 대립 유전자의 존재를 원인성 돌연변이와 연결된 중성의 다형성 사이의 곤란한 구별을 활용하여야한다. 본 발명에서는 Pietrain에서 얻은Igf2대립 유전자와 Large White 돼지 사이의 코딩 서열에 차이가 없다는 것을 이미 밝혔다. 이것은 원인성 돌연변이는 조절 서열에서 발생한다는 것을 제안한다. 분명한 단계는 전체Igf2유전자 및 3개의 군집에서 다중 프로모터를 서열하고자 하는 것이다. 인슐린 (INS) 유전자의 프로모터 영역에서 VNTR 다형질이Igf2발현23에 영향을 미치는 최근의 보고서는 원인성 돌연변이가Igf2코딩 서열에서 상당히 멀리 있을 것이라는 것을 의미한다.
결과에서는 돼지 사육 산업에 몇 가지 중요한 의미를 나타낸다. 유전자 각인이 심원한 학문적 문제가 아니지만, 실제적인 사육 프로그램에서 고려되어야 할 필요가 있다는 것을 나타낸다. Wild Boar, Large White, 및 Pietrain 군집에서 3가지 다른 대립 유전자의 검출은Igf2-연결된 QTL에서 추가의 대립 유전자가 상업적 군집 내에서 격리한다는 것을 가리킨다. 암컷의 기여를 무시할 수 있기 때문에QTL의 부계 발현이 다형의 부계 하프-시브 가족을 사용하여 검출할 수 있도록 한다. QTL은 군집 내에 선별 보조된 마커에 의해 또는 하나의 군집에서 다른 군집으로 바람직한 대립 유전자의 이입을 보조하는 마커에 의해 살코기 함량을 개선시키기 위해 개발된다.
실시예 2
Pietrain X Large White 이종 교배
방법
혈통 재료: QTL 지도 작성하기 위해 이용된 혈통 재료는 이전에 기재된 >1,800 개체6,7을 포함하는 이전에 기재된 Pietrain X Large White F2 혈통에서 선택한다. 이 F2 자손을 조합하기 위해, 27마리의 Pietrain 수퇘지를 20마리의 Large White 암퇘지와 교배시켜 456마리의 개체를 포함하는 F1 세대를 발생시켰다. 1984에서 1989까지 31마리의 F1 수퇘지는 관련이 없는 82마리의 F1 암퇘지와 교배시켜, 총 1862 F2 자손을 생산하였다. F1 수퇘지를 평균 7마리의 암컷과 교배시키고 F1 암퇘지는 평균 2.7 수컷과 교배시켰다. 수퇘지 한 마리당 평균 자손수는 60마리고 암퇘지 당은 23마리이다.
표현형 정보: (ⅰ) 데이터 수집: 총 21가지의 독특한 표현형이 F2 세대에서 기록되었다6,7. 여기에는 다음을 포함한다:
- 5가지의 성장 특성: 출생 체중(g), 이유기 체중(㎏), 성장기 체중(㎏), 성숙완료기 체중(㎏), 및 1일 평균 체중 증가(ADG: ㎏/일; 성장기부터 성장 완료기까지)
- 2가지 신체 비율 측정: 도체 길이(㎝); 및 적합성 점수(0 내지 10의 범위; ref. 6);
- 도살 24시간 후의 냉장한 고기의 해체에 의해 얻어진 10가지 도체 조성의 측정:
근육량 측정: % 햄(햄의 중량/도체의 중량), % 옆구리살(옆구리 중량/도체의 중량), % 어께살(어께살 중량/도체의 중량), % 살코기 부분(% 햄 + % 옆구리 + %어께살);
지방의 측정: 평균 등지방 두께(BFT: ㎝), % 등지방(등지방의 중량/도체의 중량), % 복부(복부 중량/도체의 중량), % 옆상 지방(옆상 지방의 중량/도체의 지방), % 목살(목살의 중량/도체의 중량), 및 "% 지방 부분"(% 등지방 + % 복부 + % 옆상 지방 + % 목살);
- 4가지 육질 측정: pHLD1(Longissimus dorsi도살 1시간 후), pHLD24(Longissimus dorsi도살 24시간 후), pHG1(Gracilis도살 1시간 후), 및 pHG24(Gracilis도살 24시간 후).
(ⅱ) 데이터의 처리: 개별 표현형은 고정된 작용(아비, 어미, CRC 유전형, 성, 연령-계절, 출산경력) 및 공분산(한배 새끼의 크기, 출생 체중, 이유기 체중, 성장기 체중, 성장완료기 체중)을 위해 사정 조정하여 해당하는 특정에 현저하게작용하는 것을 검증하였다. 이 모델에 포함된 변수는 단계적으로 회귀하도록 선택되었다.
마커의 유전형타이핑: 마이크로새틀라이트의 PCR 증폭을 위해 사용되는 프라이머 쌍은 기재된 바19와 같다. 이전에 기재된 바20와 같이 마커의 유전형타이핑을 실시하였다. 1, 12에 기재된 바와 같은 종래의 방법을 이용하여CRC및MyoD위치에서 유전형을 측정하였다. PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍(5'-CCCCTGAACTTGAGGACGAGCAGCC-3'; 5'-ATCGCTGTGGGCTGGGTGGGCTGCC-3') 및 LAR 단계를 위해 3개의 프라이머 세트(5'-FAM-CGCCCCAGCTGCCCCCCAG-3', 5'-HEX-CGCCCCAGCTGCCCCCCAA-3'; 5'-CCTGAGCTGCAGCAGGCCAG-3')을 이용하여 Baronet al 21에 따라Igf2SNP를 위한 LAR 테스트를 개발하였다.
지도 구성: CRIMAR 패키지22의 TWOPOINT, BUILD, 및 CHROMPIC 조건을 이용하여 구성하였다. 이 패키지를 활용하기 위해, 완전한-일가 가족을 해체하고 개별적으로 처리하였다. 이렇게 함으로써, 수퇘지 또는 암퇘지와 관련된 임의의 잠재적으로 사용가능한 정보는 무시되었으나, 재조합 율의 측정치에 대한 바이어스를 없앴다.
QTL 지도 작성: (ⅰ) 멘델성 QTL의 지도 작성: 다점 최대 유사 방법(multipoint maxium likelihood method)을 사용하여 종래의 QTL 맵핑을 실시하였다. 적용된 모델은 염색체당 QTL을 격리시키고 각기 부계 혈통인 Pietrain(P) 및 Large White(LW)에서 대체적인 QTL 대립 유전자를 고정시키는 것이라고 가정하였다. F1 염색체의 부계 기원을 결정할 수 없을 수 있기 때문에 특정 분석 프로그램에서는 부계 세대의 잃어버린 유전형을 고려하여 전재해 나가야만 할 것이다. 통상적인 "인터발 맵핑(interval mapping) 전략을 사용하여, 사용자 정의의 단계를 사용하여 마커 맵을 따라 가설의 QTL을 이동시켰다. 각 위치에서, 혈통 데이터의 가능성(L)은 다음과 같이 계산된다:
P 또는 우측 염색체 P에는 F1 부모에서 총 2r의 조합이 있다.
은P/P, P/LW, LW/P, 및 LW/LW의 4가지 가능한 QTL 유전형에 대해 F2 자손이다.
P(G｜Mi, θ, φ)Mi: F2 자손과 이의 F1 부모의 마커 유전자형이고, (ⅱ) 인접한 마커들 사이 및 가설의 QTL과 이의 플랭킹 마커 사이의 재조합 속도의 벡터; 및 (ⅲ)θF1 부모의 고려된 마커-QTL상 조합
재조합 속도 및 F1 부모의 마커 결합상은 이 가능성을 계산하는 경우 알려진 것으로 암시된다. 양쪽은 맵 구성상(상기 참조)에서 CRIMAP을 이용하여 결정된다.
자손 i의 P(yi｜G)yi)는 QTL 유전형이 제공된다. 가능성은 다음의 정상 밀도 함수로부터 계산된다:
G는 고려된 QTL 유전자형(PP, PL, LP, 또는 LL)의 표현형을 의미하는 것이고 σ2는 남은 평방 편차는 4가지 QTL 유전자형 군에 동일한 것으로 고려된다.
μPP,μPL=μLP, ,μLL,및 σ2최대화 L의 값은 GEMINI 최적화 루틴23을 이용하여 결정되었다. 이 대체안의 H1가설하에서 얻어진 가능성을 4가지 유전자형 군의 표현형 평균을 동일하다는 QTL이 없는 null 가설 H0에서 얻은 가능성과 비교하였다. 해당 가능성의 로그값 사이의 차이는 해당 맵 위치에서 QTL에 대한 증거를 측정하는 로드스코어를 제공한다.
(ⅱ)유의성 문턱치: 선택된 유전자에서 유의성 수준과 관련된 Lander & Botstein24, 로드 스코어 문턱치(T))는 다음과 같이 계산한다:
C는 염색체의 개수(=19)이고, G는 모르간에서 유전자의 길이(=29)이고, χ2 2(4.6T)는 1에서 2 d.f.로 카이-제곱의 분산의 분산 함수의 누적값을 뺀 것이다. 단일점 21n(LR)은 2의 자유도를 가진 카이-제곱 분산으로 분산되는 것으로 가정하였고, 부가 성분 및 우성 성분 모드를 맞추었다. 본 발명에서 다중 특성을 분석하고 있다는 사실을 고려하기 위해, 분석되는 독립 특징의 유효수에 대한 유의성 수준을 Bonferoni 수정을 적용하여 조절하였다. 유효수는 Spelmanet al 25에 기재된 접근에 따라 16으로 예상되었다. 전적으로 5%의 실험에 의한 유의성 수준과 관련된 로드스코어 문턱치를 5.8로 고정하도록 하였다. 독립 샘플에서 동일화된 QTL을 확인하고자 하는 경우, 동일한 접근법이 C를 1로 고정하고 G를 25 cM로 고정하고, 4.5 독립 특징의 분석을 수정(이 샘플에서는 6가지의 특징만이 분석됨)하는 데 사용되었다. 이것으로 2의 5% 타입 I 에러와 연관된 로드스코어 문턱치를 산출하였다.
(ⅲ) 각인된 QTL의 시험: 각인된 QTL에 대해 시험하기 위해, 본 발명에서는 주어진 성의 부모에 의해 전해지는 QTL 대립 유전자만이 표현형에 영향을 미치고, 다른 부모에 의해 전달되는 QTL 대립 유전자는 "중성"인 것으로 간주하였다. 이 가설하의 혈통 데이터의 가능성은 방정식 1을 사용하여 계산하였다. 그러나 P(yi｜G)를 계산하기 위해, 부계의 대립 유전자만이 발현되는 QTL을 시험하는 경우, 4가지 QTL 유전형의 표현형 평균은 μPL= μP이고 μLP= μLL= μL로 설정하고, 모계의 대립 유전자만이 발현되는 QTL을 시험하는 경우, μPP= μLP= μP이고 μPL= μLL= μL로 설정한다. 첫 번째 가정은 부계의 대립 유전자를 의미하는 것이고, 두 번째 가설은 모계 대립 유전자를 의미하는 것이라고 가정한다. H0은 QTL이 없는null-가설이고, H1은 멘델의 QTL 존재를 시험하는 것이고, H2는 부계 발현된 QTL의 존재를 시험하는 것이고, H3은 모계 발현된 QTL의 존재를 시험하는 것이다.
RT-PCR: Chirgwinet al 26에 따라 골격근에서 총 RNA를 추출하였다. Gene-Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer)를 사용하여 RT-PCR을 실시하였다. QiaQuick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하고, Dye 터미네이터 Cycle Sequencing Ready Reaction(Perkin Elmer) 및 ABI373 자동 서열기를 사용하여 서열화하였다. 실시예 2에서는 돼지 2pl.7에 대한 근육량 및 지방 축적의 지도 작성에 대한 QTL의 주요한 작용을 확인한 것을 보고하였다. QTL은 부계 각인의 뚜렷한 증거를 보여주어Igf2자리의 포함을 강하게 제시한다.
1125 F2자손을 포함하는 Pietrain X Large White 이종 교배는 6,7에 기재된 바와 같이 이루어졌다. Large White 및 Pietrain 부계 혈통은 다수의 경제적으로 중요한 표현형에서 다르다. Pietrain은 특별한 근육량 및 살코기8(도 2) 때문에 사육되는 것이지만, Large White는 우수한 성장능력을 보여준다. (ⅰ) 우수한 성장성(5), (ⅱ) 근육성(6), (ⅲ) 지방 축적(6), 및 (ⅳ) 육질(4)을 측정하는 21개의 독특한 표현형이 F2자손에서 기록되었다.
이들 혈통 사이의 유전적 차이에 관한 QTL 지도 작성하기 위해, 677F2개체의 초기 샘플에 마이크로새틀라이트 마커를 사용하여 전체 게놈 스캔을 실시하였다. ML 다점 알고리듬을 사용하여 돼지 염색체 2의 분석에서는 염색체 2의 짧은팔의 말초 말단에 근육성 및 지방 축적을 측정하는 12개의 표현형중 6개에 대해 매우 현저한 로드스코어(20 이하)를 나타낸다(도 3a). 양의 로드 스코어를 남은 5개의 표현형에서 얻었지만, 유전자 상으로 유의성 문턱치(=5%)에는 도달하지 않았다. 이러한 발견을 확인하기 위해, 355 F2자손의 남은 샘플을 5개의 가장 먼 2p 마커로 유전자 타이핑하였고, QTL 분석을 이들 특성에 대해 실시하여 첫 번째 분석에서 가장 높은 로드 스코어를 제공하였다. 2.1 내지 7.7범위의 로드 스코어는 이 지역의 주요 QTL의 존재를 확실하게 확인하였다. 표 2는 3개의 유전자형 평균 및 해당 남은 변이의 ML 측정치를 기재한다.
양방향성의 염색체 패인팅은 SSC2p와 HSA11pter-q139,10사이의 상관성을 설정한다. 적어도 2개의 심각한 후보자 유전자가 인간에서 이 지역의 지도 작성하고; 미오겐의 염기 헬릭스-루프-헬릭스 인자인MyoD가 HSA11p15.4 지도 작성하고 Ifg2는 HSA11p15.1를 지도 작성한다.MyoD는 미오게네시스의 잘 알려진 중요한 조절자이고 전개11동안 전환되는 첫 번째 미오겐 마커 중 하나이다. 돼지의MyoD유전자12에서 이전에 기재된 증폭된 서열 다혈성은 이 마커에서 전체 유전자형이 되는 F2물질에서 격리되는 것을 증명하였다. 결합 분석은 SW240-SW776(odds>1000) 간격에서MyoD유전자에 위치하므로, QTL의 로드-2 하락 서포트 간격의 멀리 떨어져 있다(도 1).
Igf2는 실험실 내에서 미오블라스트의 증식 및 분화를 촉진시키고13, 생체 내에서 과잉 발현된 경우 근육의 비대를 유발하는 것으로 알려졌다. 출판된 성숙한 돼지의 간 cDNA 서열14을 기준으로, 성숙한 골격근 cDNA로부터 리더 222 bp 및 트레일러 서열 280 bp를 가지고 전체Igf2코딩 서열을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계하였다. Pietrain 및 Large White RT-PCR 산물을 서열화하여 코딩 서열이 혈통에서 출판된 서열과 동일하다는 것을 지시한다. 그러나 DA 전환을 인간에서 엑슨 2에 해당하는 리더 서열에서 발견하였다(도 4). 결착 증폭 반응(LAAR)을 기준으로 하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 대한 검색 테스트를 개발하여, 혈통 물질에 대한 유전자타이핑을 가능하게 하였다. 이들 데이터를 기준으로Igf2를Swc9마이크로새틀라이트 마커(=0%)로 공통 국지화하도록 나타내어서, QTL의 가장 가능성이 있는 위치에서 약 2 센티모간에서 그리고 95% QTL의 서포트 간격 내에 위치하였다(도 1). 이어진 서열 분석에서는 마이크로새틀라이트 마커인Swc9가 실제로Igf2유전자의 3'UTR 내에 위치한다는 것이 나타났다. PGA와 FSH 위치에 대한 활용가능한 비교용 맵핑 데이터와 결합하여, 이들 결과는MyoD를 포함하는 염색체 분획의 틈새의 역전의 발생을 제안하지만, 양쪽 종에서 남은 말단 소립을 가지는Igf2에 대해서는 아니다.
따라서Igf2는 관찰된 QTL 작용을 가지는 위치의 강한 대립 유전자로 보였다. 인간 및 마우스에서,Igf2는 각인되고 여러 가지 조직15에서 부계 대립 유전자로부터 배타적으로 발현되는 것으로 알려졌다. SNP 및/또는Swc9에 대한 돼지 이종 접합에서 얻은 골격근의 cDNA의 분석에서는 동일 각인이 돼지에서도 이 조직에서 유지된다는 것을 나타낸다( 도 4). 따라서,Igf2가 관찰된 효과에 대응한다면, 오직 부계의Igf2대립 유전자가 발현된다는 것을 알게 되어서, (ⅰ) F1 수퇘지(P 또는 LW)에 의해 전달된 부계의 대립 유전자가 F2 자손의 표현형에 대한 작용을 가질 것이고, (ⅱ) F1 암퇘지(P 또는 LW)에 의해 전달된 모계의 대립 유전자가 F2 자손의 표현형에 대한 작용을 미치지 않을 것이고, (ⅲ) 데이터의 가능성은 트리모델의(1:2:1) F2 군집의 종래의 "멘델의" 모델과 비교한 경우, 유전된 부계 대립 유전자에 의해 분류된 바이모델의(1:1) F2 군집의 모델에서 우수할 것이라는 것을 예측할 수 있다. 해당 가설을 테스트할 수 있도록 QTL 맵핑 프로그램을 적용하였다. H0를 QTL이 없는 null 가설로 정의하고, H1을 멘델의 QTL의 존재에 대해 시험하고, H2를 부계 발현된 QTL의 존재에 대해 시험하고, H3를 모계로 발현된 QTL의 존재에 대해 시험한 것으로 정의한다.
도 3은 얻어진 결과를 요약한 것이다. 도 3a, 3b, 및 3c는 각각 log10(H2/H0), log10(H3/H0), 및 log10(H2/H1)에 해당하는 로드스코어 곡선을 보여주는 것이다. 부계 발현된 QTL의 존재에 대해 시험한 경우 매우 뚜렷한 로드스코어가 얻어지는 것을 알 수 있으나, 암퇘지에 의해 전달된 염색체를 연구한 경우 QTL의 격리에 대한 어떠한 증거도 없다. 또한, 실험된 모든 특성에 대해 부계로 발현된 QTL의 가설은 "멘델의" QTL의 가설보다 더욱 유의적인 가능성이 있다(log10(H2/H1) > 3). 모든 특징에서 동일한 경향이 관찰되었다는 사실은 다른 특징에 대해 관찰된작용에 대응하는 동일한 각인된 유전자일 것이다라는 것을 의미한다. 표 2는 유전된 부계의 QTL 대립 유전자에 의해 정리되는 F2 자손의 ML 표현형 평균을 기록한 것이다. 멘델의 QTL의 모델로 분석을 실시하는 경우, Pietrain 및 Large White QTL 대립 유전자는 부가 경향으로 2개의 균일한 유전형 사이의 중간점에 정확하게 해당하는 표현형 평균을 나타내는 이종 접합 유전형을 작용하는 것으로 나타났다. 이것은 이종 접합의 자손의 반으로 각인된 QTL을 다루는 경우 예상된 수 있는 것은 이들의 아비에서 P 대립 유전자, 다른 절반의 LW 대립 유전자가 유전되는 것으로 정확하게 예측된다.
따라서 이들 데이터는 부계 대립 유전자로부터 배타적으로 발현되는 각인된 유전자의 수반 가설을 확인하였다. 동정된 염색체의 분획이 인간과 마우스에서 기록된 각인 도메인과 정확하게 일치한다는 사실은 돼지에서 오르소로그 영역을 관련시키는 것이다. 이 도메인에 지도 작성하는 적어도 7개의 각인된 유전자가 기록되었다(Igf2, Inc2, H19, Mash2, P57 KIP2 , K v LQTL1 및 TDAG51)(참고자료 15 및 Andrew Feinberg, 사적 통화). 이들 중에서, 오직Igf2및 Ins2 만이 부계로 발현된다. 관찰된 QTL 작용이 이 영역에서 아직 확인되지 않은 각인된 유전자에 기인한 것이라는 것을 배제할 수는 없지만, 실험실 내 및 생체내13실험에서 미오게네시스에 대한 이의 보고된 작용은Igf2를 강하게 의미한다. 특히, 근육 특이적 프로모터로부터Igf2를 과대 발현하는 형질 전환된 마우스에서 관찰된 근육의 비대가 이 가설을 지지하고 있다(Nadia Rosnthal, 사적 통화). INS VNTR의 대립유전자의 변형이 최근 인간에서 출생시 크기와 관련됨이 밝혀졌고16, 동일한 VNTR이Igf2발현의 수치에 대한 효과를 밝혀냈다17.
Large White X Wild Boar 이종 교배에서 동일한 QTL 작용의 관찰에서는 일련의 최소 3개의 독특한 작용성 대립 유전자가 존재하는 것을 의미한다. 또한, 마커 보조 격리 분석을 기준으로 하는 예비 증거는 Pietrain 군집 내에 이 지점에서 잔류 격리에 대해 지적한다(데이터는 나타나지 않음). 대립 유전자 시리즈의 발현은 -미묘한 조정 돌연변이라기 보다는 총체적인 유전자 변경일 것인 관찰된 작용의 정량적인 상태를 기준으로 함- 원인의 다형성을 확인하는 데에는 가치가 없을 수 있다.
확인된 QTL의 근육량 및 지방 축적에 대한 작용은 육질에 대한 관련된 악화 작용없이 CRC 자리에 대해 보고된 것6,7과 동일한 크기로 주요한 것이다. 본 발명자들은 위치들이 근육성과 살코기에 대해 Pietrain 대 Large White 혈통 차이의 50%에 근접하게 기재된 것을 추정한다. 이러한 자리를 특징화하는 유래의 부모 작용을 혈통 프로그램에서 적합하게 사용하도록 할 것이다. 또한, 상업적으로 인기가 있는 Pietrain X Large White의 이종 접합된 수퇘지에서 얻은 자손의 절반이 바람직하지 않은 Large White 대립형질을 유전하여 상당히 손실을 초래한다.
본 명세서에 기재된 QTL은 비-멘델성 유전 패턴을 나타내는 가축종에서 근육의 발달에 영향을 미치는 유전자의 제2의 예이다. 또한, callipyge(근육이 2배가 되는 정량적인 특성과 관련된)는 이들의 아비에서 GLPG 돌연변이를 유전하는 이형접합 개체에만 이들 근육의 표현형5이 발현한다는 극적인 과대 유성에 의해 특화된다. 이것은 가축에서 생산 특성을 나타내는 유전자에 영향을 미치는 부모 유래의 작용이 상대적으로 공통적이라는 것을 설명한다.
실시예 3
돼지에서Igf2및 플랭킹 위치의 기준 서열의 생성
본 발명은 돼지에서Igf2위치에 대해 근육량 매핑에 주요한 효과를 가진 각인된 QTL을 제공하고, 마커 보조 선별에서 도구로서 QTL을 사용한다. 마커 보조 선별의 이 도구를 미세 조정하고, 불규칙한 돌연변이를 추가로 확인하기 위해, 전체 돼지의Igf2서열 및 플랭킹 유전에서 나온 서열을 포함하는 참고 서열을 추가로 생성하였다.
이것을 달성하기 위해, 본 발명에서는Igf2프로브를 가지고 돼지의 BAC 라이브러리를 검색하고 2가지 BAC를 확인하였다. BAC-PIgf2-1은 INS 및Igf2유전자를 포함하는 것을 증명하지만, BAC-PIgf2-2는Igf2및 H19 유전자를 포함하는 것을 증명하였다. NOTⅠ맵 및 2개의 BAC의 상대적인 위치는 도 5에 나타나 있다. 표준 공정 및 자동 서열기를 사용하여 BAC-PIgf2-1을 서열화하였다. 표준 소프트웨어를 사용하여 얻어진 서열을 조합하여 chd 115개의 콘티그를 생산하였다. 해당 서열은 도 6에 기재된다. 돼지의 콘티그와 인간의 오르소로그 서열사이에서 유사성 검색을 실시하였다. 뚜렷한 상동성이 18개의 콘티그에서 검색되었고 도 7에 기재되어있다.
BAC-PIgf2-2에 대해, BAC-PIgf2-1에 존재하지 않는 24 Kb NotⅠ단편을 서브 클론화하고 EZ::TN 트랜스포손 접근법 및 ABI 자동 서열기를 사용하여 서열화하였다. 얻어진 서열을 Phred-Phrap-Consed 프로그램 슈트를 사용하여 조립하여 7개의 독특한 콘티그를 제공하였다(도 8). GCG 슈트의 비교 및 도프플롯 프로그램을 사용하여 콘티그 서열을 해당 오르소로그 인간 서열에 따라 배열하였다.
실시예 4
Igf2및 플랭킹 위치에서 DNA 서열 다형성의 확인
실시예 1에 기재된 바와 같이 얻어진 참고 서열을 기준으로, 본 발명에서는 Pietrain, Large White, 및 Wild Boar 개체에서 격리된 유전자 DNA로 부터Igf2와 플랭킹 위치의 일부를 재서열화하여, 도 10에 나타난 바와 같은 DNA 서열의 다형성을 확인하도록 하였다.
참고 자료
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[표 1]
| 특징 | F 비율2 | 지도 | F2% | 최소 제곱 평균3 | ||||
| LP/LM | QTL | 각인 | 위치3 | 변수4 | Wp/WMn=62 | Wp/LMn=43 | Lp/WMn=43 | n=30 |
| 신체 조성 특징 | ||||||||
| 햄에서 살코기 % | 24.4*** | 19.1*** | 0 | 30.6 | 63.6a | 64.2a | 66.4b | 67.3b |
| 햄에서 살코기 중량 ㎏ | 18.1*** | 16.8*** | 1 | 24.3 | 4.69a | 4.72b | 4.94b | 5.02b |
| 등의 살코기 + 뼈 % | 12.2** | 9.6* | 0 | 17.4 | 66.3a | 66.7a | 69.3b | 70.8b |
| 최장 근육 면적, ㎠ | 10.3** | 4.8* | 1 | 15.4 | 31.9a | 33.0a | 34.5b | 35.2b |
| 지방 특성 | ||||||||
| 평균 등 지방 깊이 ㎜ | 7.1* | 8.7** | 0 | 10.4 | 27.2a | 27.7a | 25.5b | 24.7b |
| 내장의 중량 | ||||||||
| 심장, g | 9.7** | 11.4*** | 0 | 14.4 | 226a | 225a | 238b | 244b |
| 육질 특성 | ||||||||
| 반사값, EEL | 5.7 | 6.1* | 1 | 8.1 | 18.6a | 18.4 | 21.8b | 19.7a |
*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001
표 1
1QTL 피크가IGF2영역(0-10 cM)이고, 테스트 통계수치가 F=3.9의 현저한 유의수준 문턱에 도달한 특성만을 포함.
2"QTL"은 부가, 우성, 및 각인 작용(3d.f.)을 가진 유전자 모델의 QTL의 존재에 대한 테스트 통계 수치이고, "각인"은 각인 효가(1 d.f.)의 존재에 대한 테스트 통계수치로, 둘 모두 QTL 피크의 위치에서 얻음. 게놈으로 유의성 문턱은 순열으로 예상되는 것으로 QTL 테스트에 사용되는 것이나, 현저한 유의성 문턱은 각인 테스트에서 사용되는 것이다.
2p의 원위 말단에서3In cM;IGF2는 0.3 cM에 위치한다.
4주어진 위치에서 각인된 QTL의 포함에 의해 작용되는 F2군집의 남은 변수에서 감소.
5각 대립 유전자의 군집 및 부모 유래에 따라 유전자형을 분류함으로써Igf2위치에서 예측되는 평균 및 표준 편차. W 및 L은 Wild Boar 및 Large White 파운더에서 유래된 대립 유전자를 각각 의미하고; 윗첨자 P와 M은 부계 및 모계 유래를 각각 나타낸다. 다른 글자(위첨자 a 또는 b)로 표현되는 것은 적어도 5% 수준에서 적어도 유의적으로 다른 것이고, 이들 대부분은 1% 또는 0.1% 수준에서 다른 것이다.
[표 2]
(ⅰ) 멘델의 QTL의 모델 및 (ⅱ) 각인된 QTL을 가정하는 모델하에서 측정된 상이한 F2 유전자형의 최대 가능한 표현형 평균
| 특징 | 멘델의 QTL | 각인된 QTL | |||||
| μLW/LW | μLW/p | μP/P | R | μPAT/LW | μPAT/P | R | |
| BFT (㎝) | 2.98 | 2.84 | 2.64 | 0.27 | 2.94 | 2.70 | 0.27 |
| % 햄 | 21.10 | 21.56 | 22.15 | 0.83 | 21.23 | 21.95 | 0.83 |
| % 옆구리 | 24.96 | 25.53 | 26.46 | 0.91 | 25.12 | 26.14 | 0.93 |
| % 살코기 부분 | 65.02 | 65.96 | 67.60 | 1.65 | 65.23 | 67.05 | 1.67 |
| % 등지방 | 6.56 | 6.02 | 5.33 | 0.85 | 6.43 | 5.56 | 0.85 |
| % 지방 부분 | 28.92 | 27.68 | 26.66 | 1.46 | 28.54 | 26.99 | 1.49 |
Claims (27)
- 부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL: Quantitative Trait locus)의 존재에 대해 동물을 시험하는 단계를 포함하는 소망하는 유전 형질을 가진 가축 선별 방법.
- 제1항에 있어서,부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)의 존재에 대해 상기 동물에서 얻은 핵산 샘플을 시험하는 단계를 추가로 포함하는 가축 선별 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,돼지에서 상기 QTL이 염색체 2에 위치하는 가축 선별 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서,상기 QTL이 위치 2pl.7 주변에서 지도 작성되는 가축 선별 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL이 상기 동물의 잠재적인 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되는 가축 선별 방법.
- 제5항에 있어서,상기 QTL이 적어도 일부의 인슐린-유사 성장 인자-2(IGF2) 유전자를 포함하는 가축 선별 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,돼지에서 상기 QTL이 도 4와 동일한nt241(G-A)또는Swc9로 특징이 되는 마커(marker)를 포함하는 가축 선별 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL의 부계 대립 유전자가 상기 동물에서 우세하게 발현되는 가축 선별 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL의 모계 대립 유전자가 상기 동물에서 우세하게 발현되는 가축 선별 방법.
- 부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL) 또는 그로부터 유도된 기능적인 단편을 포함하는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 적어도 하나의 염색체 또는 그로부터 유도된 기능적인 단편으로부터 유도되고 합성인 부모로부터 각인된 정량적인 형질 유전자 자리(QTL)를 포함하는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제10항 또는 제11항에 있어서,적어도 일부가 Sus scrofa 염색체로부터 유도된 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제12항에 있어서,상기 핵산이 적어도 부분적으로 Sus scrofa 염색체2, 바람직하게 위치 2p1.7 주변에서 지도 작성되는 영역으로부터 유도된 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL이 상기 동물의 잠재적인 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL이 인슐린-유사 성장 인자-2(IGF2) 유전자의 적어도 일부를 포함하는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL의 부계 대립 유전자가 우세하게 발현될 수 있는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,상기 QTL의 모계 대립 유전자가 우세하게 발현될 수 있는 분리 및/또는 재조합 핵산.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따르는 방법에서 제10항에 따르는 핵산 또는 그의 유도된 단편을 사용하는 용도.
- 제18항에 있어서,소망하는 유전 형질 또는 잠재적인 표현 형질에 대해 사육 동물 또는 도살될 동물을 선별하는 데 사용하는 용도.
- 제19항에 있어서,상기 형질이 근육량 및/또는 지방 축적과 관련되는 용도.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따르는 용도에 의해 선별된 돼지와 같은 동물.
- 제21항에 있어서,부계 각인된 QTL에 있는, 바람직하게 위치 2p1.7 주변에서 지도 작성되는 Sus scrofa 염색체 2에 위치하는 대립 유전자에 대해 동종 접합성(homozygous)인 것을 특징으로 하는 동물.
- 제21항 또는 제22항에 있어서,상기 QTL이 상기 돼지의 잠재적인 근육량 및/또는 지방 축적에 관련된 것이고, 및/또는 상기 QTL이 적어도 일부의 인슐린-유사 성장 인자-2(IGF2) 대립 유전자를 포함하는 동물.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따르는 핵산을 포함하는 형질전환 동물.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,수컷인 동물.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따르는 동물에서 유래된 정자 또는 배아.
- 도살될 동물을 사용하는 데에 제26항에 따르는 정자 또는 배아를 사용하는 용도.
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