CN116083604A - 一种影响绵羊断奶重的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种影响绵羊断奶重的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记位于绵羊第18号染色体的第19555931位。以湖羊为例，该位点的基因型为CC的个体，与基因型为CT或TT的个体相比具有更高的断奶重。本发明确定了与绵羊断奶重显著相关的MYADM基因座单核苷酸多态性标记，可以用于快速建立具有优良生长性状的绵羊种群，从而用于绵羊生长性状的早期的选择，并加快绵羊分子标记辅助选择育种进程。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与家畜分子育种领域，涉及一种与绵羊断奶重相关的单核苷酸多态性(SNP)标记及其应用。
背景技术
随着人们消费习惯的改变，羊产业的发展格局也正在逐渐发生变化，肉羊生产逐渐成为主流。对于诸如湖羊、哈萨克羊、苏尼特羊等一些地方肉用绵羊品种，其相较于杜泊羊、萨福克羊、陶赛特羊等国外的大型肉羊品种来说，存在着产肉效率低、生长速度慢等劣势。因此，加速改良地方肉用绵羊品种的生长性能，更好的发展肉羊产业，成为了绵羊选育工作中亟待解决的问题。
羔羊断奶时的体重，即断奶重是反映绵羊生长性能的一个重要指标，其会影响优良种用绵羊的选育和商品羊的价值，进而影响整个羊产业的经济效益和发展。羔羊断奶时的体重越大，其对断奶的应激反应就越小，在断奶后的腹泻率、死亡率就越低，生长速度就越快，所带来的经济效益也就越高。在实际生产中，很多规模化养殖厂为了提高产房栏舍的利用率，都会对羔羊进行提前断奶。因此，在羔羊有限的哺乳期内提高断奶体重就显得尤为重要。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR。其依据引物末端碱基的特异性匹配，利用Touch-down PCR与荧光淬灭探针，并结合发出的荧光信号对SNP位点进行分型。具体而言，KASP需要在标记附近的扩增目标DNA序列内部进行引物设计：对于共显性标记，由于存在两条目标序列，故相应设计三条引物，包括两条位点特异性引物和一条通用引物。位点特异性引物的3’端为SNP位点，在KASP扩增过程中分别与两个通用淬火探针FAM和HEX结合，从而发出荧光信号，最后根据荧光信号进行基因分型。KASP技术可以对广泛存在于基因组DNA中的SNPs进行精准的检测，是一种高通量、低成本、低失误率的SNP分型技术。而且可以避免实验室凝胶电泳，从而实现自动化、平台化操作。
MYADM(Myeloid-associated differentiation marker，髓系相关分化标记)基因是髓鞘和淋巴细胞(MAL)家族的成员，其能在多能组细胞中表达、并在髓系细胞分化过程中上调造血相关标记。已有研究表明MYADM基因与多个生物性状的发育相关，其首先在人的骨髓中被发现，并且其在胚胎期具有较高的表达量；在小鼠胚胎中，其与细胞的迁移与扩散相关。但受到群体规模和表型数据对单倍型及SNP遗传分析造成误差的影响，目前尚未见到定位在MYADM基因座(例如与上述MYADM基因相似的序列区域)上且能够应用于绵羊断奶重选育的SNP标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种影响绵羊断奶重的SNP分子标记及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性标记在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用，所述单核苷酸多态性标记位于绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第18号染色体的第19555931位。
优选的，所述单核苷酸多态性标记为CC基因型。
一种用于检测绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性标记的KASP引物，该KASP引物包括通用引物和具有FAM接头的野生型位点特异性引物，以及具有HEX接头的突变型位点特异性引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为3’末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第18号染色体的第19555931位的单核苷酸多态性位点的等位基因C和T相同的竞争性上游引物，通用引物为下游引物(野生型位点特异性引物所加FAM接头在KASP检测中显示出红色荧光，突变型位点特异性引物所加HEX接头在KASP检测中显示出蓝色荧光)。
优选的，所述KASP引物具体为：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctGTCCCTACGGAAACCTGGC-3’(小写字母部分为FAM接头)
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattGTCCCTACGGAAACCTGGT-3’(小写字母部分为HEX接头)
下游引物：
5’-CTACGACATGTGCCTCTAGGATTG-3’。
一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
以待测绵羊的基因组DNA为模板，通过上述KASP引物扩增包含MYADM基因座单核苷酸多态性位点的部分片段，然后通过对荧光的检测鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型，所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点为绵羊参考基因组(ARS-UI_Ramb_v2.0)第18号染色体的第19555931位。
优选的，根据对荧光的区分即可确定所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点的3种基因型(参见SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的第101位碱基处的一C/T的突变位点)：CC为红色、CT为绿色、TT为蓝色。
优选的，所述绵羊为湖羊。
上述绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点的CC基因型为提高绵羊断奶重的遗传标记。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过对绵羊18号染色体的MYADM基因座的核苷酸突变检测分析，在MYADM基因座上发现并鉴定了与绵羊断奶重显著相关的SNP位点(即绵羊参考基因组第18号染色体的第19555931位)，并就此提供了一种鉴别绵羊断奶重的分子标记(遗传标记)及方法，可以用于快速建立生长性状优良的绵羊种群，从而为绵羊品种改良提供遗传样本依据，有利于缩短品种培育周期，加快品种培育进程，同时也有利于提高选种的准确性。
附图说明
图1为绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测总体技术流程图。
图2为湖羊样本基因组DNA质检电泳图；图中：1、8、16为样本编号，M为Marker。
图3为湖羊样本第18号染色体的第19555931位KASP分型结果(CC、CT、TT基因型)；图中：NTC为无模板对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。需要指出的是以下实施例的给出仅是为了起到解释本发明的目的，并不是用于对本发明的保护范围进行限制。
(一)鉴定绵羊18号染色体上与断奶重相关的单核苷酸多态性标记
1.开展对绵羊18号染色体的核苷酸突变检测分析
参见图1，对所获得的绵羊重测序数据进行单倍型分析，发现具有不同断奶重的绵羊在MYADM基因座处的单倍型明显不同，且在18号染色体的第19555931位等单核苷酸位点，不同断奶重的绵羊的等位基因频率存在差异，具体说明如下。
实验中获取了包括25只萨福克羊、31只无角陶赛特羊、34只巴音布鲁克羊、22只哈萨克羊、10只欧拉藏羊、5只苏尼特羊、57只湖羊在内的7个品种共计184只绵羊的重测序结果(具体样本来源见表1)。这些品种的绵羊按其在断奶时的体重情况大致可分为两组，分别为：国外肉用绵羊(萨福克羊、无角陶赛特羊)和中国地方品种绵羊(巴音布鲁克羊、哈萨克羊、欧拉藏羊、苏尼特羊、湖羊)，其中，国外肉用绵羊的断奶重高于中国地方品种绵羊。
表1.样品信息表
对上述两组绵羊的重测序数据进行单倍型分析，发现在第18号染色体的MYADM基因座(ARS-UI_Ramb_v2.0 chr18:19522210-19601658)处存在明显不同。用VCFtools软件计算上述MYADM基因座各SNP位点的基因频率，发现国外肉用绵羊和中国地方品种绵羊在第18号染色体的第19555931位(chr18:19555931)的基因频率具有较大差异(表2)，而在其他一些SNP位点(如chr18:19549424、chr18:19592130、chr18:19523431)处也观测这样的差异结果。
表2.各绵羊品种在18号染色体的第19555931位的遗传多态性统计
参见表2，通过对各绵羊品种在单核苷酸多态性位点(上述18号染色体的第19555931位)处的基因型频率和等位基因频率分析发现：国外肉用绵羊在此位点处的CC基因型的频率最高，中国地方品种绵羊则为TT基因型的频率最高，两者的基因型频率存在极为明显的差异。
据此，可将上述MYADM基因座内的chr18:19555931、chr18:19549424、chr18:19592130、chr18:19523431等相关位点作为预测绵羊断奶重的候选单核苷酸多态性位点。
(二)利用绵羊第18号染色体单核苷酸多态性遗传标记选择具有断奶重优势的绵羊个体
本发明利用KASP分型的方法对绵羊18号染色体的第19555931位等的多态性进行检测，并揭示具有可以用作绵羊育种辅助选择的分子标记的位点，具体说明如下。
(1)采集血样
选择湖羊为试验材料，采集湖羊静脉血样(陕西省榆林市上河羊厂，2022年6月)。
(2)基因组DNA的提取
从湖羊血样中提取DNA，DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)进行提取，提取时按试剂盒提供的操作说明书进行操作。
(3)样品DNA质量
使用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000C超微量分光光度计测量所提取的基因组DNA浓度，结果显示，样品浓度均在100ng/μL以上，260/280值在1.8-2.0之间；电泳结果显示基因组DNA条带清晰无杂质(图2)，表明所提取的基因组DNA完整度良好，符合后续试验标准。
(4)引物设计
以SEQ.ID.NO.1所示的含有绵羊参考基因组ARS-UI_Ramb_v2.0版本第18号染色体的第19555931位的MYADM基因座部分片段为模板，使用Primer5.0等软件设计PCR扩增引物：
上游引物F1：5’-GTCCCTACGGAAACCTGGC-3’
上游引物F2：5’-GTCCCTACGGAAACCTGGT-3’
下游引物R：5’-CTACGACATGTGCCTCTAGGATTG-3’。
分别在两个上游引物(F1和F2)5’端加上不同的KASP接头，即FAM接头(序列如SEQ.ID.NO.5所示)和HEX接头(序列如SEQ.ID.NO.6所示)，接上FAM接头的上游引物1-FAM的序列与接上HEX接头的上游引物2-HEX的序列如下：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctGTCCCTACGGAAACCTGGC-3’
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattGTCCCTACGGAAACCTGGT-3’
将设计的上游引物1-FAM、2-HEX与通用引物(即下游引物R)一起送康普森农业科技有限公司合成。
(5)KASP扩增
以提取所得的基因组DNA为模板，以合成的上游引物1-FAM、2-HEX与通用引物作为实验引物组进行PCR扩增，具体反应体系和反应程序如下：
反应体系：20ng/μL的基因组DNA 5μL、2×KASP Master mix 5μL，以及KASP Assaymix(上游引物1-FAM浓度为12μM，上游引物2-HEX浓度为12μM，通用引物浓度为30μM)0.14μL。
反应程序：94.0℃预变性15min；94.0℃变性20s，61.0℃复性延伸60s，10个循环(每个循环复性温度降低0.6℃)；94.0℃变性20s，55℃复性延伸60s，重复26个循环。
(6)基因分型
使用ABI 7900HT实时荧光定量PCR检测系统进行基因分型，根据分析结果确定所述的第18号染色体的第19555931位的基因型，分型结果如图3所示。
同时设计相应的引物组对MYADM基因座的其它SNP位点进行KASP扩增、基因分型。
(7)基因型与性状关联分析
试验共对536只湖羊的18号染色体的第19555931位等的基因型进行了检测，并测定每个个体的断奶重数据。将同一位点的基因型与断奶重进行关联分析，建立了以下最小二乘模型：
Yilkm＝μ+Genotypei+Pk+Tl+Combinationm+εilkm
其中，Yilkm是性状观察值，μ是总体均数，Genotypei为基因型效应，Pk为场次效应，Tl为胎数效应，Combinationm为组合效应，εilkm为随机误差，假定εilkm相互独立，服从N(0，σ2)分布。
对于第18号染色体的第19555931位，KASP分型结果显示在536个个体当中CC基因型有27个，CT基因型有111个，TT基因型有398个。基因型与性状的关联结果如表3所示。
表3.湖羊第18号染色体的第19555931位的遗传多态性与表型的关联分析
注：同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.01)；断奶时间为二月龄
结果(表3)表明，湖羊18号染色体的第19555931位与其羔羊断奶时的体重呈显著相关：CC基因型个体的断奶重显著高于CT基因型和TT基因型的个体。因此筛选出具有CC基因型的个体可以有效的建立高断奶重的绵羊种群。
而其他SNP位点，如chr18:19549424、chr18:19592130、chr18:19523431等SNP位点与羔羊断奶时的体重无相关性，或在与断奶重的相关性上弱于以上18号染色体的第19555931位的作用和影响。
本发明利用所发现的绵羊参考基因组第18号染色体的MYADM基因座内一个对断奶重具有显著影响的SNP分子标记，提出了在DNA水平上检测羔羊断奶时的体重的方法，该方法不受绵羊年龄等限制，可用于在绵羊的早期选育中更有效的鉴定绵羊的生长性能，同时有利于克服传统育种周期长、效率低等缺点，为快速建立高生长性能的绵羊种群提供参考，并提高绵羊生长性能的选种选育过程的针对性、准确性，从而加快绵羊的选种选育进程，促进绵羊的培育改良。
Claims (10)
1.一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性标记在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述单核苷酸多态性标记位于绵羊参考基因组第18号染色体的第19555931位。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述绵羊参考基因组的版本为ARS-UI_Ramb_v2.0。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述单核苷酸多态性标记为CC基因型。
4.一种用于检测绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性标记的KASP引物，其特征在于：该KASP引物包括具有FAM接头的野生型位点特异性引物、具有HEX接头的突变型位点特异性引物和通用引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组第18号染色体的第19555931位的单核苷酸多态性位点的等位基因C和T相同的竞争性上游引物，通用引物为下游引物。
5.根据权利要求4所述一种用于检测绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性标记的KASP引物，其特征在于：所述KASP引物具体为：
上游引物1-FAM：
5’-gaaggtgaccaagttcatgctGTCCCTACGGAAACCTGGC-3’
上游引物2-HEX：
5’-gaaggtcggagtcaacggattGTCCCTACGGAAACCTGGT-3’
下游引物：
5’-CTACGACATGTGCCTCTAGGATTG-3’。
6.一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
以待测绵羊的基因组DNA为模板，通过KASP引物扩增包含MYADM基因座单核苷酸多态性位点的部分片段，然后通过对荧光的检测鉴定该单核苷酸多态性位点的基因型，所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点为绵羊参考基因组第18号染色体的第19555931位。
7.根据权利要求6所述一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述KASP引物包括具有FAM接头的野生型位点特异性引物、具有HEX接头的突变型位点特异性引物和通用引物，所述野生型位点特异性引物和突变型位点特异性引物为末端碱基分别与定位于绵羊参考基因组第18号染色体的第19555931位的单核苷酸多态性位点的等位基因C和T相同的竞争性上游引物，通用引物为下游引物，根据对荧光的区分即可确定所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点的3种基因型：CC为红色、CT为绿色、TT为蓝色。
8.根据权利要求6所述一种绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述绵羊为湖羊。
9.一种如权利要求6-8中任意一项所述的绵羊MYADM基因座单核苷酸多态性的检测方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述MYADM基因座单核苷酸多态性位点的CC基因型为提高绵羊断奶重的遗传标记。
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