CN103409440B - Phkg1基因及其在种猪肉质性状遗传改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种位于猪3号染色体上的PHKG1基因的核苷酸或氨基酸序列，所述PHKG1基因的突变位点为SEQ ID NO:1所示序列的第8118位的单核苷酸C与A互变，当由C突变为A时，导致PHKG1基因在转录过程中所产生的一个较正常转录本缺失了32bp片段的异常转录本，该缺失的32bp片段位于SEQ ID NO:1的5’端第8123-8154位碱基。在此基础上，通过选择有利的基因型个体留种，淘汰不利的基因型个体，可以显著提高种群肉质性状，尤其是降低肌糖原含量、减少滴水损失和加工损失、提高pH值和肌内脂肪含量，从而改善猪肉品质。

Description

PHKG1基因及其在种猪肉质性状遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及影响系水力（滴水损失）、pH、肌糖原酵解潜能等猪肉质性状的PHKG1基因及其在种猪遗传改良中的应用。

背景技术

提高猪肉品质已成为全世界养猪业的共同目标。目前，猪肉品质存在的主要问题之一是系水力低，由于系水力低使得猪肉在加工和销售过程中产量减少，食用品质下降，继而严重影响猪肉的商业价值。

过去的研究表明，肌糖原酵解、pH值下降是影响猪肉系水力的主要因素。猪宰后，肌糖原会酵解生成乳酸，导致pH下降；当pH下降到肌原纤维蛋白质等电点（约为5.4）附近的时候，蛋白质所带正负电荷大致相等，净电荷为零，肌肉蛋白质对水分的吸引力最低，导致水分大量流失。同时，pH值下降还会引起蛋白质凝集，肌肉收缩，将水分挤出。因此，避免pH值下降过快或过低对提高系水力有重要意义。

然而，猪肉pH受宰前应激等环境因子影响较大，不容易稳定。肌糖原酵解潜能（glycolytic potential,GP）反映了猪屠宰后肌肉糖原和葡萄糖转变成乳酸的量，是度量肉样具有的酸化潜力。这种潜力受遗传制约较大而受环境影响较小。GP在很大程度上决定了猪肉终pH值的高低，进而影响系水力（滴水损失）、加工产量（包括烹饪损失和火腿腌制加工损失）、肉色、肌内脂肪等多个肉质指标，故GP的测定对育种乃至饲养管理有更深层次的意义。

由于肉质性状属数量性状，受多基因控制，且只能屠宰测定，这大大增加了研究难度。目前，PRKAG3（又名RN^-）基因是国际上唯一被鉴别的同时影响肌糖原含量和系水力的主效基因。早在1985年，Monin和Sellier（Meat Sci,1985,13:49-63）注意到一种外观象PSE肉，但并非PSE肉的“汉普夏型猪肉”(Hampshire type meat)。这种猪肉颜色苍白，有水分渗出，但渗出性较典型PSE肉低。成熟过程中pH值下降速度正常，但最终pH值比正常肌肉要低。这种肉由于最终pH值异常低，所以被称为酸肉（acid meat）。导致酸肉的主要原因是GP含量过高。这种猪肉的主要缺陷在于加工火腿时的工艺产量（简称Rendement Napole,RN产量）显著偏低，而且这一特征与遗传有关。1990年，Le Roy等（Genetical Research,1990,55:33-40）通过分离分析的方法首次证实了RN^-（显性）和rn⁺（隐性）等位基因的存在。1999年，Lebret等（Journal of Animal Science,1999,77:1482-1489）发现携带显性等位基因RN^-的个体肌糖原含量增加70%，与之相应的是猪肉GP值明显偏高、pH值偏低，同时也导致了猪肉宰后滴水损失增加、系水力降低、干物质和蛋白质含量的减少，从而影响火腿产量。2000年，Milan等（Science,2000,288:1248-1251）发现汉普夏猪中一磷酸腺苷激活性蛋白激酶γ3亚基 （PRKAG3）基因第200个密码子（Arg>Gln突变，即R200Q突变）是引起RN效应，即GP值明显偏高、pH值偏低，同时也导致了猪肉宰后滴水损失增加、系水力降低、干物质和蛋白质含量的减少，从而是影响火腿产量的根本原因。R200Q突变使得肌肉中糖原贮积量过高（GP≥180μmol/g），从而造成肉偏酸和加工产量显著偏低，并直接导致了火腿生产加工中的巨大经济损失。目前，英国PIC、法国PEN AR LAN、丹麦丹育公司、芬兰种猪联合会等育种公司都将PRKAG3基因检测技术应用于种猪核心群的选育，基本消除了汉普夏猪酸肉这一不良现象。

尽管在PRKAG3（又名RN^-）因果基因鉴别上取得了突破，但人们对影响GP和系水力的遗传因素的认识尚很有限。例如，R200Q位点在杜洛克、长白，大白等西方商业猪种中没有多态性，然而Costa等（CIHEAM–Options Mediterraneennes,2000,999:227–231）发现在杜长大三元杂交猪中，约有10%个体的GP超过180μmol/g，同样表现出低pH和低系水力，这说明除PRKAG3外，还存在有其它影响GP的主效基因。因此，实有必要深入研究并确定影响肌糖原含量的其它主效基因，验证其对系水力（滴水损失）、pH、肌糖原酵解潜能等多个肉质性状的影响效应，最终建立高效准确的基因育种技术，将其应用于种猪肉质性状遗传改良中，从而改善猪肉品质。

发明内容

为了深入研究除PRKAG3外的其它可能影响肌糖原含量和系水力的主效基因，本发明利用白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体和苏太猪群体，通过全基因组关联（GWAS）分析等方法，鉴别到影响猪肉质性状的主效基因为PHKG1，其位于猪3号染色体上。在此基础上，构建一种高效且低成本的该突变位点的基因型的检测方法。对比研究了不同基因型对猪肌肉的糖原酵解潜能、肌糖原含量、pH、滴水损失、肌内脂肪含量、大理石纹评分等肉质性状的影响，确定了有利和不利的基因型，选择有利的基因型个体留种，淘汰不利的基因型个体，可以显著提高种群肉质性状，从而达到改善猪肉品质的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种位于猪3号染色体上的PHKG1基因的核苷酸或氨基酸序列，其特征在于，它为下述序列a）～e）之一：

a）DNA序列：在如SEQ ID NO：1所示的PHKG1基因的DNA序列基础上，其序列标注位置为其5’端第8118位的单核苷酸由A突变为C的序列；它对应于国际猪基因组10.2版本（Sscrofa genome Assembly10.2）的参考序列3号染色体上第17082117位核苷酸，即g.17082117A>C突变；将SEQ ID NO:1突变后的PHKG1基因的DNA序列命名为SEQ ID NO:2；

b）cDNA序列：在如SEQ ID NO:3所示的cDNA序列基础上，其序列标注位置为其5’端第1075-1106位的32个核苷酸缺失突变后的序列；它对应于国际猪基因组10.2版本（Sscrofa genome Assembly10.2）的参考序列3号染色体上第17082122-17082153位核苷酸的插入/缺失突变；将SEQ ID NO:3突变后的PHKG1基因的cDNA序列命名为SEQ ID NO:4；

c）如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列；

d）序列d）为因果突变位点与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的因果突变位点一致，且与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有90%以上同源性且与其编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

e）能与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4序列杂交的核苷酸序列。

本发明意外地发现，SEQ ID NO:1所示的PHKG1基因的DNA序列上，其序列标注位置为其5’端第8118位的单核苷酸A和C互变时，将显著影响猪肌肉的糖原酵解潜能、肌糖原含量、pH、滴水损失、肌内脂肪含量、大理石纹评分等肉质性状，因此，影响猪肉质性状的主效基因为PHKG1，其DNA序列上的5’端第8118位的单核苷酸A和C的互变是其因果突变位点；考虑到第8118位为A是现有技术中参考序列的单核苷酸，本发明需要保护该位点为C的核苷酸序列，即如SEQ ID NO:2所示的DNA序列。

在上述序列a）中，SEQ ID NO:1为现有技术中已经公开的猪基因组中的参考序列，该序列是检测的某一头杜洛克猪的序列。而SEQ ID NO:2是本发明中发现的一种与现有技术不同的序列。对于任何猪种的肉质性状改良来说，本发明中发现的序列SEQ ID NO:2对应的猪的肉质性状优良，而现有技术中的序列SEQ ID NO:1对应的猪的肉质性状不佳。

在上述序列b）中，SEQ ID NO:3为现有技术中已经公开的猪基因组中的参考序列，该序列与SEQ ID NO:1并非来自同一头猪，因而这两个参考序列间（的3号染色体上第17082117位核苷酸）是不能对应的。SEQ ID NO:4是本发明中发现的一种与现有技术不同的序列。对于任何猪种的肉质性状改良来说，本发明中发现的序列SEQ ID NO:4对应的猪的肉质性状不佳，而现有技术中的序列SEQ ID NO:3即包含这插入的32个碱基的序列对应的猪的肉质性状优良。

另外，所述SEQ ID NO:3序列可以看成是SEQ ID NO:2序列转录而来的，所述cDNA中第1075-1106位对应相应DNA序列中的第8123-8154位。PHKG1基因的DNA序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中包括内含子和外显子；但cDNA序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中不含内含子，只含外显子，不能翻译成氨基酸的内含子均在转录过程中全部被剪切掉；因SEQ ID NO:2中第8118位碱基是属于内含子的碱基，所以在SEQ ID NO:3中就并不存在这个碱基位置。

在上述序列c）中，SEQ ID NO:5为现有技术中已经公开的猪基因组中的参考序列，该序列与SEQ ID NO:1并非来自同一头猪。SEQ ID NO:6是本发明中发现的一种与现有技术不同的序列。对于任何猪种的肉质性状改良来说，本发明中发现的序列SEQ ID NO:6对应的猪的肉质性状不佳，而现有技术中的序列SEQ ID NO:5对应的猪的肉质性状优良。在上述序列c）中，如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸残基序列对应的蛋白质为磷酸化酶激酶γ1，且序列SEQ ID NO:6可以是经过SEQ ID NO:1序列衍生而得，而序列SEQ ID NO:5可以是经过SEQ ID NO:2序列衍生而得。

在上述序列d）中，首先，本领域技术人员容易想到的是，除了序列a）中的5’端第8118位的单核苷酸这个因果突变位点以外，DNA序列中的其余9000个碱基也是可以突变的，因 此，只要是PHKG1基因的DNA序列中的因果突变位点为C，其余9000个碱基同时也发生部分突变而导致其DNA序列与SEQ ID NO:2并不相同，这样的序列只要其与SEQ ID NO:2具有90%以上同源性，且与SEQ ID NO:2编码相同功能蛋白质，其效果和应用与SEQ ID NO:2相似是本领域技术人员容易想到的。这样的序列是本发明中需要保护的序列。同样，与SEQ ID NO:4相似度高的序列也是本发明中需要保护的核苷酸序列。这两种序列统称为序列d）。

在上述序列e）中，本领域技术人员可知的是，能与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4序列杂交的核苷酸序列的效果和应用也会与这两种核苷酸相似。在此，杂交的条件可以是多种多样的，如以本领域技术人员认可的任意一种方式杂交皆可。

本发明的上述发明目的具体是这样实现的：

1、实验动物 

本发明所使用的实验猪群体共有2个：白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体和苏太猪（50%杜洛克猪和50%太湖猪血缘）群体。

F₂资源群体以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F₁代，选9头F₁公猪与59头F₁母猪分6批次互交产生1912头F₂个体，其中有1029头F₂个体在240±5日龄进行屠宰测定。

苏太猪是一个中国培育品种，由中国太湖猪（包括二花脸和梅山猪）和西方杜洛克猪种通过18个世代以上的杂交培育而获得，各含50%太湖猪和50%杜洛克猪的血缘。本发明中利用4头苏太公猪与55头苏太母猪交配获得500余头后代，最后434头苏太猪于240±5日龄被屠宰测定。

2、实验方法 

猪屠宰后30分钟内，取第14-15肋骨间的背最长肌，投入液氮冷冻，然后在-80℃下保存。采用常规生化手段——酶分析法，利用肌糖原、乳酸测试盒（购自南京建成生物研究所，货号分别为A043、A019-2），检测每个个体肌肉样品中糖原、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖和乳酸这4种组分的含量，然后按下列公式计算出GP值：GP(μmol/g肌肉)=2×(糖原+葡萄糖+6-磷酸葡萄糖)+乳酸。

在猪宰后45分钟和24小时，使用瑞士梅特勒肉样专用pH计，测定11～14肋骨间背最长肌和半膜肌的pH值（pH45min和pH24h）和温度；用Minolta色度仪CM-2600d/2500d测定肉的亮度（L^*）、红度（a^*）和黄度（b^*）；用美国国家猪生产联合会（NPPC）制作的主观评分板判定肉的颜色（1=苍白，6=暗黑）和大理石纹（1=稀少，10=极丰富）；用常规烘箱烘干法和索氏萃取法分别测定肉样的水分和肌内脂肪含量（IMF）。采用EZ-滴水损失管测定法同时测定背最长肌（来自1-3腰椎处）和半膜肌的滴水损失。宰后24小时，用圆形取样器取肉样（约6g），称样品初始重（W1）；然后将肉样装入EZ-滴水损失管（KABE Labortechnik,Numbrecht-Elsenroth,Germany），并放入4℃冰箱贮存24小时。之后，再次称量肉样（W2）。计算滴水损失为滴水重（肉样前后两次称量的差值W1-W2）占初始肉重（W1）的百分比。

3、猪全基因组60K SNP判型

从上述F₂资源群体和苏太猪群体中的每个个体采集一小块耳样，用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop-ND1000分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50ng/μl，送北京怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60KSNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率低于95%、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到约4万个SNP的有效基因型数据。

4、全基因组关联（GWAS）分析

为了消除群体层化效应，本发明采用线性混合模型单点回归分析并结合R程序中的GenABEL软件包进行GWAS分析，分析模型中利用个体间基因组的相似度校正层化效应。基因组水平的显著区域采用保守的Bonferrini校正方法确定，即基因组显著水平阈值为1.25×10^-6，即0.05/40000（有效SNP数量）。

GWAS分析结果如图1A至图1E所示。从图1A和图1B中可知，在F₂资源群体中，在3号染色体存在极显著影响GP和剩余糖量（residual glucose，包括葡萄糖和糖原）的位点。从图1C和图1D可知，在F₂资源群体中，在3号染色体上没有发现与6-磷酸葡萄糖（6-P-G）和乳酸（lactate）显著关联的信号，提示这个位点可能导致糖原贮积量升高或分解减慢。基于此，申请人在苏太猪只针对剩余糖量进行了GWAS分析，如图1E所示结果再次表明在3号染色体上检出与剩余糖量显著关联的信号。在F₂群体的GWAS分析中，最强关联SNP为ALGA0124306（P=2.12E-23），其位置对应于国际猪基因组参考序列（Sscrofa genome Assembly10.2版本）3号染色体的17.09Mb处；而苏太猪中最强关联SNP为ALGA0123314（P=2.93E-19），它位于16.92Mb处。通过LOD（似然函数比值的对数）值下降2的方法，将F₂资源群体和苏太群体的QTL置信区间分别确定为16.92-17.84Mb和16.47-17.10Mb，它们共享的置信区间为16.92-17.10Mb，即猪的3号染色体（SSC3）上影响GP的主效基因极可能在此180kb长的染色体区域内。

5、因果基因PHKG1的确定

5.1基因功能注释信息

在上述180kb区域内包含了7个功能基因，分别是GUSB、VKORC1L1、NUPR1L,CHCHD2、PHKG1、SUMF2和CCT6。其中，PHKG1基因编码肌型磷酸化酶激酶的催化亚基。肌型磷酸化酶激酶是糖原分解代谢的关键酶。

5.2表达QTL（eQTL）定位和QTT分析

从497头F₂个体的背最长肌中提取总RNA，采用基因数字表达谱（DGE）技术，检测肌细胞中所有基因的表达量，结合这些个体的60K SNP基因型数据，通过关联分析，定位eQTL。结果发现PHKG1基因有一顺式调节的eQTL（P=5.82E-18，见图2）。该eQTL的最强关联标记位点正好与影响GP表型QTL的最强关联标记位点相同，均为SNPALGA0124306。此外，QTT分析结果表明PHKG1基因的RNA转录水平与GP表型之间有较强的相关性，相关系数为-0.36（P<1.0×10^-5）。基于以上结果，申请人确定PHKG1是影响GP的因果基因。

6、突变位点g.17082117A>C的功能分析

为进一步验证g.17082117A>C剪切突变位点是PHKG1的因果突变位点，申请人做了以下几个方面的检测。

6.1.检测PHKG1基因转录水平的变化

申请人首先对缺失转录本引起的无义突变介导mRNA降解程度进行了定量分析。用Primer5.0软件设计三对引物，相关信息见表1。第一对正反引物（Qq-RT-5′-FP/RP）都与缺失突变c.del/ins32上游5’端序列配对，故可同时扩增正常转录本（q）和缺失突变转录本（Q）；第二对引物（q-RT-3′-FP/RP）的反向引物恰好落在32bp缺失片段内，故仅能从q转录本上得以扩增，不能对Q转录本扩增（见图3A）；第三对引物扩增管家基因β-actin，作为PHKG1转录水平的对照。按F₂个体在g.17082117A>C位点的基因型，选取突变型纯合子（QQ，即AA），杂合子（Qq，即AC）和野生型纯合子（qq，即CC）各3头。用TRNzol-A⁺总RNA提取试剂盒（天根公司，货号：DP421）提取这些个体背最长肌的总RNA，再用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（Takara公司，货号：DRR047s）进行反转录实验，反转录所得的cDNA用上述三对引物做实时荧光定量PCR。结果发现杂合子个体的第一对引物扩增产物量（Q+q）与第二对引物扩增产物量（q）之间的比率大约为1.4（见图3B），由此可推算出Q转录本与q转录本之间的比率为0.4:1，即相差2.5倍，这与先前基于cDNA测序峰高（图4）估算2-3倍的差异相近。

申请人还比较了g.17082117A>C位点不同基因型个体间的PHKG1基因转录水平的差异。总共检测了120头F₂个体（每种基因型40头左右），结果表明不同基因型个体间mRNA水平差异显著（见图5）。

以上两个实验结果证明g.17082117A>C是导致PHKG1基因mRNA水平变化的根本原因，即该基因cis-eQTL的因果突变。

表1PHKG1基因qRT-PCR引物

6.2.检测PHKG1蛋白表达量的变化

为了进一步证实PHKG1的g.17082117A>C多态位点三种基因型个体间PHKG1蛋白表达水平存在差异，申请人利用鼠抗人PHKG1多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）进行蛋 白免疫印迹（Western blot）实验，发现PHKG1蛋白表达水平与其转录水平变化趋势基本一致，都呈现QQ(即AA)型表达量<Qq(即AC)型表达量<qq(即CC)型表达量（见图6）。因此g.17082117A>C突变同样造成了PHKG1蛋白水平的变化。

6.3.检测酶活性 

磷酸化酶激酶是糖原分解代谢的关键酶，而PHKG1基因编码此酶的催化亚基，因此PHKG1蛋白表达水平的变化，极可能影响磷酸化酶激酶的活性。为证实这一点，申请人利用GENMED组织糖原磷酸化酶激酶活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒（上海杰美基因公司，货号GMS50618.2），对g.17082117A>C的三种基因型的个体（每种基因型5个个体）肌肉组织糖原磷酸化酶激酶的活性进行了检测，发现它们的酶活性由低到高依次为：QQ(即AA)型<Qq(即AC)型<qq(即CC)型（见图7）。

综上研究结果，申请人确定PHKG1的g.17082117A>C突变是影响肌糖原酵解潜能及剩余糖含量QTL的因果突变，其分子机理是：该突变由C变为A后造成mRNA选择性剪切，产生32个碱基缺失的转录本，此转录本又被无义介导的mRNA降解机制所降解，从而不能翻译出正常的磷酸化酶激酶的催化亚基，使得磷酸化酶激酶的活性下降，相应地糖原分解速率减慢，肌糖原贮积量升高，并最终影响到滴水损失、pH、肌内脂肪含量和大理石纹等多个肉质性状指标。

本发明还提供一种在DNA水平上检测突变位点g.17082117A>C基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取待检测样本中的DNA；

2)以该DNA为模板，以针对PHKG1基因的编码区设计的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 

3)将PCR扩增产物进行酶切反应，得到酶切产物；

4)酶切产物经凝胶电泳，溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中观测电泳条带；

其中，AA基因型个体电泳后分成78bp和62bp两个条带，AC基因型个体分成140bp、78bp和62bp三个条带，而CC基因型个体只有一条140bp的条带。

优选地，所述PCR引物包含正向引物：5’-ATCCCTGTGCTTGCTGGTG-3’以及反向引物5’-CCCGGCGGTACTGGTAAT-3’。

本发明还提供一种在cDNA水平上检测突变位点g.17082117A>C基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取待检测样本中的RNA；

2)以该RNA为模板，以针对PHKG1基因的编码区设计的RT-PCR引物进行RT-PCR扩增，采用分子生物学方法判断通过RT-PCR扩增的cDNA序列是否存在32bp的缺失；

其中，in/in基因型表示为32bp插入的纯合子，in/del基因型表示为插入/缺失型的杂合子，del/del基因型表示为32bp缺失型的纯合子。

优选地，所述RT-PCR引物包含正向引物：5’-AATGGGATGATTACTCGG-3’以及反向 引物5’-TCAGTAGTCCTCGTCCTCA-3’。

本发明的上述发明目的是这样实现的：

1.PHKG1基因关键突变位点(causal mutation)的鉴别

1.1.PHKG1基因全长cDNA序列的分离 

通过Ensembl网站（http://asia.ensembl.org/index.html）下载猪PHKG1基因的cDNA序列（序列号为：XM_003124459.2）。由于Ensembl早期版本中PHKG1基因的cDNA并不完整，故采用Takara公司的5’-Full RACE Kit（货号：D315）和3’-Full RACE Core Set Ver.2.0（货号：D314）进行PHKG1全长cDNA的分离，获得新的全长1804bp的cDNA序列。全长cDNA序列特征如序列表SEQ ID NO:3所示。PHKG1基因cDNA序列所编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示。使用Primer5.0软件设计引物（见表2）。根据最强关联SNP标记ALGA0124306（A>G）的基因型，选取白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体中的三种基因型（GG、AG和AA）个体各2头进行比较测序。25μL的聚合酶链式反应（PCR）反应体系中，包括40ng猪基因组cDNA，1.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，正反向引物各10pmol，2.5单位DNA聚合酶（Taq酶）及1×PCR buffer（缓冲液）(上海博彩公司)。PCR采用Touchdown程序，扩增条件为：94℃变性4min；随后94℃变性30s，68℃退火（每个循环降0.5℃）30s，72℃延伸45s，进行26个循环；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行14个循环，最后再72℃延伸10min，得PCR扩增产物，该PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒（QIAGEN，Hilden，德国）纯化后委托上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。在cDNA上共发现了14个突变位点（见表3），其中有5个发生在基因编码区（CDS）内，其余9个出现在3’-非翻译区（3’-UTR）内。

表2PHKG1全长cDNA扩增引物

^a将cDNA上所鉴别的突变位点通过序列比对定位到猪基因组参考序列10.2版的位置。

1.2.PHKG1基因关键变异位点的鉴别

在上述14个cDNA序列变异中，有一个编码区（CDS）内32bp的缺失突变c.del/ins32（见图8）。该缺失突变直接导致开放阅读框的改变，并导致氨基酸编码的提前终止，因此缺失的转录本无法翻译出正常或有效的蛋白质。

为了验证此缺失突变在基因组DNA上也存在，申请人根据该突变周边的基因组DNA水平上设计了一对PCR引物（见表4），用于扩增资源家系F₀代个体DNA，其PCR体系及程序与上述扩增cDNA的PCR体系及程序相同。如果基因组上存在这一32bp缺失突变，那么该突变在F₀代个体中必有分离。然而，申请人将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳后，结果仅观察到单一条带（140bp），没有出现两个片段大小相差32bp的条带。这提示基因组上有另外一种变异特征，导致了部分个体产生缺失片段的转录本。

将DNA扩增的PCR产物送至上海生工测序，结果仅在这32个碱基的缺失突变之前的第5个碱基处（即SSC3上17082117bp处），发现一个A>C单核苷酸突变（见图9）。申请人对杂合子（CA基因型）个体的cDNA和gDNA扩增产物测序峰图进行比较（见图4），发现gDNA 测序中C和A等位基因峰高几乎相同，但在cDNA测序中正常转录本（对应C等位基因）和缺失片段的转录本（对应于A等位基因）的峰型高度明显相差2-3倍，由此推测缺失突变的转录本至少部分地被细胞内无义突变介导的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay,NMD）机制所降解。

表4PHKG1基因的基因组DNA水平上的PCR引物

1.3.突变位点g.17082117A>C导致选择性剪切的预测

申请人利用两个RNA剪切预测网站Splicport（http://spliceport.cbcb.umd.edu/）和ASSP（http://wangcomputing.com/assp/index.html），都发现这个基因组上的g.17082117A>C突变处在一个较弱的组成性受体位点（constitutive acceptor；受体位点周边序列是 方框内“c”表示突变位点，小写字母代表部分内含子序列，而大写字母代表部分外显子序列）旁边；当“C”突变为“A”后，不仅使该组成性受体剪切作用显著下降，而且使其下游隐蔽的选择性受体位点（alternative/cryptic acceptor；受体周边序列是cttctgtgagGATCTATTAT）暴露并起作用，从而导致突变转录本比正常转录本少32个碱基（见图10），所以g.17082117A>C是一种导致基因生物学活性改变的剪切位点突变。

1.4.突变位点g.17082117A>C基因型与QTL基因型的一致性分析

采用标记辅助分离分析方法判定资源群体9头F₁公猪和4头苏太F₀公猪的QTL基因型。每头具有后裔表型测定的公猪QTL基因型由Z值决定，Z值为似然率比值LH1/LH0的Log值，H0假定双等位基因QTL基因型为纯合子QQ或qq，H1为杂合子Qq。当Z<-2时，QTL基因型为QQ或qq；当Z>2时，QTL基因型为Qq；当-2<Z<2时，QTL基因型不能确定（见表5）。在这13头公猪中，有5头的QTL基因型判断为Qq杂合子，另4头判断为QQ或qq纯合子。

采用PCR-RFLP技术检测这13头公猪的g.17082117A>C突变位点基因型。PCR扩增所用引物的信息见表4，PCR反应体系和程序与前述相同。PCR反应结束后，采用NEB公司的TaqαI内切酶（货号：#R0149V）进行酶切实验，12μL的酶切反应体系中，包括5μL的PCR扩增产物，1.5μL的10×NEB buffer4，0.15μL的100×BSA，2单位TaqαI内切酶，将配置好的酶切体系进行PCR酶切，反应温度为65℃，反应时间为6小时，反应结束后酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后，于凝胶成像系统中观测电泳条带。在酶切充分的前提下，g.17082117A>C位点AA基因型个体电泳后会分成78bp和62bp两个条带，AC基因型个体则会分成140bp、78bp和62bp的三个条带，而CC基因型由于没有酶切位点，故只有一条140bp的条带。

将这13头公猪的PHKG1g.17082117A>C基因型与它们的QTL基因型相比较，发现两者分离特征完全一致；而之前GWAS分析所鉴别的两个最强关联SNP位点ALGA0124306和

ALGA0123314与QTL的关系却非如此（见表5），这提示g.17082117A>C突变可能是真正的因果突变。

表5三个影响GP的SNP基因型与QTL基因型一致性分析

^aWE表示白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体。ST表示苏太猪群体；

^b两头苏太公猪5675和6313的Z值分别接近-2和2，故推测它们的QTL基因型（斜体）极可能分别是纯合子（qq/QQ）和杂合子（Qq）；“-”表示无法推断QTL基因型；

^c,dALGA0124306和ALGA0123314分别为对白色杜洛克×二花脸F₂资源群体和苏太猪群GWAS分析所鉴别的与GP表型关联性最强的SNP；

^eSNP基因型（灰色背景）与QTL基因型不符。 

本发明的又一目的在于提供一种猪的分子育种方法，其特征在于：

使用序列表中SEQ ID NO:1或所述的SEQ ID NO:2核苷酸序列，对待测的猪基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测；确定自序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的5’端第8118位碱基为C还是为A；其纯合体的基因型为CC或AA，其杂合体基因型为CA；CC基因型相应的猪肉质性状优于CA基因型和AA基因型相应的猪肉质性状；

或者是使用序列表中SEQ ID NO:3或所述的SEQ ID NO:4核苷酸序列，对待测猪的RNA进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行单核苷酸多态性检测；确定自序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的5’端第1075-1106位碱基为缺失还是不缺失；其纯合体的基因型为in/in或del/del，其杂合体基因型为in/del；in/in基因型相应的猪肉质性状优于in/del基因型和del/del 基因型相应的猪肉质性状。

相比而言，CC基因型和in/in基因型猪肉质性状的优异性表现在：肌肉的糖原酵解潜能、肌糖原含量、滴水损失显著较低，而pH、肌内脂肪含量和大理石纹评分显著较高。

本发明还提供一种猪遗传改良的方法，包括在种猪核心群中选择所述的g.17082117A>C位点相应的CC基因型个体，淘汰AA基因型和AC基因型个体，逐代提高等位基因C的频率，以此达到改善猪肉品质的目的。

本发明还提供一种筛选优良肉质性状的猪品种的方法，包括检测猪3号染色体上的PHKG1基因中SEQ ID NO:1序列5’端第8118位单核苷酸是C还是A，淘汰A保留C；或者检测SEQ ID NO:3序列的5’端第1075-1106位这32个碱基是否缺失，淘汰缺失的保留未缺失的。

本发明还提供一种PHKG1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4在种猪肉质性状遗传改良中的应用。

本发明还提供一种PHKG1基因的如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列在种猪肉质性状遗传改良中的应用。

本发明还提供一种与所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4核苷酸序列具有90%以上同源性且与其编码相同功能蛋白质的核苷酸序列在种猪肉质性状遗传改良中的应用。

本发明还提供一种能与所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列杂交的核苷酸序列在种猪肉质性状遗传改良中的应用。

本发明还提供一种与PHKG1基因的因果突变位点连锁不平衡程度r²大于0.8的分子标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用，所述PHKG1基因的因果突变位点为其DNA序列即SEQ ID NO：1的5’端第8118位的单核苷酸。

这样的分子标记例如为图11中的ALGA0123314、16936505、17031073、17062301、17078916、17091063、ASGA0082344、17112826、17218091和17231433，利用这些分子标记（相应位点的突变）中的任意一个来检测种猪肉质性状是否优良时也能达到80%及以上的准确率，这些分子标记都是与所述因果突变位点相关的；本发明中也需要保护这些分子标记在种猪肉质性状遗传改良中的应用。

在一些具体实例中，所述种猪肉质性状遗传改良是指相应的猪肉的糖原酵解潜能、肌糖原含量和滴水损失中的一或多项显著降低，或是指相应的猪肉的pH值、猪肌内脂肪含量和大理石纹评分中的一或多项显著提高。

附图说明

图1A至图1E是白色杜洛克×二花脸F₂资源家系和苏太猪的背最长肌糖原酵解潜能（GP）及其组分的全基因组关联（GWAS）分析图；

其中：图1A代表F₂资源家系GP的GWAS分析图；图1B代表F₂资源家系的GP组分之一剩余糖量（包括葡萄糖和糖原）的GWAS分析图；图1C代表F₂资源家系的GP组分之一6-磷酸葡萄糖的GWAS分析图；图1D代表F₂资源家系的GP组分之一乳酸含量的GWAS分析图；图1E代表苏太猪肌剩余糖原含量的GWAS分析图；上述五图的横坐标均表示猪的染色体编号，纵坐标表示log（1/P）。

图2是PHKG1基因的表达数量性状位点（eQTL）定位结果示意图；

其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

图3A和图3B是做qRT-PCR的两对引物的设计位置及二者相对扩增产量的比较示意图；

其中：图3A表示两对qRT-PCR的设计引物与PHKG1基因的野生型（q）和突变型转录本（Q）碱基配对的位置图；图3B表示三种基因型个体的RT-5’引物平均扩增产物量（Q+q）与RT-3’引物扩增产物（q）量的比较。 

图4是杂合子（CA基因型）个体的cDNA和gDNA扩增产物测序峰图的对比；

其中字母“M”代表着基因组gDNA上的A>C突变。

图5是PHKG1基因突变对其转录水平影响效应示意图。

图6是PHKG1基因突变对其蛋白表达水平（western blot）影响效应示意图。

图7是PHKG1基因突变对糖原磷酸化酶激酶活性影响效应示意图。

图8最强关联SNP标记ALGA0124306（A>G）的基因型比较示意图；

根据最强关联SNP标记ALGA0124306（A>G）的基因型选取白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体中的三种基因型（GG、AG和AA）个体各2头，进行PHKG1基因cDNA比较测序，发现一个32bp缺失突变（c.del/ins32）。

图9是PHKG1基因的8118A>C位点即g.17082117A>C的鉴别；

其中：M处存在一个A>C单核苷酸突变。

图10是PHKG1剪切位点突变示意图；

其中：图中灰色底色表示cDNA水平上32个碱基的缺失片段，即GTGATCGCTCTGACGGTGCTGGCTTCTGTGAG；字母“M”代表着基因组DNA上的A>C突变。“Site1”表示组成性剪切受体位点；“Site2”表示隐蔽的选择性剪切受体位点。

图11是苏太猪群体PHKG1的突变位点g.17082117A>C周边的单倍型框图。

具体实施方式

以下配合附图及本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

除非特别说明，文中表示突变的“>”是指前后两个单核苷酸互变，例如A>C或C>A均 是指该位点上A与C互相突变。

针对种猪核心群个体，利用上述的PCR酶切（PCR-RFLP）鉴别PHKG1的g.17082117A>C突变，选择有利的等位基因型对个体留种，群体继代选育后降低种群的糖原酵解潜能或剩余糖原含量、提高肌内脂肪含量和终pH值、减少滴水损失，以此改善肉质。

实施例1：突变位点g.17082117A>C对苏太猪群体及F₂资源群体猪种肉质性状的影响分析

利用中国培育猪种——苏太猪群体以及白色杜洛克猪×二花脸猪F₂资源群体为实验动物。408头苏太猪和785头F₂资源群体饲养到240日龄，送到江西国鸿公司屠宰场定点屠宰，分别测定每个个体的肉质性状。采用PCR产物酶切对这435头苏太猪和785头F₂资源个体开展g.17082117A>C位点的基因型判定。然后利用GenABEL软件进行基因型对表型的影响效应。结果表明在F₂资源群体中，g.17082117A>C位点与GP表型呈极显著相关性（P<1.0×10-10，见表6）：AA基因型个体比CC基因型个体平均GP值高56.20μmol/g，平均剩余糖含量高25.76μmol/g；同样，在苏太猪中，AA基因型个体比CC基因型个体平均剩余糖原含量高32.86μmol/g。这说明该位点的效应与QTL导致糖原贮积量升高的效应相符。

另外，由于已知GP与众多肉质指标相关，故申请人进一步分析了g.17082117A>C位点对苏太猪的其它肉质指标的影响。比较高GP的突变型个体（QQ，即AA）和正常GP的野生型个体（qq，即CC），发现前者较后者的背最长肌的滴水损失升高了近45%（P=4.83×10-3）、终pH下降了0.12（P=1.14×10-5）、肌内脂肪含量降低了0.56%（P=9.65×10-10）、大理石纹评分减少0.43（P=4.72×10-9），红度参数Minolta a略微变深0.44（P=7.07×10-2）；相似的结果也见于半膜肌中（见表6）。因此，g.17082117A>C的A（即Q）等位基因对滴水损失、pH、肌内脂肪含量和大理石纹等多个肉质指标有显著负面影响。

表6g.17082117A>C突变位点对肉质性状的影响效应。

注：表型数据用平均数±标准差表示。同一行中上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。Q、q分别表示g.17082117A>C的A和C等位基因。肌糖原酵解潜能和剩余糖含量的单位均为umol/g。

实施例2：突变位点g.17082117A>C对杜长大商业猪种肉质性状的影响分析

利用杜长大三元杂交商业群体为实验动物。140头杜长大商业猪饲养到240日龄，送到江西国鸿公司屠宰场定点屠宰，分别测定每个个体的肉质性状。采用PCR产物酶切对这140头杜长大商业猪个体开展g.17082117A>C位点的基因型判定。然后利用GenABEL软件进行基因型对45min剩余糖原含量、pH36h、36h滴水损失的影响效应。结果表明在杜长大商业猪中，g.17082117A>C位点与45min剩余糖原含量、pH36h、36h滴水损失表型呈显著相关性（P<0.05，见表7）：AA基因型个体比CC基因型个体平均剩余糖原含量值高9.8μmol/g，这说明该位点的效应与QTL导致糖原贮积量升高的效应相符。另外，通过对该位点影响36h滴水损失的表型效应分析，发现其与pH36h、36h滴水损失表型均达到了显著水平。

表7g.17082117A>C突变位点对杜长大商业猪肉质性状的影响效应。

实施例3：连锁不平衡分析

申请人利用R语言中的LDheatmap软件包计算苏太猪群体中不同标记之间的连锁不平衡程度（r²）。以r²≥0.8为阈值，获得PHKG1的突变位点g.17082117A>C周边的单倍型框（见图11），这表明单倍型框内的所有分子标记都与g.17082117A>C位点的连锁程度r²达到0.8以上。同时，GWAS分析证实该单倍型框内的所有分子标记均与糖原酵解潜能和肌糖原含量达到基因组显著水平以上的相关，而且它们与表型相关程度的高低取决于它们与基因因果突变位点g.17082117A>C紧密连锁的程度。例如，图11显示SNPALGA0123314与g.17082117A>C位点连锁程度极高（r²=0.97），这就解释了为何ALGA0123314是之前GWAS分析鉴别到的最强关联位点。由此可知，与PHKG1的突变位点g.17082117A>C连锁程度r²≥0.8的分子标记也可以作为有效的肉质育种分子标记。

与主效编码基因PHKG1的因果突变位点g.17082117A>C紧密连锁程度r²≥0.8（即分子标记在群体遗传学上趋于共分离的状态）的分子标记，例如图11中的ALGA0123314、16936505、17031073、17062301、17078916、17091063、ASGA0082344、17112826、17218091和17231433均与糖原酵解潜能、肌糖原含量、pH值、滴水损失等肉质性状显著关联，所以PHKG1及其凡是与PHKG1因果突变g.17082117A>C位点紧密连锁r²≥0.8的分子标记都可作为种猪肉质性状遗传改良的分子标记，均应在本专利保护的范围之内。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种位于猪3号染色体上的PHKG1基因，其特征在于，核苷酸序列为下述序列a)～c)之一：

a)如SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

b)SEQ ID NO:4所示的cDNA序列；

c)能与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4序列互补的核苷酸序列。

2.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

3.一种猪的分子育种方法，其特征在于：

使用序列表中SEQ ID NO:1或权利要求1中所述的SEQ ID NO:2核苷酸序列，对待测的猪基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测；确定自序列表中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的5’端第8118位碱基为C还是为A；其纯合体的基因型为CC或AA，其杂合体基因型为CA；CC基因型相应的猪肉质性状优于CA基因型和AA基因型相应的猪肉质性状；

或者是使用序列表中SEQ ID NO:3或权利要求1中所述的SEQ ID NO:4核苷酸序列，对待测猪的RNA进行RT-PCR扩增，然后对扩增产物进行单核苷酸多态性检测；确定自序列表中SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的5’端第1075-1106位碱基为缺失还是不缺失；其纯合体的基因型为in/in或del/del，其杂合体基因型为in/del；in/in基因型相应的猪肉质性状优于in/del基因型和del/del基因型相应的猪肉质性状。

4.一种猪遗传改良的方法，其特征在于，检测猪3号染色体上的PHKG1基因中SEQ IDNO:1序列5’端第8118位单核苷酸是C还是A，保留CC基因型个体，淘汰AA基因型和AC基因型个体。

5.一种筛选优良肉质性状的猪品种的方法，其特征在于，检测猪3号染色体上的PHKG1基因中SEQ ID NO:1序列5’端第8118位单核苷酸是C还是A，淘汰A保留C；或者检测SEQID NO:3序列的5’端第1075-1106位这32个碱基是否缺失，淘汰缺失的保留未缺失的。

6.一种如权利要求1所述的基因或权利要求2所述的蛋白在种猪肉质性状遗传改良中的应用，其特征在于，所述种猪肉质性状遗传改良是指相应的猪肉的糖原酵解潜能、肌糖原含量和滴水损失中的一或多项显著降低，或是指相应的猪肉的pH值、猪肌内脂肪含量和大理石纹评分中的一或多项显著地提高。