CN106967832B - 鸡卷羽性状主效基因的区间定位方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡卷羽性状主效基因的区间定位方法及应用，包括如下步骤：S1.以纯系的卷羽鸡和片羽鸡为亲本，正反交得F1代；F1代间避免全同胞和半同胞的交配方式得到F2代资源群体；S2.对F2代资源群体不用羽型的数量检验分析，得到卷羽遗传特性；S3.根据资源群体特点选取测序样本，使用简化基因组测序技术，将获得的序列比对到鸡基因组上，得到高质量SNPs；S4.将SNPs结合样本个体的羽毛性状表型和遗传关系进行关联分析，得到卷羽性状目标染色体区间。本发明针对卷羽资源群体特点提供一种经济、有效的卷羽性状主效基因的区间定位方法，为揭示禽类卷羽性状的基因定位和分子机制，培育卷羽鸡新品种提供了理论依据。

Description

鸡卷羽性状主效基因的区间定位方法及应用
技术领域
本发明属于动物遗传育种技术领域。更具体地，涉及一种鸡卷羽性状主效基因的区间位点方法及应用。
背景技术
卷羽鸡，又称麒麟鸡、翻毛鸡，是产于粤西一带的特色鸡种，据宋代学者周去非所著《岭外代答》一书记载，至今已有840多年历史。该鸡种部分皮肤裸露，散热性能良好，是一个适合热带高温环境饲养的特色肉鸡品种。羽毛作为禽类一个重要的外貌特征，其独特的卷羽性状与片羽（正常羽）具有显著差异，因此有必要对卷羽性状进行基因定位及其分子机制研究。
国外学者认为，对卷羽性状是α-Keratin（KRT75）基因的保守区域在DNA序列的缺失导致羽毛的羽轴不能够形成，本发明人课题组通过克隆卷羽麒麟鸡KRT75基因序列与PCR扩增直接测序法测序KRT75缺失处外显子5和6区间都发现不存在缺失，说明麒麟鸡的卷羽性状可能与KRT75基因的变异无关，因此有必要对卷羽性状主效基因进行定位研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种鸡卷羽性状主效基因的区间位点方法及应用。
本发明的目的是提供一种决定麒麟鸡卷羽性状的基因位点及其应用。
本发明另一目的是提供鸡卷羽性状主效基因的区间位点方法及应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种决定麒麟鸡卷羽性状的基因位点，所述卷羽性状主效基因位于chr33:1.19～1.52Mb区间。
优选地，所述卷羽性状主效基因位于chr33:1.19～1.39Mb区间。
更优选地，所述卷羽性状主效基因位于chr:33:1295046～1295060区间。
卷羽是家禽羽型中重要的一种类型，有利于鸡体表的散热，适合热带或我国南方地区饲养，对于抗热应激鸡种的培育有着重要的作用，可利用卷羽性状主效基因通过基因工程技术培育卷羽鸡新品种。因此，上述基因位点在禽类遗传育种中的应用亦在本发明保护范围内。
优选地，所述应用为在培育卷羽鸡新品种中的应用。
一种鸡卷羽主效基因的区间定位方法，包括如下步骤：
S1.以纯系的卷羽鸡和片羽鸡为亲本，正反交得F1代；F1代间避免全同胞和半同胞的交配方式得到F2代资源群体；
S2.对F2代资源群体不用羽型的数量检验分析，得到卷羽遗传特性；
S3.根据资源群体特点选取测序样本，使用简化基因组测序技术，将获得的序列比对到鸡基因组上，得到高质量的SNPs；
S4.将SNPs结合样本个体的羽毛性状表型和遗传关系进行关联分析，得到卷羽性状目标染色体区间。
优选地，步骤S1所述平羽鸡为怀乡鸡。
优选地，步骤S1所述亲本中公母比例为1：8～10。
优选地，步骤S2所述遗传特性为统计资源群体不同羽型数量，卡方适合性检验F2代不同羽型的数量比例。
优选地，步骤S3简化基因组测序技术获得的序列数据需经过过滤和质控。
优选地，步骤S4中所述关联分析是通过病例对照研究（case-control_study）进行的。
具体地，步骤S4所述关联分析的标准为：分析比较鸡F2代中卷羽和片羽样本中检测到的SNPs频率差异，寻找关联分析中极显著和显著的SNPs，达到全基因组显著水平的SNPs所在染色体区间即为卷羽性状目标染色体区间。
具体地，作为一种可参考的分析案例，当所述分析对象为实施例所述的麒麟鸡和怀乡鸡时，步骤S4所述关联分析的标准为：
分析在卷羽和片羽样本中检测到SNP频率的差异结果和曼哈顿图；当P值小于6.193E-18的SNP位点达到全基因组显著水平，小于3.75E-21的SNP位点达到全基因组极显著水平；33个SNP达到全基因组显著水平，卷羽性状目标染色体区间定位于chr33:1.19～1.52Mb区间
目前已存在的参照基因组序列把鸡作为一种重要的模式生物去理解基因组进化、群体遗传、表型特征的遗传基础，由于鸟纲之间联系紧密，对鸡表型变化的分子和遗传基础的阐明对应用于其他野生鸟类有着重要意义，因而，对鸡的遗传和基因组研究可以为鸟类的发展和进化提供信息。本发明为揭示禽类卷羽性状的基因定位和分子机制提供了参考，为禽类卷羽新品种的培育提供了基础。
因此上述卷羽性状主效基因区间定位的方法在禽类遗传育种中的应用也在本发明保护范围内。
优选地，所述应用为在培育卷羽鸡新品种中应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明有效地利用了小样本资源群体样本进行GBS测序，大大节省了成本，同时达到了预期实验目的，验证了卷羽性状遗传特性，定位了卷羽性状主效基因染色体区间。
（2）本发明为培育卷羽鸡特色新品种提供了理论依据，对进一步研究卷羽形成的分子机制具有重要意义，同时为国内卷羽鸡卷羽性状主效基因的定位奠定了基础。
附图说明
图1为F2代资源群里构建图。
图2为本发明GBS测序技术流程图。
图3为本发明卷羽和片羽样本检测到SNP频率的差异结果和曼哈顿图。
图4为本发明卷羽性状主效基因的缺失位点图；K为麒麟鸡，H为怀乡鸡，G为贵妃鸡，B2-K为前期研究测序卷羽鸡基因缺失位点所用的混合样本。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 麒麟鸡卷羽性状的主效基因-候选角蛋白基因的区间定位
1、分别选用纯系的麒麟鸡和怀乡鸡公鸡各2只，母鸡各16只，麒麟鸡(K)♂×怀乡鸡(H)♀（KH)为正交组，怀乡鸡♂×麒麟鸡♀（HK）为反交组，按照1：8公母交配比例，得到F1代，F1代间正交组与正交组间，反交组与反交组间避免全同胞和半同胞的交配方式建立F2代资源群体，公母按照1：8～10交配比例，得到F2代（其构建图如图1所示）。
2、F1代由2个正交组家系和2个反交组家系组成，正交群体127只，反交群体139只，均为半卷羽性状，无公母差异和外显率不同，F2代卷羽、半卷羽和片羽鸡数量为：113、241和132，此F2代三种鸡比例经X2检验符合孟德尔单基因分离遗传定律，验证了卷羽性状基因F是一个质量性状基因。
3、从本资源群体中选取F2代数量多的家系，对选取的家系采集全部F2代卷羽和片羽鸡，及其父母本F1代血液，选取家系数量为F1代：父本5只、母本13只，F2代：全卷28只，片羽29只，共计75个样进行GBS测序，其测序流程如图2所示。
将基于75个样品GBS简化基因组建库的Illumina Hiseq测序平台双末端测序，共获得约1463.8M Reads 原始序列数据，Q20（原始数据的碱基识别准确率在99%以上的碱基所占百分比）和Q30（原始数据的碱基识别准确率在99.9%以上的碱基所占百分比）平均分别达到98.05%和95.14%，个别样品可能由于样本DNA差异Reads数较少，接着数据过滤质控可消除此不准确性，过滤后高质量序列平均Reads为18,518,1966，高质量reads占下机reads的百分比达到94.8%，此下机测序数据质量还是较高的，没有出现特别大的差异性。各样本高质量的Reads与参考基因组（Gallus_gallus-5.0）相比，Mapped比例基本在95%以上，进一步验证了质控后测序数据的可用性，采用stacks软件包中的pstacks，对比对至参考基因组同一位置的reads进行聚类，聚类后，同一个stack代表一个酶切位点，称之为一个loci或标签，标签的平均测序深度为25，每个样本至少被1条reads覆盖的碱基数量占基因组总碱基数量的比例至少为4.5%，保证了SNP calling的准确性和可靠性。
4、在卷羽和片羽样本中检测到SNP频率的差异结果和曼哈顿图，其结果如图3所示：P值小于6.193E-18的SNP位点达到全基因组显著水平，小于3.75E-21的SNP位点达到全基因组极显著水平，33个SNP达到全基因组显著水平，卷羽性状目标染色体区间定位于chr33:1.19～1.52Mb区间，此区间包括了14个角蛋白基因，这14个角蛋白基因将此区间缩减到chr33:1.19～1.39Mb范围。
5、验证GBS测序结果
以ensemble数据库中收录的KRT75、KRT75L2、KRT75L4、KRT6A、KRT5基因序列设计引物，一代直接测序法测序。
一代测序结果验证了GBS测序结果的可靠性，15个SNPs位点与简化基因组测序获得的SNP一致。结果如图4所示，KRT75L4基因有15bp(chr:33:1295046-1295060)缺失，且仅在卷羽中检测到有15bp缺失，在片羽怀乡鸡和贵妃鸡中均未出现缺失。此15bp缺失位于编码区，编码了缬氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸5个氨基酸，认为可能与卷羽形成有关，成为最可能候选因素。
本测序技术的开发，所建资源群体成为具有良好的研究材料。
本测序技术的开发，为简化基因组测序技术在家禽基因组测序上的首次应用，为以后其他性状的定位具有重要参考价值。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种决定麒麟鸡卷羽性状的基因位点在鸡卷羽性状遗传育种中的应用，其特征在于，所述决定麒麟鸡卷羽性状的基因位点位于chr:33:1295046～1295060区间，所述区间的核苷酸序列为CGTCCTGCCGGCATC。
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