CN108018359B - 一种用于鉴定樱桃谷鸭的分子标记及其应用 - Google Patents
一种用于鉴定樱桃谷鸭的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于鉴定樱桃谷鸭的分子标记及其应用，该分子标记包括4个SNP分子标记中的任一个，用于检测这些SNP分子标记的特异性引物分别如SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8所示。利用上述4对引物中的任一对引物均能实现将樱桃谷鸭从其他鸭中准确、迅速地鉴别出来。用本发明提供的分子标记鉴定樱桃谷鸭，操作简单，特异性高、重复性好，极大地促进了樱桃谷鸭品种资源的正确保存和合理利用，同时为保障消费者权益提供了巨大的便利，在樱桃谷鸭的育种领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记、以及鉴定樱桃谷鸭的方法。
背景技术
SNP是single nucleotide polymorphism的缩写，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP包括单个碱基的转换或颠换，也包括插入或缺失，在整个基因组上具有高密度性，因此不同鸭品种基因组的SNP标记可以在育种过程中进行相关品种的精准鉴定。在品种鉴定或是种质资源改良过程中，根据鸭品种间SNP进行鉴别，这样就可以改变传统鉴定或育种的盲目性，而且极大的减小了群体大小，节省成本。
北京鸭和樱桃谷鸭是世界著名肉鸭品种，二两者外形和遗传上都有巨大的相似性，但在生产性能和口感上有存在明显着巨大的区别。
樱桃谷鸭由英国林肯郡樱桃谷鸭公司引入我国北京鸭和埃利斯伯里鸭杂交培育而来。樱桃谷鸭白羽系体型外貌酷似北京鸭，体羽洁白，头大额宽，鼻梁较高，嚎、胫、蹼呈橙黄色或橘红色，颈平而短粗，翎膀强健紧贴躯干，脚短粗。
与北京鸭相比，樱桃谷鸭肉质无论是口感还是风味，都稍显不足，但因为樱桃谷鸭容易饲养且和北京鸭较为相似，所以普遍存在用樱桃谷鸭冒充北京鸭的现象。而普通消费者仅从外观上难以区分，或者即使知道买到了樱桃谷鸭冒充北京鸭的商品，也存在鉴定难，维权难的问题。因此寻找樱桃谷鸭特异性SNP位点，并作为樱桃谷鸭特异性分子标记位点并为商品鸭提供屠体标识，从根本上保护育种单位的知识产权和消费者利益，这具有非常重大的经济意义和社会意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记。
本发明的另一个目的是提供该SNP分子标记在鉴定樱桃谷鸭中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明利用重测序手段对不同鸭种(樱桃谷鸭、北京鸭、枫叶鸭、金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、高邮鸭)进行测序，通过对不同鸭种间的DNA序列进行筛查比对，找到含樱桃谷鸭特异性SNP位点的序列，并对这段序列设计引物进行PCR扩增和测序验证，通过分子生物学技术手段，找到一种分子标记，可以迅速准确将樱桃谷鸭从其他品种鸭中鉴定出来。
具体地，本发明测定SNP位点的方法，按照以下步骤进行：
1)样品采集：樱桃谷鸭、北京鸭、枫叶鸭、金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、高邮鸭共7个品种，不分雌雄，每个鸭品种8个个体。
2)测序：利用苯酚氯仿法提取出鸭子DNA，对鸭子进行重测序，平均每个个体的测序深度为6.45X。
3)SNP位点的检测：对原始reads进行质量控制，然后将质控后reads组装到鸭参考基因组Anas platyrhynchos genome(BGI_duck_1.0)，并与参考基因组比对得到SNP。
4)特异性SNP的寻找：利用perl script程序对这些SNP位点进行比对，找到特异性存在于樱桃谷鸭中的SNP位点，并对这些SNP位点进行质控，最终筛选得到满足这些条件的特异性SNP位点。
进一步地，本发明提供了一种用于鉴定樱桃谷鸭的分子标记，其为以下任一个SNP分子标记：
(1)位于基因组版本BGI_duck_1.0:KB743619.1:351724，多态性为G/A；
(2)位于基因组版本BGI_duck_1.0:KB743619.1:351767，多态性为C/T；
(3)位于基因组版本BGI_duck_1.0:KB743777.1:228414，多态性为C/T；
(4)位于基因组版本BGI_duck_1.0:KB745605.1:7702，多态性为G/A。
上述第(1)-(4)的分子标记可分别通过以下引物对扩增得到：
(1)SEQ ID NO.1-2；(2)SEQ ID NO.3-4；(3)SEQ ID NO.5-6；
(4)SEQ ID NO.7-8。
进一步地，本发明提供了用于鉴定樱桃谷鸭的引物对，其为以下任一对或多对引物：
(1)SEQ ID NO.1-2；(2)SEQ ID NO.3-4；(3)SEQ ID NO.5-6；
(4)SEQ ID NO.7-8。
本发明提供了上述分子标记或引物对在鸭育种中的应用。
本发明提供了上述分子标记或引物对在鉴定樱桃谷鸭品种中的应用。
本发明提供一种鉴定樱桃谷鸭的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组DNA，以其为模板，利用上述(1)-(4)任一对或多对引物进行PCR；
(2)对扩增产物进行测序，检测相应SNP位点的基因型。
若采用第(1)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743619.1:351724若为A，待测鸭为樱桃谷鸭，若为G待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(2)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743619.1:351767若为T，待测鸭为樱桃谷鸭，若为C，则待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(3)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743777.1:228414若为T，待测鸭为樱桃谷鸭，若为C，则待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(4)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB745605.1:7702若为A，待测鸭为樱桃谷鸭，若为G，则待测鸭不是樱桃谷鸭。
本发明提供的鉴定樱桃谷鸭的方法中，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCRMix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
本发明还提供了含有上述(1)-(4)任一对或多对引物对的用于鉴定樱桃谷鸭品种的试剂盒。
本发明还提供了上述SNP分子标记或引物对或试剂盒在鸭种质资源改良中的应用。
本发明还提供了上述SNP分子标记或引物对或试剂盒在鸭品种鉴定中的应用。优选地，用于鉴定樱桃谷鸭。
本发明的发现的用于鉴定樱桃谷鸭的SNP标记及其应用具有如下优点：(1)本发明所选择的SNP位点是独特的，具有很高的广义遗传力，能比较准确的区分樱桃谷鸭与其他品种鸭。(2)本发明的SNP分子标记可进行准确地鉴定，显著促进樱桃谷鸭品种鉴定和培育。(3)检测方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。这些SNP位点既可以为樱桃谷鸭品种资源的正确保存和合理利用增添新的科学依据，也可以作为樱桃谷鸭特异性分子标记位点并为商品鸭提供屠体标识，从根本上保护育种单位的知识产权和消费者利益。
附图说明
图1为实施例2中利用SNP分子标记检测7种鸭的测序结果图。
图2为实施例3中利用SNP分子标记检测7种鸭的测序结果图。
图3为实施例4中利用SNP分子标记检测7种鸭的测序结果图。
图4为实施例5中利用SNP分子标记检测7种鸭的测序结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1鉴定樱桃谷鸭SNP分子标记的开发
选取樱桃谷鸭、北京鸭、枫叶鸭、金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、高邮鸭共7个鸭种作为实验材料来源，不分雌雄，每个鸭品种8个个体。
1、全基因组重测序：
对试验鸭只进行翅下静脉采血，并利用苯酚氯仿法提取DNA，对每个DNA样品都进行Illumina Hiseq 2500测序，平均每个个体的测序深度为6.45X。测序一共产生376.06Gb的双端长度为100bp的reads。
2、Reads组装和变异寻找：
使用NGS QC Toolkit(默认参数)过滤低深度reads以避免在文库构建和测序过程中的人为误差，将过滤后的reads利用BWA-MEM(v0.7.12)软件对比到鸭参考基因组Anasplatyrhynchos genome(BGI_duck_1.0)，并将比对后的reads按照scaffold上的位置信息进行排序。对每个个体中重复的reads利用Picard软件进行去除。随后利用GATK软件中UnifiedGenotyper方法寻找SNP，要求reads和bases的最低质量得分为20。
GATK质控条件为：1.QUAL>30.0；2.QD>5.0；3.FS<60.0；4.MQ>40.0；5.MQRankSum>-12.5；6.ReadPosRankSum>-8.0，如果一个10bp的window中有超过3个SNP，则认为这三个SNP为假阳性并移除。为了保证得到的SNP的准确性，SNP所支持碱基深度必须大于测序深度的一半。
3、特异性SNP的筛选：
得到了位于不同鸭品种的SNP位点，利用perl script程序对这些SNP位点进行对比。找到特异性存在于樱桃谷鸭的SNP位点，并对这些SNP位点进行质控，并最终筛选得到满足条件的樱桃谷鸭特异性SNP位点，SNP位点信息见表1。
表1
| 编号 | 位置 | 野生型 | 突变型 |
| KB743619.1 | 351724 | G | A |
| KB743619.1 | 351767 | C | T |
| KB743777.1 | 228414 | C | T |
| KB745605.1 | 7702 | G | A |
4、引物设计：
利用鸭基因组作为模板，设计并合成引物，引物序列为：
表2
实施例2用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记的应用(1)
1、提取待测鸭的基因组DNA，每个品种鸭提取8只鸭的DNA混合后，混样作为每个品种鸭的待测基因组DNA。
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
针对实施例1中筛选到的SNP位点(KB743619.1:351724)，根据表2中第1对引物，以基因组DNA为模板，进行PCR，PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，对其进行测序，发现扩增片段中含有如SEQ IDNO.9所示的序列中，在该序列的第11位碱基处，樱桃谷鸭的碱基为A，参考基因组以及其他品种鸭的该位置碱基为G。测序结果见表3和图1。显示SNP分子标记在所有的测序样品中峰图清晰，无杂带。说明本发明所提供的SNP在樱桃谷鸭中存在较高的特异性。进一步说明该SNP分子标记可以作为鉴定樱桃谷鸭的科学依据。
表3
注：KB743619.1:351724各个样品测序结果与参考基因组对比结果，结果与预期一致，樱桃谷鸭KB743619.1:351724为A，参考基因组与其他鸭子KB743619.1:351724为G。
实施例3用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记的应用(2)
1、提取待测鸭的基因组DNA，每个品种鸭提取8只鸭的DNA混合后，混样作为每个品种鸭的待测基因组DNA。
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
针对实施例1中筛选到的SNP位点(KB743619.1:351767)，根据表2中第2对引物，以基因组DNA为模板，进行PCR，PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，对其进行测序，发现扩增片段中含有如SEQ IDNO.10所示的序列中，在该序列的第11位碱基处，樱桃谷鸭的碱基为T，参考基因组以及其他品种鸭的该位置碱基为C。测序结果见表4和图2。显示SNP分子标记在所有的测序样品中峰图清晰，无杂带。说明本发明所提供的SNP在樱桃谷鸭中存在较高的特异性。进一步说明该SNP分子标记可以作为鉴定樱桃谷鸭的科学依据。
表4
注：KB743619.1:351767各个样品测序结果与参考基因组对比结果，结果与预期一致，樱桃谷鸭KB743619.1:351767为T，参考基因组与其他鸭子KB743619.1:351767为C。
实施例4用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记的应用(3)
1、提取待测鸭的基因组DNA，每品种鸭提取8只鸭的DNA混合后，混样作为每个品种鸭的待测基因组DNA。
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
针对实施例1中筛选到的SNP位点(KB743777.1:228414)，根据表2中第3对引物，以基因组DNA为模板，进行PCR，PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，对其进行测序，发现扩增片段中含有如SEQ IDNO.11所示的序列中，在该序列的第11位碱基处，樱桃谷鸭的碱基为T，参考基因组以及其他品种鸭的该位置碱基为C。测序结果见表5和图3。显示SNP分子标记在所有的测序样品中峰图清晰，无杂带。说明本发明所提供的SNP在樱桃谷鸭中存在较高的特异性。进一步说明该SNP分子标记可以作为鉴定樱桃谷鸭的科学依据。
表5
注：KB743777.1:228414各个样品测序结果与参考基因组对比结果，结果与预期一致，樱桃谷鸭KB743777.1:228414为T，参考基因组与其他鸭子KB743777.1:228414为C
实施例5用于鉴定樱桃谷鸭的SNP分子标记的应用(4)
1、提取待测鸭的基因组DNA，每品种鸭提取8只鸭的DNA混合后，混样作为每个品种鸭的待测基因组DNA。
2、扩增含SNP位点的核苷酸片段
针对实施例1中筛选到的SNP位点(KB745605.1:7702)，根据表2中第4对引物，以基因组DNA为模板，进行PCR，PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×Taq PCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，对其进行测序，发现扩增片段中含有如SEQ IDNO.12所示的序列中，在该序列的第11位碱基处，樱桃谷鸭的碱基为A，参考基因组以及其他品种鸭的该位置碱基为G。测序结果见表6和图4。显示SNP分子标记在所有的测序样品中峰图清晰，无杂带。说明本发明所提供的SNP在樱桃谷鸭中存在较高的特异性。进一步说明该SNP分子标记可以作为鉴定樱桃谷鸭的科学依据。
表6
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种用于鉴定樱桃谷鸭的分子标记及其应用
<130> KHP171117905.2
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctctgcgct gttacactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgaagcttga gacagcagca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
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<210> 4
<211> 20
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<210> 5
<211> 21
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<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
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<400> 6
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<211> 20
<212> DNA
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gtgagctgaa tggcaacgag 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 8
ggcaaaaccc aacagaggtg 20
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<212> DNA
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<400> 9
acctaaaggc gaaggacggg c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
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<400> 10
agagctggct catctccctc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcccctccca cgtgttctcc g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttctaacagt ggtgcctccg g 21
Claims (8)
1.用于鉴定樱桃谷鸭的引物对，其特征在于，其为以下任一对或多对引物：
(1)SEQ ID NO.1-2；
(2)SEQ ID NO.3-4；
(3)SEQ ID NO.5-6；
(4)SEQ ID NO.7-8。
2.权利要求1所述的引物对在鸭育种中的应用。
3.权利要求1所述的引物对在鉴定樱桃谷鸭品种中的应用。
4.一种鉴定樱桃谷鸭的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸭基因组DNA，以其为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR；
(2)对扩增产物进行测序，检测相应SNP位点的基因型。
5.如权利要求4所示的方法，其特征在于，若采用第(1)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743619.1:351724若为A，待测鸭为樱桃谷鸭，若为G待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(2)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743619.1:351767若为T，待测鸭为樱桃谷鸭，若为C，则待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(3)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB743777.1:228414若为T，待测鸭为樱桃谷鸭，若为C，则待测鸭不是樱桃谷鸭；
若采用第(4)对引物，则对扩增产物进行测序时，检测扩增产物中BGI_duck_1.0:KB745605.1:7702若为A，待测鸭为樱桃谷鸭，若为G，则待测鸭不是樱桃谷鸭。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增反应使用的扩增体系，当体系25ul时配制如下：上下游引物各0.5ul，浓度10pmol/L；ddH2O 10.5ul；2×TaqPCR Mix 12.5ul；DNA模板1ul，浓度100ng/ul；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃30s，60℃40s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
7.含有权利要求1所述引物对的鉴定樱桃谷鸭品种的试剂盒。
8.权利要求1所述的引物对或权利要求7所述试剂盒在鸭种质资源改良中的应用。
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2017
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