CN115820872B - 一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记及其应用，属于分子标记领域。上述分子标记如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列存在如下SNP突变：第984位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1033位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1112位存在SNP突变，基因型为AA、AC、AG、AT、CC、CG、CT、GT和TT；以及第1196位存在T>C突变，基因型为TT、TC和CC。本发明通过实验验证上述分子标记可以准确鉴定不同周龄的麻黄鸡繁殖性状，为分子标记辅助选择育种提供了新的分子标记。

Description

一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，特别是涉及一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

我国地方家禽遗传资源丰富，许多地方品种被用作优质鸡生产的素材，但是多数地方品种生产性能相对较低，需要进行选育提高。300日龄产蛋量、G1母亲390日龄产蛋量、G1母亲300日龄产蛋量等性状是鉴定麻黄鸡的繁殖性能的关键指标。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指基因组DNA序列由于插入、缺失、颠换和转换等单个碱基变化而引起的基因组DNA多态性，具有稳定遗传，易于检测等特性。SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection,MAS)，提高选种准确性和选育效果。

ALKBH5(AlkB Homolog 5,RNA去甲基化酶)是一个蛋白质编码基因。与ALKBH5相关的疾病包括骨膜软骨肉瘤和Smith-Magenis综合征。其相关途径有同源定向修复和DNA损伤逆转。与该基因相关的基因本体(Gene Ontology,GO)注释包括RNA结合和氧化性RNA去甲基化酶活性。但是，目前还没有ALKBH5基因与麻黄鸡繁殖性能相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，筛选出ALKBH5基因外显子区的多个SNP位点，并将其与麻黄鸡的繁殖性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记，所述分子标记如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列存在如下SNP突变：

第984位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1033位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1112位存在SNP突变，基因型为AA、AC、AG、AT、CC、CG、CT、GT和TT；以及第1196位存在T>C突变，基因型为TT、TC和CC。

本发明还提供检测所述的分子标记的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO：2-3所示。

本发明还提供检测所述的分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

本发明利用所述的分子标记鉴别麻黄鸡繁殖性状的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测麻黄鸡基因组DNA，利用引物对扩增所述分子标记或者包含所述分子标记的基因片段，获得扩增产物；所述引物对的序列如SEQ ID NO：2-3所示。

(2)对所述扩增产物测序，分析所述分子标记的基因型；

(3)根据基因型鉴别所述黄麻鸡繁殖性状。

优选的是，扩增反应体系为：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL和下游引物2μL。

优选的是，扩增反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，35个循环；72℃最终延伸3min，4℃保存。

优选的是，所述鉴别黄麻鸡繁殖性状的方法为：若第984位为AA基因型，则麻黄鸡G1母亲390日龄产蛋量和G1母亲300日龄产蛋量高；若第1033位为AA基因型，则麻黄鸡300日龄产蛋量、G1母亲390日龄产蛋量和G1母亲300日龄产蛋量高；若第1112位为AG基因型，则麻黄鸡300日龄产蛋量、G1母亲390日龄产蛋量和G1母亲300日龄产蛋量高；若第1196位为TT基因型，则麻黄鸡G1母亲390日龄产蛋量和G1母亲300日龄产蛋量高。

本发明还提供所述的分子标记，或所述的引物对，或所述试剂盒，或所述的方法在麻黄鸡育种中的应用。

优选的是，育种性状包括麻黄鸡繁殖性状。

优选的是，所述繁殖性状包括300日龄产蛋量、G1母亲390日龄产蛋量和G1母亲300日龄产蛋量。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过分析ALKBH5基因，发现该基因外显子区有多个与麻黄鸡繁殖性能显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记，并且通过试验验证，该分子标记g.984A>G位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)；g.1033A>G位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)；g.1112位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，与G1母亲390日龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)；g.1196T>C位点与G1母亲390日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，与G1母亲300日龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。可见，本申请提供的分子标记可以准确的鉴定麻黄鸡不同周龄的繁殖性状，以为麻黄鸡的选育提供科学数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.984A＞G图谱；

图2为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.1033A＞G图谱；

图3为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.1185C＞T图谱；

图4为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.1334T＞C图谱；

图5为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.1196T＞C图谱；

图6为ALKBH5基因3’UTR区SNP位点g.1112图谱。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记筛选及应用

1、实验材料

选取372只60周龄的雌性麻黄鸡(开平市旭峰农牧有限公司)。采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作DNA提取样本。记录选择群体的家系信息和开产日龄、每日产蛋量、总产蛋数以及产蛋合格数等繁殖性状。

2、与麻黄鸡繁殖性状相关的分子标记筛选及分析

2.1引物设计

根据Ensemble公布的鸡(Chicken)ALKBH5基因的序列(ENSAPLG00000009051)，使用NCBI(National Center for Biotechnology Information Search database)的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在ALKBH5基因上的配对位置如SEQ ID NO：1所示。

表1 PCR扩增引物序列

2.2血样DNA提取

参照血样DNA提取试剂盒操作手册提取血样DNA。

2.3ALKBH5基因外显子序列的PCR扩增

以上述372只半同胞麻黄鸡的血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA 2μL、金牌Mix 26μL、上游引物2μL和下游引物2μL。

反应程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s(进行25个循环)，72℃最终延伸3min，4℃保存。PCR产物交由广州擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。

2.4SNPs确定与基因分型

利用Snapgene软件对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点。通过DNAstar 11软件的SeqMan工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

2.5基因型与繁殖性状关联分析

利用Haploview 4.2软件分析ALKBH5基因的多个SNP位点得到单倍型块内位点，再经PHASE 2.1软件分析单倍型块内位点在372个麻黄鸡个体中的分布，得到单倍型数据。

SNPs位点与基因型对应个体的繁殖性状数据，采用SAS 9.4GLM程序包进行关联分析。

3、结果与分析

3.1ALKBH5基因外显子序列PCR扩增及SNP筛选

选取372只麻黄鸡个体，以每个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到6个SNP位点，分别为：g.984A>G，g.1033A>G，g.1112，g.1185C>T，g.1196T>C和g.1334T>C，如图1-图6所示。

SEQ ID NO：1：

GCCACGGATTCTAGAAATGGATAAAGAGGAGAACAGGCGCTCAGTCCTCTTACCAAAACATAGGAGACGGAGCAACTTCAGCTCTGAGAACTATTGGCGAAGGTCTTACGAGTACACGGAGGACTGTGATGAGGAGGAGGAGGATGGCAGCCCAGCCAGGAAAGTTAAAATGAGGCGACACTGAGGAATGCACTTTCCAGGCTTGTGGAGCTGATGAGATTGGCCTCTAGTCTGTGAAAACTTTCTCCTCCCTCTGGCTATTTTCCATTTAGCTTCAGTTTTGGTTTTTCCTTTCAGGCTGAAGAGTAAACAGGAAGGATCTAGTGGTTTGTTTTTATGAATGGAGGAATGCTGAGACATATGTAAGGATGGAACATGTCCAGTACACACGGTGTCCTGAGTCATGGGTCAGATGGGCATCTCTACCATAGGAAGCAGATAACGTTATGCCAGGCTGTCTGTTGGGATTTCTTTGAGAACACCAAAAAGTTTAACTGTTTCATTGTGCAAGATTCAAGAATTGTATTTTGTTTTGTTGGTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTAACTTTCTTCTTTTCCAAATGTTCTAAATATGATGTTGTTAGACCCCAGGAGCTGAAATTCTCTGTGGTGGCCTCGTATTCCTTGCTTCACCAAAGGGCTCCTTGGTCTGCTTATACCTAGTTGTTGCTGGGTTGTGTTTTAAGGGTGTACCCTGCAGTAACTGGAAGTTTGAAGCTTTTCAGACTCCTTTTGCTGCATTGATTACAAAGGGTTTAGGACATTTGTGTTGCACTTTAGTACCAGTTTTAAATGCCATAGATTTCCTTTCCAGTCCCTTTTCCCAAGCCAGCTTGGGCTCACAGCTTTGTGTTCCTGTGCTGCCCTCTCCAAGAAGAATGTATTTAAGCTCTGGTTTCTCAGTGCTGTTCTGACCAGTCATCTGTTTTGGCTGAGGATGGAGCCATGGCTGGCTTCACTGATGTTGGTCCAGTGCTGACCTGAGGTCTGTATTGGAGCCTGGGAGCTGCAGAGCAAGTGACTGCATTGAGTACGTGCTGCTTTCCCGAGCTAGAGACAGCAGAGAGGAGTTGGGAGGGAGGCTGTGCTGTGGGGGGTGTTTGCCTTGGGACCCCCTGAGAAGATGTGGGATGCTGCTGGGTACAGAGGAGCTCTGTTTTGGCCCACAGGATGTTTGTCAGCTATCACTGCAGCAGTTGTCTGATGCCCTCTTGTTTCTGTGCATGTTCTGGGGTAGGGACTCTGGTTGCCCCAGGAAGTGCTGAGAGGCGTGAGGCGTTTCACCCTGTGGAGGTAACCTTAGAAGACTGCTTTCTTCCTCATCTTTTCCCACTGGTTTGTGTTTGCCCTGCCTGAAATCTGTGTTTTGCAGGTTTGGGGCCCAACACCATATTTAGAAGCCTACTTTTAAGAAACTTTCTCCAATTGATTCTTTGATCCCAAGTGTTGGCAGTTGTAAGGAGTAGTCTTATTTTAAAATTTTTACTGCTTTGTCCTTCCTCCAATTGTAGTTTTTCTTAGTGTTGTGTCCCCCACTCTTCATGATCTGCACGCTTGGTAATAAAAAGATGTAATATATTTTGAATCCCGTTTGCTGCTGTCTTGAGGAGCCACCGGTCAAAAAACGGGCGCTGTTCCTTAGTGATCAGGCTTGTTTGCTGACATCTGGGTCTCGTCGTCCTTTTCCTTCCCTGCTGACTTCTGCAGCTCCCACCATTCATCTGTCCTTGGGCTCACTGCTGAGGCTGGATCTAGCAGTCACATTAGTGTAAAGGAAATTACTGTCACCTTCAGCATGGCACTGAGCTGCAGGAGGTTTTGTAGGTGAGGCTCCTACTGCCTGTCTTTGATTGTCTTGATCTAATTGCTTTCCTGGTGAGAGCTCTCTTTGGCTCGGTGTGGAGCCTTGAGAGCAGCCTCATGGCCAGCCTTCGAAGGCACGTACCTGTCTTGTCTGCCCAGAGATCTGGAAGTTCGTGAATCTGGGACTTCTGAAAGGCCATTATCAGTCCACACTCAGCATTTGAAGCAGCATTCCTCCTGCTCCTAGCTTGCAGCAGAGAACCCAGGCCATCTCTTGGCTACAAACCCCGTTTTGGAAAGCTTGGCATTCCCCAGCAGCAAAACAGCATGCAGGGAGCAGCGATCTCTTCTCCTCCTTATGGCTGGTGTCTGTAAACATCTCTGGCAAGCTAGAAACCTGCTAGTGGGATGCCTGGGGTGGCTGTTCTTAATTCTGGATTTGCTGTGGACATGTCCCGTTCCCTCCAAGGGCATTAGGCTGTGCTGCTTTGTGCTGCTGGCAACGGCAGGGCAGAGCCACCTGTGCTCCCTTGCTGGAGGTCTCTGCTCTGCACAGCCTGCTCTCCCCCCCTTCCCAATTTTATGCCTACCTCTGCAATATGGATACTGTACTCTGGTGTCTCAGCTCACAGTGAAGACAACCTGCCTTCCCGGGGCCGCTCCCTGAAGCAGCAGGAGCACTGTGACTCTCATGGGACAAGATAATTTCCACGAAAGGCTGAACAAAGCACCCTGAGGTCTTACCTCCTAGCCTGGTACCGTCACCTCATCCCAGTCCTCGTGCAGTCTGTACGTGTGCAGGCATCCCGCTTGTCCCATTGGGTTTTGTATTCCTGCATGCCACCTCTGGGAACTCTGCCCTCCTTTTCCCCATCCCAGGTCTGTGCCGTGGGTCTGAGCTGGCAGCCATCGCTGGAGCTGCTCTCCTGCCGCCCTCTGCTTCGTTTTGCTTTTAGTTTTCAAGCTGACTGCTTGGGGCTTGACACCTTGGCAAGAGTGGGACACAACCGATCTGACCCGTAGGATCTCTTGGGCAAGAGTCCCCAGCGTGCAGGCAGGCCATCTCCCCCACTTGTACAGACATTTTATATACACACGGATGTATATGTGTAGATACATGGTTTTTTAACTCTTTTGCACTGAACAACATTGGGGTGAAACCTTGATTTGAAACAAGAAGACACATTTTTCACGTGGATCCAGATGTCTAGATCCCTTACTGTGACTTGTTTGTTAAATCTGTGGCTCAAAACACTGCTGATGCCCATACCTGTTCTCTGTCCTGGCTGTGTGAAGGCTTCCATCAGACCAGTGGTGTGAGTCTGGTGTGGAGATGGGCTTACGTGCAGGCCTGACCAAGTCTGCTTCTTTGTCTTCATGTAGTTCAGCAATGCAGTCCCAACTCCTCTCCATCCACCTGCAGCGTGCTGTCTGTGTAACCTGCTCACCCCTCCAGGGGCATAAGGCTGTGTACGATGTGATGACCCCACAAGCACTCAGACCCACAGCCCAGACCATGAGAACTGTCTTTCCTAAGGAAGGGGGAGGTAGATGGGAGTTGTCCCTGCTTTTCTGCAAAGGGAGGAATTTGGGTTTGCTGCCCTTACCTGCGTATTGAGAAGACTTGGCGGTCCAACTAAGGCTCTTGTGTTGGTTGTGTAGGCTTCACTTGTCCTCTGGAAGAGAACCTGGGGCTGTTTGCCAGCAGTGAGAGGTGAGCTGGCTCAGGGAGGGGCTGTCAGAGCCTGGTGGAGGCTGCCAGCTGTGATTTCCACCTCCCTGCAGCGTGCAGGCAGCGGGGAAGCCCCAGTTTCCACATCTAGCCCTGAACTCAGGGCTGGGACACCACCGGCCACTCATGCTGGCTTCAGAGATGTCTCAATCCAAACCCATGGCTAGGAATGGACTGGAGGGGGGCTCGGGGCACGGCCGTGGGGTCTGGCCCCCCATCCAGTGGCAAATTGTCTTTTGTCTGCCAATCGCCTTCCTTTTCCTGGCGAGGAGGAGAAATGCTGAGCCCAGAACTGTGTCTCTGCTCCTTCCTGCCCCCCCCCTGCCCACACTTACGAGTTCTGGCTGACTTTAATTTTGTTTTATAAGATTCTAATTTTTTTGGTTACAAATAATTAAAAAAAAAAATTAAAAAAAAAAAAAGAAAGTGGCAATATTTTTTTCTGTAAGCTTTTCCTAGGAAAAAGCGTGGTTTGTAACAAAGTTGTACAGTTCTGAAGTTTGAGATACGAGAAGTACTGTGTGAAACGCTGTAAATGGGGCAGAGATTATTTTATGTACAGTCTGACGCAGGGAGATACTTTTAATTCTGGTTGATTCTTAGGAAGAATTTGGTTCTTCACTGTCAGGGTTTGGAATTTCATGGTTTCATTATTATTATTTTTTTTCTTGTATAGATTGCTGCATTAATTGAATAAAAGCAGAAAGCATC。

上述序列中加粗斜体的碱基对应于上述的六个SNP位点，下划线表示的两端序列为引物对。

3.2 ALKBH5基因外显子序列SNP位点与繁殖性状的关联分析

对上述6个SNP位点与繁殖性状(300日龄产蛋量、G1母亲390日龄产蛋量、G1母亲300日龄产蛋量)进行关联分析。

如表2所示，结果显示，g.984A>G位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)；g.1033A>G位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)；g.1112位点与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，与G1母亲390日龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)；g.1196T>C位点与G1母亲390日龄产蛋量存在显著相关(p<0.05)，与G1母亲300日龄产蛋量存在极显著相关(p<0.01)。其他SNP位点与繁殖性状关联性未达到显著水平(p>0.05)。

表2 SNP位点与繁殖性状关联

注：G1母亲泛指母本。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.利用分子标记鉴别麻黄鸡繁殖性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测麻黄鸡基因组DNA，利用引物对扩增分子标记或者包含所述分子标记的基因片段，获得扩增产物；所述引物对的序列如SEQ ID NO：2-3所示；

(2)对所述扩增产物测序，分析SEQ ID NO：1所示的第984、1033、1112以及1194处位点的基因型；

(3)根据基因型鉴别所述黄麻鸡繁殖性状；

所述鉴别黄麻鸡繁殖性状的方法为：SEQ ID NO：1所示序列的第984位与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关；第1033位与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关；第1112位与G1母亲300日龄产蛋量存在显著相关，与G1母亲390日龄产蛋量存在极显著相关；第1194位与G1母亲390日龄产蛋量存在显著相关，与G1母亲300日龄产蛋量存在极显著相关；

所述分子标记如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列存在如下SNP突变：第984位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1033位存在A>G突变，基因型为AA、AG和GG；第1112位存在SNP突变，基因型为AA、AC、AG、AT、CC、CG、CT、GT和TT；以及第1194位存在T>C突变。

2.如权利要求1所述的方法在麻黄鸡繁殖性状育种中的应用。