CN116004847A - 一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的分子检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的分子检测方法及其应用，属于分子生物技术。根据性连锁矮小基因缺失突变特征序列设计三条特异性引物：DW‑NOR‑F：GGCAGAAACCCCAAGTATG；DW‑MUT‑F：TGACGTGAACAGAAGTGCATGAC；DWDR：TCGGGACAGATCAAAGACAAT。利用该引物组合直接对血样裂解液进行PCR扩增反应，通过观察反应产物凝胶电泳条带就能鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型。该方法无需进行基因组DNA的提取，操作简单，易于推广，降低了鸡性连锁矮小基因缺失突变分子检测的成本，有利于提高矮小鸡的相关品种选育工作效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的分子检测方法及其应用。
背景技术
鸡性连锁矮小基因(Sex-linked dwarfgene,dw)定位在家鸡(Gallus gallusdomesticus)Z性染色体的生长激素受体基因(Growth hormone receptor，GHR)中。dw是一种隐性伴性基因突变，其实质是导致了GHR的表达异常，从而使鸡表现为矮脚表型。dw是目前已知的8种导致家鸡矮小表型的基因突变中，唯一一种对家鸡机体健康无害而对家鸡生产实践有利的。目前报导的dw突变主要有以下四种：(1)GHR编码序列外显子五335bp处碱基的T>C突变；(2)GHR编码序列外显子五354bp处碱基的T>C突变；(3)GHR编码序列外显子七679bp处碱基的T<G突变；(4)GHR编码序列外显子十和3'UTR区的一段长达1773bp缺失突变。其中第一种的碱基替换突变和第四种缺失突变是导致我国黄羽肉鸡出现矮脚表型的最主要的原因。
目前对我国黄羽肉鸡的性连锁矮小基因型在群体中进行分子检测技术鉴定突变基因型的方法主要有两种，一种是通过Sanger一代测序进行基因型鉴定，另一种则是通过琼脂糖凝胶电泳进行基因型分型。在性连锁矮小鸡的群体选育中，使用琼脂糖凝胶电泳判定性连锁矮小基因缺失突变是选育性连锁矮小鸡的常见方法，虽然相较于Sanger一代测序而言成本较低，周期较短，但同时也存在着需要具有专业技能的技术人员和相关的专业配套设备的协助才可完成，例如需要对待检个体的基因组DNA进行提取。因此，对性连锁矮小基因缺失突变型检测的简单化成为了生产实践中的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的分子检测方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用本发明公开的引物对抗凝全血模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分型后就能够鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型，该方法操作简单，易于推广，并且对性连锁矮小鸡的育种选育提供理论基础和数据支持。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的引物组合，包括：
DW-NOR-F：GGCAGAAACCCCAAGTATG；
DW-MUT-F：TGACGTGAACAGAAGTGCATGAC；
DWDR：ATTGTCTTTGATCTGTCCCGA。
本发明还提供一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的试剂盒，包含所述的引物组合。
本发明还一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的方法，包括以下步骤：
以鸡抗凝全血裂解液为模板，利用所述的引物组合或所述的试剂盒进行PCR扩增反应，对扩增产物凝胶电泳后进行辨别，若电泳结果只出现一条484bp的条带，则为非性连锁矮小基因缺失突变纯合子，基因型为DD，若电泳结果只出现一条252bp条带，则为性连锁矮小基因缺失突变纯合子，基因型为dd，若电泳结果出现一条484bp条带和一条252bp条带，则为携带性连锁矮小基因缺失突变的杂合子，基因型为Dd。
进一步地，所述所述鸡抗凝全血裂解液由鸡抗凝全血与裂解液在95℃孵育3min。
所述鸡抗凝全血以裂解液裂解后，形成鸡抗凝全血裂解液，作为模板，抗凝全血裂解后更有利于PCR扩增反应的进行，使得扩增结果清晰可见。
进一步地，所述鸡抗凝全血与所述裂解液的体积比为1：10。
进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火20s，72℃延伸60s，35个循环，72℃最终延伸8min，4℃保存。。
进一步地，所述扩增反应体系为：血液样本PCR预混液5μL、鸡抗凝全血裂解液1μL、DW-MUT-F和DW-NOR-F引物各0.2μL、DWDR引物0.4μL和双蒸水3.2μL。
本发明还提供一种所述的引物组合或所述的试剂盒在鉴定鸡性连锁矮小缺失突变基因型中的应用。
进一步地，所述引物组合或所述试剂盒中引物DW-MUT-F和DWDR用于非性连锁矮小缺失突变等位基因的检测，引物DW-NOR-F和DWDR用于性连锁矮小缺失突变等位基因的检测。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明是以经裂解液裂解后的鸡抗凝全血样本为模板，利用本发明公开的引物或试剂盒进行常规PCR技术扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分型后就能够鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变的基因型。操作简单，易于推广，并且对性连锁矮小鸡的育种选育提供理论基础和数据支持。
(2)本发明以经裂解液裂解后的鸡抗凝全血样本作为扩增模板，相比于传统的DNA分子检测技术，降低了技术门槛、提升了检测速度，同时还减少了检测成本。
(3)本发明可以对抗凝血进行快速的PCR扩增。育种企业可根据需要，或挑选性连锁矮小纯合子个体进行培育，或剔除性连锁矮小纯合子个体和杂合子个体，培育非性连锁矮小纯系，对于家鸡矮小型的品种选育具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为抗凝全血法PCR扩增产物凝胶电泳图，其中，1-21分别为21例粤黄鸡样本，M为Marker；
图2为验证引物特异性及扩增效率的凝胶电泳图，其中，前8个泳道为已知不含矮脚基因的粤黄鸡样本，后8个泳道为已知含有矮脚基因的杂合粤黄鸡样本，最左侧为Marker。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的分子检测方法
本实施例在于提供一种分子检测方法，利用经过简单处理的抗凝血为模板，通过常温PCR的方法来鉴定特定基因组位置的基因差异，进而鉴定性连锁矮小基因缺失突变的基因型。具体包括以下方法步骤：
步骤1：模板准备
(1)血样采集。随机选取21例广州市江丰实业股份有限公司的120日龄粤黄鸡，上述鸡的均为非矮脚鸡。采集上述21例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。
(2)血样处理。抽取2μL(1)中采集的抗凝全血样，加入20μL体积的裂解液，混匀，95℃孵育3min，获得鸡抗凝全血裂解液。
步骤2：性连锁矮小基因缺失突变基因座目的片段PCR扩增
经过步骤1处理的鸡抗凝全血裂解液为模板，由广州天一辉远基因科技有限公司合成的利用NCBI网站的Primer-BLAST工具设计的如表1的引物。将引物与诺唯赞生物科技股份有限公司提供的血液样本PCR预混液配制如表2的扩增反应体系，按照如表3的热循环参数及程序进行PCR扩增。
表1扩增引物
表2扩增反应体系
表3扩增反应程序
扩增产物交由广州天一辉远基因科技有限公司进行测序，测序结果如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.4
TGACGTGAACAGAAGTGCATGACGTGCAGTGAATGCAGATCTTGCTCATGATGTCTCCCACTGAACTCACTGATGCTCTCTTTGTGACCAAGGGCTACAGGACTGAGCCCAAACATTGGGTGGGATTTTTACGTTCAGAACGTACTCTATGGTAAATGTGCATTAGGTATTCTGCTAATTTGCTGCTATATTTTTCTAACAGCTACATTATTTAGTTACATATAAAATTTCATAGATGATAGACACTAATGCAAGTAAAGCCTATGTTTGTTTGGAAAAAGTTTCTTACTCTGTTTCTATTGCCAAAAATAGTTAAATACCTCAATCAAACTCAGAATGTCATTTTGGTACTTTACTGGTCACACAAGCCATTATTCGCCGGTCAGAAGATGTGTCTTTCAGTTTCTATTTAACTTTCCTTATGTCAGTGTTTTGTTTGTTTTCCTCGAAGTTTAATAAATGTATTGTCTTTGATCTGTCCCGA。
SEQ ID NO.5
GGCAGAAACCCCAAGTATGCAAGTAAAGCCTATGTTTGTTTGGAAAAAGTTTCTTACTCTGTTTCTATTGCCAAAAATAGTTAAATACCTCAATCAAACTCAGAATGTCATTTTGGTACTTTACTGGTCACACAAGCCATTATTCGCCGGTCAGAAGATGTGTCTTTCAGTTTCTATTTAACTTTCCTTATGTCAGTGTTTTGTTTGTTTTCCTCGAAGTTTAATAAATGTATTGTCTTTGATCTGTCCCGA。
步骤3：目的片段电泳分型
(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物10μL点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。
(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，若只出现一条484bp(SEQ ID NO.4)的条带，则说明其为非性连锁矮小基因缺失突变纯合子个体，基因型为DD；若只出现一条252bp(SEQ ID NO.5)条带，则说明其为性连锁矮小基因缺失突变纯合子个体，基因型为dd；若出现一条484bp条带和一条252bp条带，则说明其为携带性连锁矮小基因缺失突变的杂合子个体，基因型为Dd(图1)。
实施例2验证引物的扩增效率及其特异性
本实例对已知基因型样本进行分型。试验材料选取已知为不携带矮脚基因的纯合子粤黄鸡8只和已知是携带矮脚基因的粤黄鸡8只，用于验证引物的扩增效率及其特异性。
1.实验材料
选取已知为不携带矮脚基因的纯合子粤黄鸡8只和已知是携带矮脚基因的粤黄鸡8只。上述16例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。
2.实验方法
步骤1：模板准备
(1)血样采集。采集上述16例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。
(2)血样处理。抽取2μL(1)中采集的抗凝血样，加入20μL体积的裂解液，混匀，95℃孵育3min，获得鸡抗凝全血裂解液。
步骤2：矮脚基因座目的片段PCR扩增
经过步骤1处理的鸡抗凝全血裂解液为模板，利用实施例1中表1所示的引物，以及表2所示的扩增反应体系，和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。
步骤3：目的片段电泳分型
(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物10μL点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。
(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，不携带矮脚基因的纯合子粤黄鸡的基因组DNA只扩增出一条484bp的条带，则说明其基因型为DD；已知携带矮脚基因的杂合子粤黄鸡只扩增出一条252bp的条带，说明其基因型为Dd(图2)。
上述结果表明，通过该方法可以准确地筛选中群体中携带矮脚基因的粤黄鸡个体。
实施例3单盲检测判定方法的可靠性
本实例采用单盲的方式，对已知基因型样本进行分型。试验材料选取通过测交确定的10只携带矮脚基因的杂合子粤黄鸡F1代(Dd)和10只不携带矮脚基因纯合子粤黄鸡(AA)。
1.实验材料
选取已知为纯系无矮脚基因的粤黄鸡10只以及纯系粤黄鸡与纯系矮脚鸡杂交F1代血样10只。上述20例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。
2.实验方法
步骤1：模板准备
(1)血样采集。采集上述24例鸡的翅下静脉的血液3mL，置于碧迪EDTA-K2抗凝采血管中，该抗凝采血管内含EDTA抗凝剂。
(2)血样处理。抽取2μL(1)中采集的抗凝血样，加入20μL体积的裂解液，混匀，95℃孵育3min，获得鸡抗凝全血裂解液。
步骤2：矮脚基因座目的片段PCR扩增
经过步骤1处理的鸡抗凝全血裂解液为模板，利用实施例1中表1所示的引物，以及表4所示的扩增反应体系，和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。
表4扩增反应体系
步骤3：目的片段电泳分型
(1)电泳分型。吸取步骤2扩增的目的基因PCR产物10μL点入浓度为1％琼脂糖TAE凝胶中，电泳20min。
(2)结果判定。琼脂糖凝胶电泳分型图中，若只出现一条484bp的条带，则说明其为不携带矮脚基因的纯合子个体，基因型为DD；若出现一条484bp条带和一条252bp条带，则说明其为携带矮脚基因的杂合子个体，基因型为Dd。结果汇总如表5所示。
表5单盲检测判定结果
注：纯系无矮脚基因的粤黄鸡血样编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，粤黄鸡与纯系矮脚鸡杂交F1代血样编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12。
上述结果表明，通过该方法可准确地检测非矮脚鸡群中的矮脚基因是否存在。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的引物组合，其特征在于，包括：
DW-NOR-F：GGCAGAAACCCCAAGTATG；
DW-MUT-F：TGACGTGAACAGAAGTGCATGAC；
DWDR：TCGGGACAGATCAAAGACAAT。
2.一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组合。
3.一种抗凝全血法鉴定鸡性连锁矮小基因缺失突变基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以鸡抗凝全血裂解液为模板，利用权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增反应，对扩增产物凝胶电泳后进行辨别，若电泳结果只出现一条484bp的条带，则为非性连锁矮小基因缺失突变纯合子，基因型为DD，若电泳结果只出现一条252bp条带，则为性连锁矮小基因缺失突变纯合子，基因型为dd，若电泳结果出现一条484bp条带和一条252bp条带，则为携带性连锁矮小基因缺失突变的杂合子，基因型为Dd。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述鸡抗凝全血裂解液由鸡抗凝全血与裂解液在95℃孵育3min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述鸡抗凝全血与所述裂解液的体积比为1:10。
6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火20s，72℃延伸60s，35个循环，72℃最终延伸8min，4℃保存。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应体系为：血液样本PCR预混液5μL、鸡抗凝全血裂解液1μL、DW-MUT-F和DW-NOR-F引物各0.2μL、DWDR引物0.4μL和双蒸水3.2μL。
8.一种权利要求1所述的引物组合或权利要求2所述的试剂盒在鉴定鸡性连锁矮小缺失突变基因型中的应用。
9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述引物组合或所述试剂盒中引物DW-MUT-F和DWDR用于非性连锁矮小缺失突变等位基因的检测，引物DW-NOR-F和DWDR用于性连锁矮小缺失突变等位基因的检测。
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| CN102002530A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-04-06 | 广东智威农业科技股份有限公司 | 一种基因突变的检测方法 |
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-
2022
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Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (2)
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| NCBI数据库: "Gallus gallus BAC clone CH261-150p15 from chromosome z, complete sequence", Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/AC187590.3?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=9N8E7EW911R> * |
| 马立人等: "生物化学与分子生物学实验", vol. 1, 武汉：华中科技大学出版社, pages: 195 - 196 * |
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