CN110734984B

CN110734984B - 与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记及其应用

Info

Publication number: CN110734984B
Application number: CN201910979395.7A
Authority: CN
Inventors: 王继卿; 王建清; 刘秀; 李少斌; 罗玉柱
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110734984A

Abstract

本发明提供与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记，其位于KRTAP2‑1基因上，具有A、C和D三个优势等位基因，所述等位基因A、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；含有等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最小；缺失等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最大。本发明公开的遗传标记能够用于鉴定细毛羊羊毛纤维直径大小，能够用于选留羊毛纤维直径小、淘汰羊毛纤维直径大的细毛羊。

Description

与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记及其应用。

背景技术

羊毛是指覆盖在羊体表面的一层具有纺织价值的纤维，是皮肤的衍生物。绵羊毛是毛纺工业的主要原料，约占毛纺原料的97％，主要用来加工服装面料、毛线、毛毯等产品。在羊毛生产和育种实践中，羊毛性状是重要的经济性状，主要包括产毛量、平均纤维直径、弯曲度、断裂强度、伸度、净毛率等多个指标。在这些指标中，产毛量和平均纤维直径是最重要的指标，平均纤维直径直接决定了羊毛品质和使用价值，是世界各国通用的羊毛分级的基础指标。研究表明，羊毛性状受到遗传因素和非遗传因素的影响，其中功能基因在毛囊发育、羊毛生长以及羊毛的理化特性方面发挥了重要的作用。与传统育种方法相比，分子标记辅助选择方法具有许多优势，例如可以明显缩短世代间隔，提高选择准确性，提前选择时间，同时对它低遗传力性状、早期未表现的性状、活体难以度量或者度量难度较大、成本较高的性状，有良好的选择效果。但是，若想将分子标记辅助选择方法成功应用于绵羊羊毛性状的生产实践中，需要寻找到调控产毛性状的关键基因或与之相连锁的分子遗传标记。

角蛋白(Keratins)和角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins，KAPs；其编码基因为KRTAPs)占羊毛纤维重量的90％以上，直接决定了羊毛纤维的理化性状。角蛋白聚集成束形成8～10nm的纤维细丝，即角蛋白中间丝(Keratin intermediate filaments，KIFs)；KAPs通过大量的二硫键交联形成一个半刚性基质嵌入到KIFs的半胱氨酸残基中，从而形成羊毛纤维的主体结构。

目前，KRTAPs基因的研究主要集中在人类上。在人类基因组中，已至少发现了来自25个基因家族的80多个KRTAPs基因。然而，在绵羊基因组中，只发现了来自13个基因家族的29个KRTAPs基因。在已发现的这些绵羊KRTAPs基因上，所有的基因都有多态性，并且部分基因的多态性与绵羊的羊毛性状显著或极显著相关。例如KRTAP1-2、KRTAP6-1、KRTAP6-3、KRTAP8-2、KRTAP22-1、KRTAP26-1、KRTAP27-1、KRTAP28-1上的核苷酸序列变异显著影响了产毛量、平均纤维直径、伸直长度、弯曲度等多个羊毛性状。在新西兰和澳大利亚，一些高校和科研院所(如新西兰林肯大学)已利用KRTAPs基因进行绵羊羊毛性状的分子标记辅助选择，此选择方法已完全进入商业化运行阶段，即科研人员可以根据KRTAPs基因的基因型，来决定羊只个体的选留和淘汰。这表明，在绵羊羊毛性状的分子育种实践中，研究绵羊KRTAPs的多态性及其对羊毛纤维性状的影响具有重要的理论价值和实践价值，它将为绵羊羊毛性状的遗传改良提供理论依据和指导。

因此，鉴于KAPs蛋白在羊毛纤维中的重要作用，以及其编码基因KRTAPs与羊毛性状的高度相关性，本发明以细毛羊KRTAP2-1基因作为实验对象，研究该基因的核苷酸序列变异，分析基因多态性与产毛量和羊毛纤维直径的相关性，以期为细毛羊羊毛性状的分子标记辅助选择提供可靠的候选基因。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记。

本发明提供与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记，其位于KRTAP2-1基因上，具有A、C和D三个优势等位基因，所述等位基因A、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ IDNo.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；含有等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最小；缺失等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最大；

所述等位基因A为：在KRTAP2-1基因c.-103处为C，c.-70处为G，c.-25处为G，c.42处为C，c.142处为T，c.192处为C，c.264处为G，c.303处为C，c.348处为G；

所述等位基因C为：在KRTAP2-1基因c.-103处为T，c.-70处为G，c.-25处为A，c.42处为T，c.142处为T，c.192处为C，c.264处为G，c.303处为C，c.348处为T；

所述等位基因D为：在KRTAP2-1基因c.-103处为T，c.-70处为G，c.-25处为A，c.42处为T，c.142处为C，c.192处为C，c.264处为C，c.303处为T，c.348处为T。

本发明提供用于检测权利要求1所述的与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3'；

下游引物：5'-GTTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3'。

本发明提供用于检测细毛羊羊毛纤维直径大小的试剂盒，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-103处、c.-70处、c.-25处、c.42处、c.142处、c.192处、c.264处、c.303处和c.348处的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述细毛羊羊毛纤维直径大小。

作为优选，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP2-1基因中位置c.-103处为T，c.-70处为G，c.-25处为A，c.42处为T，c.142处为C，c.192处为C，c.264处为C，c.303处为T，c.348处为T的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述细毛羊羊毛纤维直径大小。

作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP2-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3'；

下游引物：5'-GTTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3'。

本发明提供上述与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记在鉴定细毛羊羊毛纤维直径大小中的应用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取细毛羊血液中的基因组DNA；

(2)以细毛羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当细毛羊个体含有等位基因D时，其羊毛纤维直径最小；当细毛羊个体不含有等位基因D时，其羊毛纤维直径最大；

所述等位基因D的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4。

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的细毛羊羊毛纤维直径大小进行判断。

本发明提供上述的遗传标记在选留羊毛纤维直径小、淘汰羊毛纤维直径大的细毛羊中的应用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取细毛羊血液中的基因组DNA；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，选留含有等位基因D的细毛羊，淘汰不含有等位基因D的细毛羊；

所述等位基因D的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4；

本发明公开的遗传标记能够用于鉴定细毛羊羊毛纤维直径大小，能够用于选留羊毛纤维直径小、淘汰羊毛纤维直径大的细毛羊。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为细毛羊KRTAP2-1基因的PCR-SSCP检测结果。

图2为细毛羊KRTAP2-1中4个等位基因的核苷酸序列比较结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

选择276只细毛羊，详细记录个体的出生日期、性别、出生等级(单羔或双羔)。待这些羔羊周岁时，测定个体的产毛量，在背中线处采集羊毛样本，实验室测定羊毛的平均纤维直径。对于有生产性能记录的所有细毛羊，每只羊颈静脉采血8mL，加入酸性柠檬酸葡萄糖(citric acid dextrose，ACD)抗凝，-20℃冻存，用于基因组DNA提取。

1.2基因组DNA提取

采用常规的苯酚-氯仿法提取血液基因组DNA。

1.3细毛羊KRTAP2-1基因的PCR扩增

在大连宝生物有限责任公司合成引物，用于扩增细毛羊的KRTAP2-1基因。上游引物是5'-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3'，下游引物是5'-GTTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3'。

采用20μL体系进行PCR扩增，包括1.0μL DNA模板(50ng/μl)、各0.25μL的浓度为0.25μmol/L的上下游引物、0.2μL的0.5U TaqDNA polymerase、2.0μL的10×PCR buffer、0.3μL的150μM dNTPs和16μL的ddH₂O。

PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，59℃退火30s，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸5分钟。

PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4细毛羊KRTAP2-1基因的SSCP多态性检测

取1μL PCR产物，加入9μL上样缓冲液(98％甲酰胺、10mM EDTA、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青)，95℃变性5分钟后立即置于冰水混合物中，上样于16×18cm、14％(Acr：Bis＝37.5：1)的聚丙烯酰胺凝胶中，在0.5×TBE、29℃(恒温)、280V电压条件下电泳18小时。电泳结束后，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色，判定每一个样本的基因型。

1.5等位基因序列测定和序列分析

测序方法因纯合子和杂合子而异。如果个体的基因型是纯合子，用PCR扩增产物直接测序；如果某个等位基因无纯合子个体，全部以杂合子形式存在，则按照Gong等描述的方法切胶测序。序列测定由上海生工生物有限公司完成。为保证测序结果的准确性，每种基因型均选择3个不同的个体进行测序。用DNAMAN(V 5.2.10)软件进行核苷酸序列的比对和翻译。

1.6相关性分析

在276只细毛羊中，对于频率大于5％的等位基因，采用SPSS(20.0)软件的一般线性混合效应模型(General Liner Mixed-effect Models，GLMMs)分析等位基因状态(存在或缺失)对细毛羊产毛量和羊毛纤维直径的影响。由于所有细毛羊的羊毛性状均在周岁时被测定，且在同一环境条件下饲养，因此在模型中没有考虑年龄和环境因素。模型如下：

Y＝μ+Allele+Gender+Sire+e

其中，Y为羊毛性状表型值，μ为群体均值，Allele为等位基因状态(用0和1分别表示缺失和存在)，Gender为性别，Sire为父本(配种公羊)，e为随机误差。

2结果

2.1细毛羊KRTAP2-1基因的多态性分析

经过PCR-SSCP分析，在细毛羊的KRTAP2-1基因中共发现A、B、C和D 4个等位基因，构成了AA、AB、BB、AC、BC、CC、DD、AD和CD 9种基因型。等位基因和基因型的SSCP条带见图1。在276只细毛羊中，等位基因C的频率最高，为56.37％，其次为等位基因A、D和B，它们的频率分别为23.31％、16.16％和4.16％。

图1为细毛羊KRTAP2-1基因的PCR-SSCP检测结果。

2.2细毛羊KRTAP2-1基因的SNPs

通过测序，获得了A、B、C和D 4个等位基因的核苷酸序列，这4个等位基因的核苷酸序列如下。

等位基因A的序列为：

AACAAGGAATGGCATGAGTCTCTGGGGATCATCAGCTCCCGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGACACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCACCTCAGCCCCACTCGGCCCCACACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCGGAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGTGACCCCTGCTGCTGCCGCCCAGTATCCTGCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACATCCTGCCAGGCCGTGGTGTGCCGCCCCTGCTGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTCTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCACCAGCTGCCAGCCGGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCCCCTGCTGCTGAGACCCCACTTTCCTATAAAGCAAC

等位基因B的序列为：

AACAAGGAATGGCATGAGTCTCTGGGGATCATCAGCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGAAAGACACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCACCTCAACCCCACTCGGCCCCACACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGCTGTGGCGGAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGTGACCCCTGCTGCTGCCGCCCAGTATCCTGCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGCCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGTGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACATCCTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGCTGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCTGTCTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCACCAGCTGCCAGCCTGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCCCCTGCTGCTGAGACCCCACTTTCCTATAAAGCAAC

等位基因C的序列为：

AACAAGGAATGGCATGAGTCTCTGGGGATCATCAGCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGACACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCACCTCAACCCCACTCGGCCCCACACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGTTGTGGCGGAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGTGACCCCTGCTGCTGCCGCCCAGTATCCTGCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGTCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACATCCTGCCAGGCCGTGGTGTGCCGCCCCTGCTGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCCGTCTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCACCAGCTGCCAGCCTGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCCCCTGCTGCTGAGACCCCACTTTCCTATAAAGCAAC

等位基因D的序列为：

AACAAGGAATGGCATGAGTCTCTGGGGATCATCAGCTCCTGGCCAGGGTATATAAAGGGCCCCGAGCAGGGGGAAGACACTCACACCTGAGAACACTCAACTCCGCTCACCACCTCAACCCCACTCGGCCCCACACACCACCATGACCGGCTCCTGCTGCGGCCCCACCTTCTCCTCCCTCAGTTGTGGCGGAGGCTGCCTCCAGCCCCGCTACTACCGTGACCCCTGCTGCTGCCGCCCAGTATCCTGCCAGACCACCGTGAGCCGCCCCGTGACCTTCGTGCCCCGCTGCACGCGCCCCATCTGCGAGCCCTGCCGCCGCCCGGTCTGCTGCGACCCCTGCAGCCTGCAGGAGGGCTGCTGCCGCCCCATCACCTGCTGCCCCACATCCTGCCAGGCCGTGGTCTGCCGCCCCTGCTGCTGGGCCACCACGTGCTGCCAGCCTGTCTCTGTGCAGTCCCCGTGCTGCCGCCCCACCAGCTGCCAGCCTGCCCCCTGCCGCACCACCTGCCGCACCTTCAGGACCTCCCCCTGCTGCTGAGACCCCACTTTCCTATAAAGCAAC

4个等位基因的序列比对结果见图2。

图2为细毛羊KRTAP2-1中4个等位基因的核苷酸序列比较结果。图中的符号“-”表示核苷酸序列与等位基因A的序列一致。CDS区的核苷酸序列用大写字母表示，非编码区的序列用小写字母表示。图中注释了9个SNPs位点以及1个非同义突变。起始密码子ATG和终止密码子TGA用方框显示。

由图2和表1可知，4个等位基因间共存在9个SNPs，其中3个SNPs(c.-103C/T、c.-70G/A和c.-25G/A)位于3'-UTR区域，剩余的6个SNPs(c.42C/T、c.142T/C、c.192C/T、c.264G/C、c.303C/T和c.348G/T)均位于CDS区域。在编码区的6个SNPs中，c.142T/C为非同义突变，引起了p.Ser48Pro的氨基酸改变，其余5个SNPs均为同义突变。

表1细毛羊KRTAP2-1基因的SNPs

¹SNPs和氨基酸的顺序和书写格式遵循了HGVS的命名规则(http://varnomen.hgvs.org/)。

2.3 KRTAP2-1等位基因对细毛羊毛用性状的影响

在276只细毛羊上发现的4个等位基因中，由于等位基因B的频率小于5％，因此在相关性分析中，只分析了优势等位基因A、C和D的存在(缺失)对细毛羊羊毛性状的影响。

KRTAP2-1等位基因对细毛羊毛用性状的影响见表2。由表2可知，等位基因A和C对毛用性状无显著影响(P>0.05)，而等位基因D对羊毛纤维直径有极显著影响(P<0.01)，含有等位基因D的个体的羊毛纤维直径较缺失等位基因D的个体低1.2μm。

表2 KRTAP2-1等位基因与细毛羊羊毛性状的相关性

3结论

KRTAP2-1的等位基因对细毛羊的羊毛纤维直径有极显著影响(P<0.01)，含有等位基因D的个体的羊毛纤维直径较缺失等位基因D的个体低1.2μm。因此，在对细毛羊进行分子选种时，应选留含有等位基因D的个体，以降低细毛羊的羊毛纤维直径。

实施例2

本发明的细毛羊羊毛纤维直径检测PCR-SSCR试剂盒包括：

1、引物对

上游引物：5'-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3'

下游引物：5'-GTTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3'。

2、PCR反应体系

20μL PCR反应体系为：1.0μL DNA模板(50ng/μl)、各0.25μL的浓度为0.25μmol/L的上下游引物、0.2μL的0.5U TaqDNA polymerase、2.0μL的10×PCRbuffer、0.3μL的150μMdNTPs、和16μL的ddH₂O。

3、SSCP上样变性缓冲液

包括98％甲酰胺、10mM EDTA、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青。

4、标准样

标准样A：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；

标准样C：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3。

标准样D：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4。

DNA模板的获得方法以及试剂盒的使用方法参照实施例1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 1

aacaaggaat ggcatgagtc tctggggatc atcagctccc ggccagggta tataaagggc 60

cccgagcagg gggaagacac tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cacctcagcc 120

ccactcggcc ccacacacca ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct 180

cagctgtggc ggaggctgcc tccagccccg ctactaccgt gacccctgct gctgccgccc 240

agtatcctgc cagaccaccg tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc 300

catctgcgag ccctgccgcc gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg 360

ctgccgcccc atcacctgct gccccacatc ctgccaggcc gtggtgtgcc gcccctgctg 420

ctgggccacc acgtgctgcc agcccgtctc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag 480

ctgccagccg gccccctgcc gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc cctgctgctg 540

agaccccact ttcctataaa gcaac 565

<210> 2

<211> 565

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 2

aacaaggaat ggcatgagtc tctggggatc atcagctcct ggccagggta tataaagggc 60

cccgagcagg ggaaagacac tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cacctcaacc 120

ccactcggcc ccacacacca ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct 180

cagctgtggc ggaggctgcc tccagccccg ctactaccgt gacccctgct gctgccgccc 240

agtatcctgc cagaccaccg tgagccgccc cgtgaccttc gtgccccgct gcacgcgccc 300

catctgcgag ccctgccgcc gcccggtctg ctgtgacccc tgcagcctgc aggagggctg 360

ctgccgcccc atcacctgct gccccacatc ctgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg 420

ctgggccacc acgtgctgcc agcctgtctc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag 480

ctgccagcct gccccctgcc gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc cctgctgctg 540

agaccccact ttcctataaa gcaac 565

<210> 3

<211> 565

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 3

aacaaggaat ggcatgagtc tctggggatc atcagctcct ggccagggta tataaagggc 60

cccgagcagg gggaagacac tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cacctcaacc 120

ccactcggcc ccacacacca ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct 180

cagttgtggc ggaggctgcc tccagccccg ctactaccgt gacccctgct gctgccgccc 240

agtatcctgc cagaccaccg tgagccgccc cgtgaccttc gtgtcccgct gcacgcgccc 300

catctgcgag ccctgccgcc gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg 360

ctgccgcccc atcacctgct gccccacatc ctgccaggcc gtggtgtgcc gcccctgctg 420

ctgggccacc acgtgctgcc agcccgtctc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag 480

ctgccagcct gccccctgcc gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc cctgctgctg 540

agaccccact ttcctataaa gcaac 565

<210> 4

<211> 565

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 4

aacaaggaat ggcatgagtc tctggggatc atcagctcct ggccagggta tataaagggc 60

cccgagcagg gggaagacac tcacacctga gaacactcaa ctccgctcac cacctcaacc 120

ccactcggcc ccacacacca ccatgaccgg ctcctgctgc ggccccacct tctcctccct 180

cagttgtggc ggaggctgcc tccagccccg ctactaccgt gacccctgct gctgccgccc 240

agtatcctgc cagaccaccg tgagccgccc cgtgaccttc gtgccccgct gcacgcgccc 300

catctgcgag ccctgccgcc gcccggtctg ctgcgacccc tgcagcctgc aggagggctg 360

ctgccgcccc atcacctgct gccccacatc ctgccaggcc gtggtctgcc gcccctgctg 420

ctgggccacc acgtgctgcc agcctgtctc tgtgcagtcc ccgtgctgcc gccccaccag 480

ctgccagcct gccccctgcc gcaccacctg ccgcaccttc aggacctccc cctgctgctg 540

agaccccact ttcctataaa gcaac 565

Claims

1.用于检测细毛羊羊毛纤维直径大小的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

b、由步骤a的结果预测所述细毛羊羊毛纤维直径大小；

所述试剂盒包括用于扩增KRTAP2-1基因的引物对、SSCP上样变性缓冲液和标准样A、标准样C和标准样D；

所述引物对为：

上游引物：5'-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3'；

下游引物：5'-GTTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3'；

所述标准样A的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；

所述标准样C的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3；

所述标准样D的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

b、由步骤a的结果预测所述细毛羊羊毛纤维直径大小；

所述试剂盒中的标准样为标准样D。

3.与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记在鉴定细毛羊羊毛纤维直径大小中的应用；所述与细毛羊羊毛纤维直径相关的遗传标记位于KRTAP2-1基因上，具有A、C和D三个优势等位基因，所述等位基因A、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；含有等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最小；缺失等位基因D的个体，其羊毛纤维直径最大；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取细毛羊血液中的基因组DNA；

(2)以细毛羊基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的引物对进行PCR扩增；

所述等位基因D的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的细毛羊羊毛纤维直径大小进行判断。

6.权利要求3中所述的遗传标记在选留羊毛纤维直径小、淘汰羊毛纤维直径大的细毛羊中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取细毛羊血液中的基因组DNA；

所述等位基因D的核苷酸序列为序列表中ID No.4。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的细毛羊羊毛纤维直径大小进行判断。