CN118109629B

CN118109629B - 位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、检测引物和试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN118109629B
Application number: CN202410315242.3A
Authority: CN
Inventors: 杨细燕; 张献龙; 朱龙付; 张萌萌; 刘治琳; 孙伟男; 张文浩; 王雨昕; 耿菁
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2024-03-19
Filing date: 2024-03-19
Publication date: 2024-08-13
Anticipated expiration: 2044-03-19
Also published as: CN118109629A

Abstract

本发明属于分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、检测引物和试剂盒及其应用。所述Indel变异位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第678位碱基，在抗旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“A”，在敏旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“ACTTTTCCCTG”。本发明的Indel变异与综合抗旱指数表型值紧密连锁，可作为分子标记应用于棉花干旱抗性的鉴定和选育，在基因型水平快速、准确、可靠地区分或鉴定抗旱种质，大大加快育种进程、提高育种中选择的准确性和棉花抗旱种质创新效率，对棉花分子标记辅助育种和培育新的棉花种质资源意义重大。

Description

位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、检测引物和试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，特别涉及位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、检测引物和试剂盒及其应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物和油料作物之一，在全球30多个国家范围内大面积种植，其中栽培最广泛的是陆地棉(Gossypium hirsutum)。在极端的环境条件下(例如干旱)，会影响棉花的生长发育、产量和纤维品质，干旱是影响面积最广、造成经济损失最为严重的非生物胁迫因子，棉花在幼苗期、开花期以及棉铃发育时期对于缺水尤为敏感，干旱胁迫下棉花的株高、果枝延展以及叶面积扩张速度都显著减少；落蕾落铃率显著增加；光合能力减弱直接造成作物产量降低和纤维品质下降。因此筛选和培育抗旱的棉花新品种对于提高棉花产业的健康可持续发展具有重要意义。

传统的棉花育种依赖于表型性状选择，环境对表型的影响极大的限制了选择效率。相较于常规育种技术，通过分子标记辅助选择育种不受时间、地域因素的限制，选择过程迅速准确，是选育棉花抗旱性新品种经济而有效的方法，应用日益广泛。与目标基因紧密连锁的分子标记的开发已成为高效辅助选择育种的重要前提。因此，开发棉花干旱相关的基因标记对棉花分子标记辅助选择育种和培育新的棉花种质资源具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异，其与综合抗旱指数表型值紧密连锁，不同基因型对应的表型值差异显著，可以开发成分子标记，在基因型水平快速、准确、可靠地区分或鉴定抗旱种质，由此本发明提供了该Indel变异、用于检测该Indel变异的检测引物或试剂盒在棉花干旱抗性鉴定或育种中的应用，对棉花分子标记辅助育种和培育新的棉花种质资源意义重大。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、其检测引物或试剂盒在棉花干旱抗性鉴定或育种中的应用；所述Indel变异位于如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第678位碱基，在抗旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“A”，在敏旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“ACTTTTCCCTG”。

本发明第二方面提供了一种用于检测陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的检测引物，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或如SEQ ID NO.5所示。

进一步地，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明第三方面提供了一种用于检测陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的检测引物。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和缓冲试剂。

本发明第四方面提供了一种棉花干旱抗性的鉴定方法，包括以下步骤：

利用如SEQ ID NO.2-3所示的检测引物扩增待测棉花基因组DNA，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物的条带有无；当能够特异性扩增出230bp带型时，待测棉花种质为敏旱棉花种质；当无法特异性扩增出条带或扩增得到的带型不含有230bp带型时，待测棉花种质为抗旱棉花种质。

进一步地，采用CTAB提取法提取基因组DNA。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10×buffer 2.0μL、dNTP mix0.4μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、基因组DNA 1μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL和无菌水16μL；其中，上游引物和下游引物浓度为1-2mM，基因组DNA的浓度为3.75-5ng/μL。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，52-53℃退火30s，70-72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min。

本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异与综合抗旱指数表型值紧密连锁，不同基因型对应的表型值差异显著，可作为分子标记，应用于棉花干旱抗性的鉴定和选育，通过如PCR扩增等技术检测该分子标记的基因型，基于PCR产物带型变化以高效区分抗旱棉花种质和干旱敏感型棉花种质，可实现快速、准确、可靠地鉴定抗旱种质，不受环境因素影响，能够大大加快育种进程、提高育种中选择的准确性和棉花抗旱种质创新效率。此外，本发明提供的变异位点可作为基因工程育种的靶点，为棉花遗传改良提供了一种新的快速有效的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例基于GhPME26基因座上自然变异进行候选基因与干旱抗性表型的关联分析图，其中，图a为GhPME26基因座不同物理位置的变异与综合抗旱指数表型值之间的相关性，图b为GhPME26基因座不同物理位置的变异类型；

图2为本发明实施例517份自然群体中GhPME26基因座上Indel变异的单倍型分析结果图；

图3为本发明实施例基于Junmian 1和Wankangmian 9棉花种质的Indel变异基因型和测序峰图；

图4为本发明实施例采用不同引物对扩增Indel变异的结果图，其中，图a为使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示引物对扩增的PCR产物的测序序列图，图b为使用SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示引物对扩增的PCR产物的凝胶电泳图；

图5为使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对扩增棉花种质自然群体的PCR产物的凝胶电泳图，其中，图a为敏旱棉花种质材料，图b为抗旱棉花种质材料。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

Indel是指插入缺失突变，利用与目标性状紧密连锁的Indel设计特异引物进行PCR扩增，从而根据PCR产物的不同判断作物的抗旱表型，可减少育种工作量并提高育种效率。传统的抗旱相关Indel标记基于大片段碱基插入或缺失，通过在Indel序列的两端设计引物扩增PCR产物，根据片段大小判断变异类型，这种方式会受凝胶电泳分辨率的影响。可用于直观并准确的区分不同个体中的差异DNA信息的Indel标记仍较少，有待进一步开发和丰富。

本发明一实施例提供了一种位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异、其检测引物或试剂盒在棉花干旱抗性鉴定或育种中的应用；所述Indel变异位于如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的第678位碱基，在抗旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“A”，在敏旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为“ACTTTTCCCTG”。

在本发明的研究中显示，陆地棉GhPME26基因位于517份及220份棉花自然群体共同鉴定到的干旱数量性状基因座(Quantitative Trait Locus，QTL)区间内，同时发现GhPME26基因上游调控区域上的Indel变异与综合抗旱指数表型值显著相关。前述Indel变异位于陆地棉参考基因组(Ghirsutum_genome_HAU_v1.0)A12号染色体的第83253278bp处，且与参考基因组相比存在A->ACTTTTCCCTG的基因型变异。通过基因型与表型的相关性分析，发现该Indel变异与综合抗旱指数表型值存在紧密连锁，该位点不同基因型对应的表型值差异显著，携带单倍型“ACTTTTCCCTG”等位变异的棉花抗旱性能显著低于携带单倍型“A”等位变异的棉花，且在群体中验证基因型与表型高度一致。

因此，本发明提供的Indel变异可作为分子标记，应用于棉花干旱抗性的鉴定和选育，将表型的区分转化为基因型的判断，进而通过检测该分子标记的基因型，可实现快速、准确的预测待测棉花种质的性状表型。具体而言，当检测到待测棉花材料中该位点为单倍型“A”，判定为抗旱种质，当检测到为单倍型“ACTTTTCCCTG”，判定为敏旱种质。本发明可实现从基因型水平快速、准确、可靠地区分或鉴定抗旱种质，不受环境因素影响，能够大大加快育种进程、提高育种中选择的准确性和棉花抗旱种质创新效率。此外，本发明提供的变异位点可作为基因工程育种的靶点，通过突变、编辑等方式将单倍型“ACTTTTCCCTG”缺失为单倍型“A”，可为棉花遗传改良提供一种新的快速有效的途径，对棉花抗旱种质创新意义重大。

本发明又一实施例提供了一种用于检测陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的检测引物，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或如SEQ ID NO.5所示。

上游引物：5'-ATAAATAAATAAAGTTGGAGGTC-3'(见SEQ ID NO.2)；

下游引物-1：5'-TAGATTTATCAGGGAAAAGTAGAT-3'(见SEQ ID NO.3)；

下游引物-2：5'-TCTTAAAATCAAATCCCATAGTA-3'(见SEQ ID NO.5)。

本发明以待测棉花种质基因组DNA为模板，利用上述开发的PCR检测引物进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见引物对扩增得到的目的片段条带明亮单一，与理论大小和序列信息一致，基因分型效果良好。通过测序等手段或者观测电泳条带大小能够获取准确的变异信息，进而快速、准确的区分待测棉花的抗旱性能。

优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将Indel变异位点设计在下游引物(下划线所示区域)中，开发得到检测引物对，当缺失单倍型“ACTTTTCCCTG”时，下游引物的扩增效率大大降低，由此可以通过PCR产物的有无来高效区分抗旱棉花种质和干旱敏感型棉花种质，即仅需要对待测棉花种质基因组DNA为模板进行PCR扩增，再经过凝胶电泳即可通过分子标记带型准确判断待测棉花种质是否具有干旱抗性，当所述PCR扩增产物可以特异性扩增出条带且含有230bp带型时，待测棉花种质为敏旱棉花种质，当所述PCR扩增产物无法特异性扩增出条带或扩增得到的带型不含有230bp带型时，待测棉花种质为抗旱棉花种质。结果呈现方式更加简便直观，避免了凝胶电泳分辨率和电泳时间等影响导致的条带大小不准确的问题，有利于对棉花进行分子标记辅助选择育种和培育新的棉花种质资源。

本发明另一实施例提供了一种用于检测陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的检测引物。

所述试剂盒相对于现有技术的优势与如上所述的检测引物相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。

可选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，本发明对所述PCR扩增试剂的来源没有特殊限定，采用本领域中常规市售产品即可。

在典型的实施方式中，所述PCR扩增试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和缓冲试剂。

本发明对试剂盒中PCR扩增试剂总量和引物的总量没有特殊限定，依据试剂盒常规需求量设置即可。一般而言，试剂盒中上游引物和下游引物的浓度优选为10-20mM，更优选为10mM，该浓度通常为母液浓度。缓冲试剂优选为10×Buffer。

基于与上述相同的发明构思，本发明再一实施例提供了一种棉花干旱抗性的鉴定方法，包括以下步骤：

利用如SEQ ID NO.2-3所示的检测引物对待测棉花基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物的条带有无；当能够特异性扩增出230bp带型时，待测棉花种质为敏旱棉花种质；当无法特异性扩增出条带或扩增得到的带型不含有230bp带型时，待测棉花种质为抗旱棉花种质。

本发明只需PCR扩增和凝胶电泳带型检测两个步骤，即可实现在基因型水平高效区分抗旱棉花种质和敏旱棉花种质，具有成本低、通量高、特异性强等优势。

本发明对提取待测棉花种质基因组DNA的方法没有具体限定，采用本领域中常用基因组DNA提取方法或基因组DNA提取试剂盒均可，如本发明实施例中采用的CTAB提取法。

可选地，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：10×buffer 2.0μL、dNTP mix0.4μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、基因组DNA 1μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL和无菌水16μL；其中，上游引物和下游引物浓度为1-2mM，基因组DNA的浓度为3.75-5ng/μL。

可选地，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，52-53℃退火30s，70-72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min。

本发明上述所述的棉花干旱抗性鉴定优选为对抗旱棉花种质和敏旱棉花种质进行鉴定和区分，所述棉花优选为陆地棉。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

种质资源：下述实施例所使用的棉花种质从本课题组收集的包含有517份陆地棉种质资源的自然群体中挑选而来，原始来源为国外引种，公众可从申请人处获得相关种质资源材料(表1示出了本发明所用陆地棉种质资源的信息)，仅可用于重复本发明实验使用不得他用。517份陆地棉自然群体种质资源相关研究已经公开发表在文献“Li B,Tian Q,Wang X,Han B,Liu L,Kong X,Si A,Wang J,Lin Z,Zhang X,Yu Y,Yang X.Phenotypicplasticity and genetic variation of cotton yield and its related traits underwater-limited conditions.Crop J,2020,8(6):966-976”以及“李保奇，基于田间表型和表型组平台图像指标解析棉花响应干旱的遗传基础，2020”中。

利用综合抗旱指数(Comprehensive index ofdrought tolerance，CIDT)来评估棉花的综合抗旱性，计算公式如下：

CIDT＝DRC(LP+LW+YPH+MV+FSBN+EFSBN)/(GP+SW+FL+FS+FE+PH+FFSH+FFSBN+EBN+PBN)，其中，DRC值为干旱处理表型值和对照组表型值的比值，每个性状均对应一个各自的DRC值，衣分(LP)、衣指(LW)、每公顷籽棉产量(YPH)、马克隆值(MV)、果枝数(FSBN)、空果枝数(EFSBN)指标的群体平均值在水分限制条件下显著增大(p<0.001)，生育期(GP)、籽指(SW)、纤维长度(FL)、纤维强度(FS)、纤维伸长率(FE)、株高(PH)、果枝始节高(FFSH)、果枝始节数(FFSBN)、单株有效铃数(EBN)、外围铃数(PBN)指标的群体平均值在水分限制条件下显著减小(p<0.001)，相关研究同样发表在上述文章中。

表1本发明所使用的棉花种质资源材料信息

1、基于GhPME26基因的自然变异与棉花综合抗旱指数表型值的关联分析

基于前期研究，陆地棉GhPME26基因上游调控区域上的自然变异在517份及220份棉花自然群体共同鉴定到的干旱数量性状基因座(Quantitative Trait Locus，QTL)区间内，同时发现GhPME26基因有11个变异与综合抗旱指数表型值显著相关。

以上述区域作为研究对象，利用本实验室公开发表的517份陆地棉重测序数据(重测序原始数据释放在NCBI中的SRA数据库中，项目编号为PRJNA556955)，构建陆地棉自然变异图谱。从中调取GhPME26基因座上的变异信息(包含起始密码子前2000bp)进行候选基因关联分析，分析步骤如下：

(1)、获取自然变异图谱中在83252601bp到83255651bp之间的变异信息，即在517份棉花种质自然群体重测序基因型vcf文件中提取A12染色体83252601bp至83255651bp之间的变异信息。

在GhPME26基因座中有12个变异，其中8个变异在上游调控区域，包含3个Indel变异和5个SNP变异；2个SNP变异位于基因外显子，其中1个属于错义突变，引起赖氨酸替换为谷氨酰胺，可能导致基因功能差异；2个SNP变异在基因3’UTR区。

(2)、将517份棉花品种按不同基因型进行分组，例如A和ACTTTTCCCTG两种基因型，计算综合抗旱指数表型值的成组t检验，p值即为t检验后变异与表型之间的相关性，以小于0.05为显著阈值。

分析结果见表2和图1。图1中a图示出了GhPME26基因座不同物理位置的变异与综合抗旱指数表型值之间的相关性，X轴为表2中变异在基因组上的物理位置，Y轴为-log(pvalue)，p为表2中t检验结果；b图示出了GhPME26基因座不同物理位置的变异类型，总结于表2中。在GhPME26基因座的12个变异中，有11个变异与综合抗旱指数表型值显著相关，其中7个在上游调控区域，2个在外显子，2个在3’UTR区，

表2陆地棉自然群体中的GhPME26基因座上的变异信息总结

注：表中各列类别含义如下，Type：变异类型；Pos：基因组物理位置；Ref：参考基因型；Alt：变异基因型；Dist toATG：与起始密码子的物理距离，负值表示起始密码子上游调控区域；T.test_p：两种基因型综合抗旱指数的T检验p值。

由于调控区对于基因的表达变化具有相对更重要的作用，同时连锁不平衡分析也表明，在调控区域上的Indel变异A->ACTTTTCCCTG(如图1中b图)和表型存在显著相关性(p＝0.00151)。由于其他的变异为SNP和小片段Indel，难以开发成简单的PCR标记进行应用，因此本发明选择Indel变异A->ACTTTTCCCTG作为PCR标记的开发基础。

(3)将517份棉花自然群体按照“A”和“ACTTTTCCCTG”两种基因型分组，进行单倍型分析，结果见图2，其中，横坐标表示单倍型，纵坐标表示综合抗旱指数。从图中可以看出不同单倍型对应的表型值差异显著，且携带“ACTTTTCCCTG”单倍型等位变异将显著降低棉花抗旱性能。

本实施例中筛选得到的Indel变异A->ACTTTTCCCTG位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域，示例性地，含有单倍型“A”变异位点的GhPME26基因上游调控区域(截取自GhPME26基因上游2000bp)的核苷酸序列(5’-3’)如SEQ ID NO.1所示，单倍型“A”位于第678位碱基，单倍型“ACTTTTCCCTG”的核苷酸序列通过将第678位碱基“A”替换为“ACTTTTCCCTG”获得。

AAATATATGTATCCCAATCAATTAAATTAAATTACTTGTTTTTAAAGAATTAATTAATGGTATATAGCATTTTTTAATGTATATAACAATTAATTGCTCTTTCAAAAATGCAATTTTTATGTTTTTAAATTTTAAAATATTACATTAACATTTTAAGAATATAATCCATGATAACCGGTAAGTCATTGACCTCAAGAAATATACCAAGGTTAAATTTTGTTATTAATCCCTATATTTTTATAGAATTTGAGATTTAGTTCCTATACTTTAAAAATTAAAATTAAAATTTTCTTATTTTTTTCAATTTAAAAATCTTAATCCAATCAATATCCTCTTACTTTGTCAACTTAGCATTTTATTTTTCAACAATCATATACCATATCACATGAAAACAGCTTAGTTAACATGACAAATAGACAAATTTTTATAAAAAAATATTTACGAATTTAATTATTGGACTGAGCTTTATAAATAAATAAAGTTGGAGGTCTTTTTTTTAATTATTTTAATACAAGGACTAAATTTTAATTAAAGTACATAGACTAACAACATATTTTAATTATATATTAATCAGTTAGTTATGAATTTGAAATCATATTTTTAAATCATTTATGGTAAATTTCTTTGAAAGACGAAATTCTCCACCTTCTTCTATTCAATCAACCTCTTTGTTATCTAATAAATCTAATGGAAATTATTGTTAATTAAATGATGGAATGAATTAATCATTATTTCCTTCATTAAATCATCAAAACTTTAAATTTATTGAATATTTGTTTGACTAAACAAGTTTTTTTGGGGCCTTATTTAGTATTTAAAATAAAATTTAAATACTATGGGATTTGATTTTAAGAGTATTTTTCATAAAATATACCTCAAGTAGAGTTAAATTATCGAGGCTTAATGATAAATTTAACCACTTACGTTTATATGTTTTGTCAAAATGGTCCTAATTATATTTTTAGCCTTTTTTAGCCATCAACTTTTATTTTTTTTCAAATTGTTGTTTCTAACAAATTTGATGAAAGAGTACTTAAAAAAGTTTAACGGAATGATGTGGAATATTTTTAATGAGATGTAATTTATTACTTAGATAACCCAATAAAATAATTACATGTGAAAAGTAATAAAATAAATAAATAATTCATGATGTTAAAAAAATAACTCTTTATTTAAAGAAAATAAACGAAATTATCTAAAAAAGGTTTCAAAATGAATGCACACATTCAGTATAATTATCTTTTTGAATCCTCCTAGTAAACAAATGTATGCATACATTTTGAAACTTTTTTTTAAGATAATTACGTTTATTTTCTTTAAACTAAGAGTTTTTTTTTAATTTCATGTATGATTTGTTTATTTTATTATTTTTCATATGTAATTATCTTATTGGGTTACCTAAATAATAAATTATATCTTAGTAAAAATATTTTACATTATCCTTGTTAACTTTTTTTAAGAGTACTTTTATAAAATCGGTTAGAAAAAGCAGTTTGAAAAAAAAAACAAAGGTTGATAGCCAAAAAACAATTCAAAAATACAATTAGGACCATTTTGATAAAACATATATACGTTAGTATCCAAATTTATTATTAAGCCAATTATCAATTATGATTGTTAAATAAATGTCCTCTCTCTGTTTTTTTTCTCCATATTTATTGATTTTATTATGGGTTTATATGTGAAAGTTTTGGTTAAATTAATGTTAAATCGATTATTTGATTCATAAATTAATCATTAAAATAGTTAGTTTATAGAACCAACCAGTATTAAAATATAGGATTTCGAGTGAATTTCGGTGAATTGATTAGTGTTTACCTTAAAATTAAGGTATCGGTACATTTTGTATGGCTAAATTTCGAGTGAATTTCGGTGAATTGGTTAGTGTTTACCCTAAAATTAAGGTATCGGTACATTTTGTATGGCTAAAACTCGCACGCATATGCTATTTCCATGCACATCTCATGCCTTGATAAGCAATCGAATCACCATTCCCATTT(见SEQ ID NO.1)，其中阴影部分所示为Indel变异单倍型“A”的位置。

在基因组中，该Indel变异位于陆地棉TM-1参考基因组“TM-1_HAU-AD1_v1.0(版本为Ghirsutum_genome_HAU_v1.0，可以从CottonFGD数据库中开放获取，网址为http://cotton.hzau.edu.cn/EN/Download.htm)”的A12号染色体第83253278bp(以单倍型“A”所在位置计)处，且与参考基因组相比存在发生A->ACTTTTCCCTG的基因型变异。

2、基于陆地棉GhPME26基因上游调控区域Indel变异开发分子标记检测引物

2.1分子标记真实性验证

根据变异图谱中材料信息及对应的基因型信息，挑选83253278bp位置基因型分别为A和ACTTTTCCCTG的干旱抗性极端材料各1份进行分子标记扩增，其中Wankangmian 9(宛抗棉9号)为典型的抗旱种质，基因型为单倍型“A”，Junmian 1(军棉1号)为敏旱种质，基因型为单倍型“ACTTTTCCCTG”。主要步骤如下：

引物设计：根据SEQ ID NO.1中GhPME26上游调控序列及标记位置，设计PCR引物，上游引物和下游引物的核苷酸序列(5’-3’)分别如下所示：

上游引物：ATAAATAAATAAAGTTGGAGGTC(见SEQ ID NO.2)；

下游引物：TCTTAAAATCAAATCCCATAGTA(见SEQ ID NO.5)。

基因组DNA提取：采用CTAB法提取Wankangmian 9和Junmian 1材料的基因组DNA。具体包括：取100mg新鲜棉花叶片置于2mL离心管中，加入干净的钢珠和200μL抽提缓冲液，置于磨样机(上海净信#Tissuelyser-192)上研磨60s，频率为60Hz；研磨结束后，添加800μLCTAB裂解液，65℃水浴裂解30min，向裂解后的样品中添加800μL氯仿，将样品翻转混匀5min以去除色素等杂质。12000rpm离心10min后，转移上清与等体积-20℃预冷的异丙醇混匀，置于-20℃沉淀2h，12000rpm离心1min，弃上清。沉淀加入1mL 75％乙醇进行漂洗，共漂洗两次，每次10min，离心弃上清，沉淀置于常温下自然干燥，用ddH₂O溶解DNA。

PCR扩增：取75-100ng基因组DNA作为模板进行PCR扩增，根据表3中的配方配置PCR扩增体系，同时根据表4中的程序进行PCR扩增。抽提缓冲液成分为：0.35M葡萄糖、0.1MTris-HCl、5mmol/LNa₂EDTA、2％(W/V)PVP K-30和0.1％(W/V)DIECA，pH值7.5，使用前加入0.2％β-巯基乙醇。CTAB裂解液成分为：0.1M Tris-HCl、1.4M NaCl、0.02MNa₂EDTA、2％CTAB、2％(W/V)PVPK-30和0.1％(W/V)DIECA，pH值8.0。

表3PCR扩增体系

表4PCR扩增程序

结果检测：将上述PCR扩增产物送公司进行Sanger测序，确认Indel分子标记在序列中的真实性，结果如图3所示，从上至下分别表示Junmian 1和Wankangmian 9在83253278bp处的基因型信息和测序峰图。

对测序峰图比对确认，Wankangmian 9在83253278bp物理位置处的基因型为A(抗旱基因型)；Junmian 1在83253278bp物理位置处的基因型为ACTTTTCCCTG(敏旱基因型)，由此确认Indel变异存在，可作为抗旱性分子标记用于区分抗旱棉花种质和敏旱棉花种质，并应用于分子标记辅助选择育种和培育新的棉花种质资源等领域。

2.2PCR检测引物序列设计

确定标记真实性后进行标记引物序列设计，设计如下两组引物，上游引物相同，下游引物分别包含Indel变异(下划线所示)和位于变异位点下游，两组引物序列如下：

上游引物：ATAAATAAATAAAGTTGGAGGTC(见SEQ ID NO.2)；

下游引物-1：TAGATTTATCAGGGAAAAGTAGAT(见SEQ ID NO.3)；

下游引物-2：TCTTAAAATCAAATCCCATAGTA(见SEQ ID NO.5)。

挑选两种基因型材料各5份进行分子标记扩增，其中敏旱材料(对干旱敏感型)为Nongken5、Lumian 12、Xinluzao 46、Keyi 181和Longmian 1；抗旱材料为Jinmian 33、Emian 1、Kezimian100、Sumian 6和Sumian 7。PCR扩增体系同表3，PCR扩增程序同表4。结果见图4，其中a图示出了使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示引物对扩增的PCR产物的测序结果，b图示出了SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对扩增的PCR产物的凝胶电泳图。

从图中可以看到，使用上游引物和下游引物-1扩增与上游引物和下游引物-2扩增分子标记的结果吻合，能够有效区分干旱敏感性和抗性材料，进一步对上游引物和下游引物-2扩增产物进行测序，测序结果显示与Indel分子标记序列吻合，说明该PCR引物可用。

在较佳的实施方式中，优选使用上游引物和下游引物-2组成的PCR引物对(SEQ IDNO.2-3)进行分子标记扩增，可以通过PCR扩增条带的有无来便捷地判断是否含有该Indel分子标记。具体而言，当可以特异性扩增出230bp带型的PCR产物条带时，待测棉花种质为敏旱棉花种质；当无法特异性扩增出条带或扩增得到的带型不含有230bp带型时，待测棉花种质为抗旱棉花种质。这种结果的呈现方式方便直观。

本实施例上游引物和下游引物-2组成的PCR引物对扩增的230bp带型产物所对应的序列(5’-3’)如下所示：

ATAAATAAATAAAGTTGGAGGTCTTTTTTTTAATTATTTTAATACAAGGACTAAATTTTAATTAAAGTACATAGACTAACAACATATTTTAATTATATATTAATCAGTTAGTTATGAATTTGAAATCATATTTTTAAATCATTTATGGTAAATTTCTTTGAAAGACGAAATTCTCCACCTTCTTCTATTCAATCAACCTCTTTGTTATCTACTTTTCCCT GATAAATCTA(见SEQ ID NO.4)，下划线部分为Indel变异。

3、自然群体水平验证分子标记的可靠性和通用性

采用上述确认的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示引物对扩增标记序列，选取抗旱材料和敏旱材料各42份，提取DNA，根据表3的PCR扩增体系和表4中的PCR扩增程序，在53℃退火温度下，对上述材料进行PCR扩增。扩增产物的凝胶电泳图见图5，其中，a图为敏旱棉花种质材料，b图为抗旱棉花种质材料，图中，星号表示扩增不明显或不特异的材料。

自然群体PCR结果显示，敏旱种质中可以扩增出条带的材料有37份，未扩增出明显特异性条带的材料有5份；抗旱种质中未扩增出明显特异性条带的材料有33份，扩增出目的条带的材料有9份。利用卡方检测发现抗旱材料和敏旱材料之间的扩增结果差异显著，p值为8.36E-10，表明扩增条带的有无与干旱抗性和敏性表型性状具有显著相关性。

综上所述，本发明所提供的Indel变异以及基于该Indel变异开发的PCR检测引物可以用于棉花干旱抗性的鉴定，当检测到待测棉花材料中该Indel变异位点为单倍型“A”，则其为抗旱种质，当检测到待测棉花材料中该Indel变异位点为单倍型“ACTTTTCCCTG”，则其为敏旱种质；由此将表型的判断转化为基因型的鉴定，实现从基因型水平快速鉴定或筛选抗旱种质，而且通过本实施例开发的PCR检测引物扩增该Indel变异，基因分型效果良好，为筛选棉花抗旱材料提供了便捷的方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的检测引物或试剂盒在陆地棉干旱抗性鉴定或育种中的应用，其特征在于，所述Indel变异位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第678位碱基，在抗旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为A，在敏旱棉花种质中，所述Indel变异的核苷酸为ACTTTTCCCTG。

2.根据权利要求1所述的检测位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的检测引物或试剂盒在陆地棉干旱抗性鉴定或育种中的应用，其特征在于，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的检测位于陆地棉GhPME26基因上游调控区域的Indel变异的检测引物或试剂盒在陆地棉干旱抗性鉴定或育种中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括所述检测引物，所述检测引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或如SEQ ID NO.5所示。

4.一种棉花干旱抗性的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用如SEQ ID NO.2-3所示的检测引物扩增待测棉花基因组DNA，得到PCR扩增产物，检测所述PCR扩增产物的条带有无；

当能够特异性扩增出230bp带型时，待测棉花种质为敏旱棉花种质；当无法特异性扩增出条带或扩增得到的带型不含有230bp带型时，待测棉花种质为抗旱棉花种质；其中，所述棉花为陆地棉。

5.根据权利要求4所述的棉花干旱抗性的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：10×缓冲液2.0μL、dNTPmix 0.4μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、基因组DNA 1μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL和无菌水16μL；其中，上游引物和下游引物的浓度为1-2mM，基因组DNA的浓度为3.75-5ng/μL；

所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，52-53℃退火30s，70-72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min。