CN108588235B

CN108588235B - 与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记及其应用

Info

Publication number: CN108588235B
Application number: CN201810463295.4A
Authority: CN
Inventors: 王继卿; 罗玉柱; 郝志云; 赵孟丽; 胡江; 刘秀; 李少斌
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: CN108588235A

Abstract

本发明提供与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记，其位于KRTAP20‑1基因上，存在四个优势基因型AA、AB、AC和BB；当山羊个体的基因型为AA时，它的产绒量和绒层高度最高；当山羊个体的基因型为BB时，它的产绒量和绒层高度最低。因此对子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度进行选种时，应选留AA基因型的个体，淘汰BB基因型的个体，以提高子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度。

Description

与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记及其应用。

背景技术

山羊绒指山羊被毛中直径在25μm及以下的毛纤维，是由山羊皮肤中的次级毛囊形成的无髓毛纤维。山羊绒细而柔软、光泽良好、保暖性能强，可用于制造各种针织品和纺织品，其经济价值远远高于普通羊毛。内蒙古、新疆、西藏、陕西、青海、甘肃、宁夏等省区是中国山羊绒的主产区。子午岭黑山羊是中国一个历史悠久的地方品种，以生产紫绒和西路黑猾子皮而著称，分布于甘肃省庆阳市和陕西省北部，对于黄土高原地区以及荒漠化、半荒漠化草场具有良好的适应性，具有登山爬坡和放牧采食能力强、抓膘能力和抗病力好、肉质鲜嫩等优点。但是子午岭黑山羊体格偏小，产绒量不高，羊绒品质一般。因此，采用传统育种和现代育种技术，提高个体的产绒量和绒品质，是当前子午岭黑山羊选育中的主要工作。

和羊毛一样，羊绒纤维的基本结构成分为角蛋白(Keratins)和角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins，KAPs；其编码基因标识为KRTAPs)，这2类蛋白直接决定了羊绒纤维的理化特性。KAPs蛋白中含有高含量的半胱氨酸或甘氨酸/酪氨酸残基。根据这一特性，KAPs蛋白可被分为3类，分别是：①高硫KAPs蛋白(high-sulfur KAPs，HS-KAPs，半胱氨酸的含量≤30％)；②超高硫KAPs蛋白(ultra-high-sulfur KAPs，UHS-KAPs，半胱氨酸的含量>30％)；③高甘氨酸/酪氨酸KAPs蛋白(high glycine/tyrosine KAPs，HGT-KAPs，甘氨酸和酪氨酸的含量占35～60％)。依据氨基酸序列相似性，KAPs能被进一步归类为蛋白家族。例如，KAP1–3、11、13、15–16和23–27是高硫KAPs蛋白家族，KAP4、5、9–10、12和17是超高硫KAPs蛋白家族，KAP6–8和18–22是高甘氨酸/酪氨酸KAPs蛋白家族。

迄今为止，在人类和绵羊上已分别鉴别出80和29个KRTAPs基因。然而，山羊中只鉴别出了11个KRTAPs基因。这表明大量的山羊KRTAPs基因还有待进一步鉴别。在已鉴别出的KRTAPs基因中，许多基因的多态性与绵、山羊的产绒(毛)性能显著相关。例如，在绒山羊中，KRTAP20-2基因AA型个体的产绒量和绒层高度显著高于AB和BB型个体。KRTAP13-1和KRTAP13-3基因的多态性与绒山羊的产绒量、羊绒直径和绒层高度显著相关；在绵羊上，KRTAP1-2、KRTAP6-1、KRTAP6-3、KRTAP8-2、KRTAP22-1和KRTAP26-1的核苷酸序列变异极显著(或显著)影响了羊毛的纤维性状(包括产毛量、羊毛直径、弯曲度、长度、回潮率等)。在新西兰和澳大利亚，一些高校和科研院所(如新西兰林肯大学)已将KRTAPs基因作为分子遗传标记用于绵羊羊毛育种实践中，即根据不同的KRTAPs基因型个体具有不同的羊毛性状这一原理，农场主根据KRTAPs的基因型(等位基因)，决定了羊只的选留或淘汰。上述研究表明，挖掘新的KRTAPs基因，以及研究基因的核苷酸序列变异对羊绒(毛)性状的影响具有重要的理论意义和重大的现实意义。

KRTAPs基因结构简单，只包含一个开放阅读框，没有内含子，长度约在600～1500bp之间。人类KAP20蛋白属于高甘氨酸/酪氨酸家族成员，由KAP20-1和KAP20-2两个成员构成。虽然KRTAP20-1(KAP20-1的编码基因)的特性已在人类中有相关描述，但该基因在家畜中尚未被鉴别出来，其核苷酸序列变异对生产性状的影响在所有动物中都未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了以子午岭黑山羊为研究对象，首先鉴别出山羊的KRTAP20-1基因，进而用RT-PCR法分析该基因的组织表达特性，最后研究基因的核苷酸序列变异与子午岭黑山羊羊绒性状的相关性，以期为子午岭黑山羊羊绒性状的遗传改良提供理论基础和指导。

本发明的第一个目的是提供与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记，其位于KRTAP20-1基因上，存在四个优势基因型AA、AB、AC和BB；当山羊个体的基因型为AA时，山羊的产绒量和绒层高度最高；当山羊个体的基因型为BB时，山羊的产绒量和绒层高度最低；

所述基因型AA，在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为G/G，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.^*11处为A/A和c.^*24处为C/C；

所述基因型AB，在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为G/T，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.^*11处为A/A和c.^*24处为C/C；

所述基因型AC，在KRTAP20-1基因c.18处为C/T，c.52处为G/G，c.105处为C/C，c.181处为G/A，c.^*11处为A/G和c.^*24处为C/T；

所述基因型BB，在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为T/T，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.^*11处为A/A和c.^*24处为C/C。

本发明的第二个目的是提供用于检测权利要求1所述的遗传标记的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-TCATATTCTGCAAGCAAAGGC-3'，

下游引物：5'-GCTGATGGGTCTCAGTCAC-3'。

本发明的第三个目的是提供用于检测子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度的试剂盒，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP20-1基因中位置c.18处，c.52处，c.105处，c.181处，c.^*11处和c.^*24处的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度的高和低。

作为优选，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP20-1基因中位置c.18处为C/C，c.52处为G/G，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.^*11处为A/A和c.^*24处为C/C的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述子午岭黑山羊具有高产绒量和高绒层高度。

作为优选，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP20-1基因中位置c.18处为C/C，c.52处为T/T，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.^*11处为A/A和c.^*24处为C/C的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述子午岭黑山羊具有低产绒量和低绒层高度。

作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP20-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-TCATATTCTGCAAGCAAAGGC-3'，

下游引物：5'-GCTGATGGGTCTCAGTCAC-3'。

本发明的第四个目的是提供上述遗传标记在鉴定子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度中的应用，所述应用包括以下步骤：

(1)提取待测子午岭黑山羊的基因组DNA；

(2)以待测子午岭黑山羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当基因型为AA时，山羊个体的产绒量和绒层高度最高；当基因型为BB时，山羊个体的产绒量和绒层高度最低；

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度性状进行判断。

本发明的第五个目的是提供上述遗传标记在选留高产绒量和高绒层高度、以及淘汰低产绒量和低绒层高度的子午岭黑山羊中的应用。

本发明公开的遗传标记能够用于鉴定子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度，能够用于选育高产绒量和高绒层高度的子午岭黑山羊。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为KRTAP20-1基因和7个以前鉴别的其它KRTAPs基因在山羊1号染色体上的位置。

图2为子午岭黑山羊KRTAP20-1基因的SSCP检测结果。

图3为基于氨基酸序列构建的山羊、绵羊和人类HGT-KAPs的系统进化树。

图4为KRTAP20-1和β-actin在子午岭黑山羊6种组织中的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

1材料与方法

1.1用于实验的子午岭黑山羊及羊绒性状测定

用于实验的子午岭黑山羊来自甘肃省庆阳市环县钰生绒山羊繁育有限责任公司。以11只子午岭黑山羊种公羊作为父本，采用人工授精方式对子午岭黑山羊母羊进行配种。在生产的后代羔羊中，随机选择406只健康无病、生长发育正常的子午岭黑山羊作为研究对象。当这些羔羊生长到周岁时，在梳绒季节(4月中旬—5月中旬)，现场测定产绒量，背中线处测定绒层高度。同时在背中线处采集山羊绒样本，用于实验室测定羊绒细度。对于测定羊绒性状的每一只子午岭黑山羊，颈静脉采血8ml，加入酸性柠檬酸葡萄糖(citric aciddextrose，ACD)抗凝，采用苯酚-氯仿法提取血液基因组DNA。

另外，选择3岁、健康无病、处于羊绒生长期的3只子午岭黑山羊母羊，屠宰以后立即采集肺脏、肾脏、次级毛囊、心脏、肝脏和背最长肌6个组织，并迅速置于液氮中，带回实验室放在-80℃冰箱中保存。

1.2子午岭黑山羊KRTAP20-1基因鉴别及多态性检测

1.2.1引物设计和PCR扩增

用GenBank的BLAST功能，以人类KRTAP20-1基因的编码区序列(GenBank登录号：NM_181615.2)作为比对对象，在山羊基因组GCF_001704415.1(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)中进行同源性搜索。在搜索结果中，与人类KRTAP20-1基因序列相似性最高的核苷酸片段被假定为山羊的KRTAP20-1基因序列。以该序列为模板，设计引物，在大连宝生物有限责任公司合成，扩增山羊KRTAP20-1基因的整个编码区序列。

上游引物是5'-TCATATTCTGCAAGCAAAGGC-3'，

下游引物是5'-GCTGATGGGTCTCAGTCAC-3'。

采用20μL体系进行PCR扩增，包括1.0μL的DNA模板(约50ng/μl)，2.0μL的10×PCRbuffer，各0.5μL的0.25μmol/L上下游引物，0.3μL的150μM dNTPs、0.2μL的0.5U Taq DNApolymerase和15.5μL的ddH₂O。

PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30s，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸5分钟。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。

1.2.2SSCP多态性检测

取0.7μL PCR产物加入7.0μL上样缓冲液(98％甲酰胺、10mM EDTA、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青)。95℃变性5分钟后立即置于冰水混合物中，上样于16×18cm、12％(Acr：Bis＝37.5：1)的聚丙烯酰胺凝胶中，在0.5×TBE、15℃(恒温)、200V电压条件下电泳17小时。电泳结束后对聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色。

1.3KRTAP20-1基因核苷酸序列变异分析

KRTAP20-1等位基因序列测定方法因纯合子和杂合子而异。如果子午岭黑山羊个体的基因型是纯合子，用PCR扩增产物直接测序；如果子午岭黑山羊个体的基因型是杂合子，按照Gong等描述的方法切胶测序。测序由北京华大基因测序有限公司完成。为保证测序结果的准确性，每个等位基因均选择3个不同的个体进行测序。

用DNAMAN 5.2.10软件进行核苷酸序列的比对和翻译，用GenBank的在线BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.goc/)搜索同源性。基于预测的氨基酸序列，用MEGA7.0构建进化树，置信度以1000次自展分析进行重复检验。

1.4KRTAP20-1基因的RT-PCR检测

按照天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒的说明书，提取子午岭黑山羊的肺脏、肾脏、次级毛囊、心脏、肝脏和背最长肌6种组织中的总RNA。用2％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。用Takara的PrimeScript^TM RT Reagent Kit(gDNA Eraser)生成cDNA。在KRTAP20-1基因编码区内设计特异性引物用于RT-PCR扩增，上游引物是5'-ATGGCTACTTCCGAGGTCTG-3'，下游引物是5'-GATGGGTCTCAGTCACGTGT-3'。以山羊的β-actin基因作为内参，其上游引物是5'-AGCCTTCCTTCCTGGGCATGGA-3'，下游引物是5'-GGACAGCACCGTGTTGGCGTAGA-3'。引物在大连宝生物有限责任公司合成。

PCR扩增体系为：0.8μL的cDNA，2.0μL的10×PCR buffer，各0.5μL的0.25μmol/L上下游引物，0.3μL的150μM dNTPs、0.2μL的0.5U Taq DNA polymerase和15.7μL的ddH₂O。RT-PCR的扩增条件与1.2.1一致。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增效果。

1.5相关性分析

对于频率大于5％的KRTAP20-1基因型，采用SPSS(20.0)软件的一般线性混合效应模型(General Liner Mixed-effect Models，GLMMs)分析基因型对子午岭黑山羊羊绒性状(产绒量、细度和绒层高度)的影响。相关性分析结果表明，性别和父本(配种公羊)对羊绒性状有极显著的影响(P<0.01)，出生等级(单羔和双羔)对羊绒性状没有显著影响(P>0.05)。因此在GLMMs模型中，基因型和性别作为固定效应，父本作为随机效应。由于所有子午岭黑山羊均在同一饲养管理条件下饲养，其羊绒性状均在周岁时被测定，因此在模型中没有考虑环境和年龄因素。分析模型如下：

Y＝μ+Genotype+Gender+Sire+e

其中，Y为羊绒性状表型值，μ为群体均值，Genotype为基因型，Gender为性别，Sire为父本(配种公羊)，e为随机误差。

2结果

2.1子午岭黑山羊KRTAP20-1基因鉴别及核苷酸序列变异分析

以人类KRTAP20-1基因编码区序列(GenBank登录号：NM_181615.2)作为比对序列，应用GenBank的BLAST程序在山羊基因组GCF_001704415.1中进行同源性搜索。结果显示，在山羊1号染色体上(nt3625577_3625768)发现了一个192bp的开放阅读框片段，这个片段与人类KRTAP20-1基因的编码区序列有72％的同源性。该片段周围分布有以前鉴别的7个KRTAPs基因，它们分别是KRTAP11-1、KRTAP7-1、KRTAP8-1、KRTAP8-2、KRTAP20-2、KRTAP13-1和KRTAP13-3(图1)。

图1为KRTAP20-1基因和7个以前鉴别的其它KRTAPs基因在山羊1号染色体上的位置。其中，竖线代表KRTAPs基因的位置，竖线下的数字代表基因的名字(例如11-1表示KRTAP11-1)。箭头代表基因转录的方向。

经PCR-SSCP分析，在406只子午岭黑山羊中共鉴别出A、B、C和D 4个等位基因(图2)。BLAST比对显示，4个等位基因的核苷酸序列与山羊基因组GCF_001704415.1的序列有99％的相似性。

图2为子午岭黑山羊KRTAP20-1基因的SSCP检测结果。

基于所有山羊、绵羊和人类已鉴别的HGT-KAPs的氨基酸序列，构建了系统进化树。结果显示，这4个等位基因编码的氨基酸序列与人类的KAP20-1序列首先聚为一枝，说明它们之间具有最高的序列同源性(图3)。基于与山羊基因组的高度同源性以及系统进化树结果，表明这4个等位基因就是山羊KRTAP20-1基因的等位基因。

图3为基于氨基酸序列构建的山羊、绵羊和人类HGT-KAPs的系统进化树。分支上的数字表示自展值。山羊、绵羊和人类的KAPs分别用符号g、s和h表示。进化树中用到的其它KAPs及其GenBank登录号分别是sKAP6-1(NM_001193399)、sKAP6-2(KT725832)、hKAP6-1(AP001708)、hKAP6-2(NM_181604)、hKAP6-3(AP001708)、sKAP6-3(KT725837)、sKAP6-4(KT725840)、sKAP6-5(KT725845)、gKAP7-1(AY510121)、sKAP7-1(X05638)、hKAP7-1(NM_181606)、gKAP8-1(AY510122)、sKAP8-1(X05639)、hKAP8-1(NM_175857)、gKAP8-2(AY510123)、sKAP8-2(KF220646)、hKAP19-1(NM_181607)、hKAP19-3(NM_181609)、hKAP19-4(NM_181610)、hKAP19-5(NM_181611)、hKAP19-6(NM_00130312)、hKAP19-7(NM_181614)、hKAP20-1(NM_181615)、hKAP20-2(NM_181616)、gKAP20-2(MF973462)、hKAP21-1(NM_181619)、hKAP21-2(NM_181617)、sKAP22-1(KX377616)和hKAP22-1(NM_181620)。

测序结果表明，4个等位基因中存在6个SNPs，分别是c.18C/T，c.52G/T，c.105C/T，c.181G/A，c.^*11A/G和c.^*24C/T。其中4个SNPs(c.18C/T，c.52G/T，c.105C/T和c.181G/A)位于KRTAP20-1基因的编码区内，c.52G/T和c.181G/A分别引起了p.Gly18Cys和p.Gly61Ser氨基酸的改变，见下述核苷酸序列及表1。

表1子午岭黑山羊KRTAP20-1基因的SNPs

1.SNPs和氨基酸的顺序和书写格式遵循了HGVS的命名规则(http://varnomen.hgvs.org/)。

等位基因为A的核苷酸序列为：

TCATATTCTGCAAGCAAAGGCTTTGCTCTCTTCTACATCTTTAACACTTGACAAGATGAGCTATTACTACAGCAACTACTACGGTGGCCTGGGCTATGGCCTTGGCGGTCTGGGCTGCAACTATGGCTGTGGCTATGGCTACTTCCGAGGTCTGGGCTGCGGCTATGGTGCTGGCTATGGTGGCTATGGATATGGCTGCTACCGCCCGTGTTACTATGGAAGATACTGGTCCTCTGGCTTCTACTGAGAAACCCTGCACTCAAACTTACACGTGACTGAGACCCATCAGC

等位基因为B的核苷酸序列为：

TCATATTCTGCAAGCAAAGGCTTTGCTCTCTTCTACATCTTTAACACTTGACAAGATGAGCTATTACTACAGCAACTACTACGGTGGCCTGGGCTATGGCCTTGGCTGTCTGGGCTGCAACTATGGCTGTGGCTATGGCTACTTCCGAGGTCTGGGCTGCGGCTATGGTGCTGGCTATGGTGGCTATGGATATGGCTGCTACCGCCCGTGTTACTATGGAAGATACTGGTCCTCTGGCTTCTACTGAGAAACCCTGCACTCAAACTTACACGTGACTGAGACCCATCAGC

等位基因为C的核苷酸序列为：

TCATATTCTGCAAGCAAAGGCTTTGCTCTCTTCTACATCTTTAACACTTGACAAGATGAGCTATTACTACAGTAACTACTACGGTGGCCTGGGCTATGGCCTTGGCGGTCTGGGCTGCAACTATGGCTGTGGCTATGGCTACTTCCGAGGTCTGGGCTGCGGCTATGGTGCTGGCTATGGTGGCTATGGATATGGCTGCTACCGCCCGTGTTACTATGGAAGATACTGGTCCTCTAGCTTCTACTGAGAAACCCTGCGCTCAAACTTACATGTGACTGAGACCCATCAGC

等位基因为D的核苷酸序列为：

TCATATTCTGCAAGCAAAGGCTTTGCTCTCTTCTACATCTTTAACACTTGACAAGATGAGCTATTACTACAGCAACTACTACGGTGGCCTGGGCTATGGCCTTGGCGGTCTGGGCTGCAACTATGGCTGTGGCTATGGCTACTTCCGAGGTCTGGGCTGTGGCTATGGTGCTGGCTATGGTGGCTATGGATATGGCTGCTACCGCCCGTGTTACTATGGAAGATACTGGTCCTCTGGCTTCTACTGAGAAACCCTGCACTCAAACTTACACGTGACTGAGACCCATCAGC

上述核苷酸序列中，加粗、并用下划线表示的碱基为SNPs。

在406只子午岭黑山羊中，共检测到AA、AB、AC、BB和AD 5种基因型，它们的基因型频率分别是54.68％、16.26％、13.79％、12.81％和2.46％。A、B、C和D 4个等位基因的频率分别为70.94％、20.93％、6.90％和1.23％。

2.2KRTAP20-1基因的RT-PCR分析

RT-PCR用于检测KRTAP20-1基因在子午岭黑山羊肺脏、肾脏、次级毛囊、心脏、肝脏和背最长肌6个组织中的表达。结果表明，KRTAP20-1基因在次级毛囊中高度表达，但在肺脏、肾脏、心脏、肝脏和背最长肌5个组织中均不表达(图4)。

图4为KRTAP20-1和β-actin在子午岭黑山羊6种组织中的RT-PCR检测结果。M：marker；1：次级毛囊；2：心脏；3：肝脏；4：肺脏；5：肾脏；6：背最长肌。

2.3KRTAP20-1基因型对子午岭黑山羊羊绒性状的影响

相关性分析结果表明，产绒量与绒层高度有中等(0.3<|r|≤0.7)的正相关(r＝0.470)；羊绒细度与产绒量和绒层高度的表型相关性系数分别为0.269和0.210，显示了微弱的(|r|≤0.3)正相关(表2)。性别和父本对子午岭黑山羊的产绒量、细度和绒层高度有极显著影响(P<0.01)，出生等级对羊绒性状没有显著影响(P>0.05)。因此，应用一般线性混合效应模型研究KRTAP20-1基因多态性对子午岭黑山羊羊绒性状的影响时，性别作为固定效应，父本作为随机效应，在模型中没有考虑出生等级。

表2子午岭黑山羊3种羊绒性状的表型相关性

在406只子午岭黑山羊上发现的5种基因型中，AA、AB、AC和BB 4种基因型为优势基因型，它们的频率均大于5％，AD的频率小于5％，因此分析了AA、AB、AC和BB 4种基因型之间，子午岭黑山羊羊绒性状的差异。结果表明，基因型对子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度有明显影响，但对羊绒细度没有影响。AA基因型个体的产绒量分别较AB和BB基因型个体高27g和49g(P<0.001)，AA基因型个体的绒层高度较BB基因型个体高0.2cm(P＝0.023)(表3)。

表3KRTAP20-1基因型对子午岭黑山羊羊绒性状的影响

4结论

KRTAP20-1的基因型对子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度有极显著或显著影响。AA基因型个体的产绒量较BB基因型个体高49g(P<0.001)，AA基因型个体的绒层高度较BB基因型个体高0.2cm(P＝0.023)。因此，对子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度进行选种时，应选留基因型为AA的个体，淘汰基因型为BB的个体，以提高子午岭黑山羊的产绒量。

实施例2

子午岭黑山羊产绒量和绒层高度检测试剂盒，包括：

1、引物对

上游引物：5'-TCATATTCTGCAAGCAAAGGC-3'，

下游引物：5'-GCTGATGGGTCTCAGTCAC-3'。

2、PCR检测试剂

PCR扩增采用20μL体系，包括1.0μL的DNA模板(约50ng/μl)，2.0μL的10×PCRbuffer，各0.5μL的0.25μmol/L上下游引物，0.3μL的150μM dNTPs、0.2μL的0.5U Taq DNApolymerase和15.5μL的ddH₂O。

3、阳性对照

阳性对照A：序列表SEQ ID No.1中的核苷酸序列；

阳性对照B：序列表SEQ ID No.2中的核苷酸序列；

阳性对照C：序列表SEQ ID No.3中的核苷酸序列；

阳性对照D：序列表SEQ ID No.4中的核苷酸序列。

该试剂盒的使用方法参照实施例1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的遗传标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 1

tcatattctg caagcaaagg ctttgctctc ttctacatct ttaacacttg acaagatgag 60

ctattactac agcaactact acggtggcct gggctatggc cttggcggtc tgggctgcaa 120

ctatggctgt ggctatggct acttccgagg tctgggctgc ggctatggtg ctggctatgg 180

tggctatgga tatggctgct accgcccgtg ttactatgga agatactggt cctctggctt 240

ctactgagaa accctgcact caaacttaca cgtgactgag acccatcagc 290

<210> 2

<211> 290

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 2

tcatattctg caagcaaagg ctttgctctc ttctacatct ttaacacttg acaagatgag 60

ctattactac agcaactact acggtggcct gggctatggc cttggctgtc tgggctgcaa 120

ctatggctgt ggctatggct acttccgagg tctgggctgc ggctatggtg ctggctatgg 180

tggctatgga tatggctgct accgcccgtg ttactatgga agatactggt cctctggctt 240

ctactgagaa accctgcact caaacttaca cgtgactgag acccatcagc 290

<210> 3

<211> 290

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 3

tcatattctg caagcaaagg ctttgctctc ttctacatct ttaacacttg acaagatgag 60

ctattactac agtaactact acggtggcct gggctatggc cttggcggtc tgggctgcaa 120

ctatggctgt ggctatggct acttccgagg tctgggctgc ggctatggtg ctggctatgg 180

tggctatgga tatggctgct accgcccgtg ttactatgga agatactggt cctctagctt 240

ctactgagaa accctgcgct caaacttaca tgtgactgag acccatcagc 290

<210> 4

<211> 290

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 4

tcatattctg caagcaaagg ctttgctctc ttctacatct ttaacacttg acaagatgag 60

ctattactac agcaactact acggtggcct gggctatggc cttggcggtc tgggctgcaa 120

ctatggctgt ggctatggct acttccgagg tctgggctgt ggctatggtg ctggctatgg 180

tggctatgga tatggctgct accgcccgtg ttactatgga agatactggt cctctggctt 240

ctactgagaa accctgcact caaacttaca cgtgactgag acccatcagc 290

Claims

1.一种与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的分子标记物组，其特征在于：是由如下等位基因所示的核酸所组成的组合物；

1）等位基因A：如序列表中SEQ ID No：1所示的核酸；

2）等位基因B：如序列表中SEQ ID No：2所示的核酸；

3）等位基因C：如序列表中SEQ ID No：3所示的核酸；

4）等位基因D：如序列表中SEQ ID No：4所示的核酸；

所述分子标记物位于黑山羊的KRTAP20-1基因上；四个由所述等位基因组成的基因型AA、AB、AC和BB为优势基因型；当山羊个体的基因型为AA时，它的产绒量和绒层高度最高；当山羊个体的基因型为BB时，它的产绒量和绒层高度最低；

所述基因型AA在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为G/G，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.*11处为A/A和c.*24处为C/C；

所述基因型AB在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为G/T，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.*11处为A/A和c.*24处为C/C；

所述基因型AC在KRTAP20-1基因c.18处为C/T，c.52处为G/G，c.105处为C/C，c.181处为G/A，c.*11处为A/G和c.*24处为C/T；

所述基因型BB在KRTAP20-1基因c.18处为C/C，c.52处为T/T，c.105处为C/C，c.181处为G/G，c.*11处为A/A和c.*24处为C/C。

2.权利要求1所述的与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的分子标记物组在鉴定子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

（1）提取待测子午岭黑山羊的基因组DNA；

（2）以待测子午岭黑山羊的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；

（3）设置权利要求1所述的分子标记物组为阳性对照，对PCR扩增产物进行鉴定，当基因型为AA时，山羊个体的产绒量和绒层高度最高；当基因型为BB时，山羊个体的产绒量和绒层高度最低；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度性状进行判断。

4.权利要求1所述的与子午岭黑山羊的产绒量和绒层高度相关的分子标记物组在选留高产绒量和高绒层高度、以及淘汰低产绒量和低绒层高度的子午岭黑山羊中的应用，其特征在于：设置权利要求1所述的分子标记物组为阳性对照。