CN107034281B - 与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记，其位于KRTAP15‑1基因上，具体的核苷酸序列包括序列表中SEQ ID No.1；在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，等位基因为A时，羊毛较细；等位基因为B时，羊毛较粗。本发明还提供上述遗传标记在甘肃高山细毛羊分子标记辅助育种中的应用。本发明以甘肃高山细毛羊为研究对象，首先利用生物信息学技术鉴定绵羊的KRTAP15‑1基因，进而利用PCR‑SSCP方法研究该基因的核苷酸序列变异和氨基酸特征，最后探讨了基因多态性对甘肃高山细毛羊羊毛性状的影响，以期为甘肃高山细毛羊的遗传改良提供理论基础和指导。

Description

与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记及其应用
技术领域
本发明属于基因工程及分子生物学技术领域，具体涉及与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记及其应用。
背景技术
甘肃高山细毛羊是甘肃省1981年培育而成的毛肉兼用细毛羊品种，属于绵羊的一种，主要分布于祁连山高寒牧区的肃南裕固族自治县和天祝藏族自治县，现存栏量约200多万只，是当地农牧民赖以生存的主要生活资料和生产资料。甘肃高山细毛羊成年公、母羊的剪毛量为8.5kg和4.4kg，主体细度为18.1～23μm，净毛率为43～45%。虽然甘肃高山细毛羊毛用性能良好，但与优质细毛羊品种的生产性能相比，还有较大差距。例如世界最著名的细毛羊品种澳洲美利奴，成年公、母羊的剪毛量为8～14kg和4.5～6.3kg，细度为17～23μm，净毛率为60～70%。这对甘肃省细毛羊育种和生产工作提供了更高的要求，但也反映出甘肃高山细毛羊的毛用性能有较大的遗传改良空间，凸显了科技对于细毛羊产业的支撑作用。
羊毛性状是重要的经济性状，包括产毛量、细度、弯曲度、断裂强度、伸度、净绒率等多个指标，其中产毛量和细度是2个最重要的指标。羊毛性状受到遗传因素和非遗传因素的影响。虽然产毛量和细度属于中等遗传力性状，但也属于不能早期度量以及度量难度较大、成本较高的性状，因此，利用常规育种方法（表型选择+后裔测定）对羊毛性状的改良难以在短期内取得良好效果。分子标记辅助选择是改良此类性状的有效方法，可以明显缩短世代间隔，达到“早选、准选”目的，但前提是寻找到调控绵羊羊毛性状的关键基因或与之相连锁的分子遗传标记。
角蛋白（Keratins）和角蛋白关联蛋白（Keratin-associated proteins，KAPs）是羊毛纤维的主要蛋白成分，约占羊毛重量的90%。角蛋白聚集成束形成8～10 nm的纤维细丝，即角蛋白中间丝（Keratin intermediate filaments，KIFs），KAPs通过大量的二硫键交联形成一个半刚性基质嵌入到KIFs的半胱氨酸残基中，从而形成羊毛纤维的主体结构。因此，KAPs蛋白在羊毛纤维中发挥了重要作用，决定了它的理化特性。目前为止，已在人类中鉴定出超过80个KAPs蛋白质的编码基因KRTAPs基因和25个基因家族。KRTAPs基因结构简单，长度较小。它只包含一个开放阅读框，没有内含子，长度约在600～1500bp之间。研究表明，已鉴别的所有KRTAPs基因都有多态性，且核苷酸序列变异影响了绵羊的羊毛用性状。例如，Wang等在11号染色体中离KRTAPs基因约30MB的位置上发现了影响绵羊卷曲度的QTL。在制毯光泽（Felting lustre）突变毛囊中，KRTAP6-1、KRTAP7-1和KRTAP8-1基因的表达明显下调，而KRTAP2-12和KRTAP4-2基因的表达明显上调。Parson等报道KRTAP6基因的核苷酸变异显著影响了美利奴羊的平均纤维直径。Roldan等在包含KRTAP6基因的区域内，检测到影响美利奴羊毛弯曲度和产毛量的一个QTL。Zhou等进一步发现KRTAP6-1基因的序列变异与羊毛纤维直径显著相关（P<0.05），一个57-bp的核苷酸删除引起了羊毛细度变细，即拥有这个突变的绵羊有较大的纤维直径标准误、纤维直径变异系数和较差的手感。在绵羊半同胞家族中，Iteege-Mweza等发现KRTAP1-1基因的多态性明显影响了绵羊的产毛量、毛丛长度和光泽度（P<0.05）。同时，KRTAP1-2的多态性与绵羊的净毛重和污毛重密切相关。
鉴于KAPs蛋白在羊毛纤维中的重要作用，以及编码基因KRTAPs与羊毛性状的高度相关性，KRTAPs基因可以作为研究绵羊羊毛性状的重要候选基因。但是与人类相比，绵羊中只有11个KRTAPs基因家族（包含27个基因）被鉴别出来。这说明大量的绵羊KRTAPs基因有待鉴别和分离，例如人类和小鼠中已描述了KRTAP15-1基因及其编码蛋白KAP15-1的序列特征、表达特点和遗传特征，但该基因在绵山羊中尚未被鉴别出来。
因此，本发明以甘肃高山细毛羊为研究对象，首先利用生物信息学技术鉴定绵羊的KRTAP15-1基因，进而利用PCR-SSCP方法研究该基因的核苷酸序列变异和氨基酸特征，最后探讨基因多态性对甘肃高山细毛羊羊毛性状的影响，以期为甘肃高山细毛羊的遗传改良提供理论基础和指导。
发明内容
本发明的目的是提供与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记及其应用。
本发明的第一个目的是提供与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记，其位于KRTAP15-1基因上，具体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；
在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，其编码区存在6个SNPs：c.133A/G、c.171C/T、c.229C/T、c.245T/C、c.323G/A和c.339T/C；等位基因为A时，羊毛较细；等位基因为B时，羊毛较粗；
所述等位基因A为：在序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为C，第245处的碱基为T，第323处的碱基为G，第339处的碱基为T；
所述等位基因B为：在序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为T，第245处的碱基为C，第323处的碱基为A，第339处的碱基为C。
本发明的第二个目的是提供用于检测上述的与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：
5'-GAACTCAGGAATCCCAACAG-3；
5'-TAACCATGAGGTGACTGGAG-3。
本发明的第三个目的是提供上述遗传标记在鉴定甘肃高山细毛羊羊毛细度中的应用，所述应用包括以下步骤：
（1）提取待测羊的基因组DNA；
（2）以待测羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增产物，如果扩增序列的开放阅读框区中，等位基因为A，羊毛较细；等位基因为B，羊毛较粗；
所述等位基因A为：在序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为C，第245处的碱基为T，第323处的碱基为G，第339处的碱基为T；
所述等位基因B为：在序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为T，第245处的碱基为C，第323处的碱基为A，第339处的碱基为C。
作为优选，步骤（2）中，所述PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：DNA模板1.0μL（约50ng/μl）、10 × PCR buffer 2.0μL、上下游引物各0.5μL、150μM dNTPs 0.3μL、0.5UTaqDNA polymerase 0.2μL和ddH2O 15.5μL。
作为优选，步骤（2）中，所述PCR反应的条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸5分钟。
作为优选，步骤（3）中，所述检测PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的羊毛细度性状进行判断。
步骤（3）中，也可以用其他方法来检测PCR扩增产物，比如直接进行测序，并不限于本发明中所述方法。
本发明的第四个目的是提供含有上述的引物对的用于检测甘肃高山细毛羊羊毛细度的试剂盒。
本发明的第五个目的是提供与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记在甘肃高山细毛羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明以甘肃高山细毛羊为研究对象，首先利用生物信息学技术鉴定绵羊的KRTAP15-1基因，进而利用PCR-SSCP方法研究该基因的核苷酸序列变异和氨基酸特征，最后探讨了基因多态性对甘肃高山细毛羊羊毛性状的影响，以期为甘肃高山细毛羊的遗传改良提供理论基础和指导。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为甘肃高山细毛羊KRTAP15-1（方框）和已鉴定的11个KRTAPs基因在绵羊1号染色体上的位置；
图2为甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的PCR-SSCP检测结果；
图3为基于KRTAPs基因的核苷酸序列构建的NJ树。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1 材料与方法
1.1实验材料
在天祝县松山镇明星养殖专业合作社，以5只甘肃高山细毛羊种公羊为父本，甘肃高山细毛羊为母本，采用人工授精方式配种。后代中选择286只甘肃高山细毛周岁羊只，现场测定产毛量，在背中线处采集羊毛样本用于实验室测定细度和毛长。每只羊颈静脉采血8ml，加入酸性柠檬酸葡萄糖（citric acid dextrose，ACD）抗凝，-20℃冻存，用于基因组DNA提取。
Figure 596841DEST_PATH_IMAGE001
基因组DNA提取
采用常规的苯酚-氯仿法提取血液基因组DNA。
Figure 184817DEST_PATH_IMAGE002
绵羊基因组生物信息学分析
以山羊KRTAP15-1基因的编码区序列作为模板（GenBank登录号：AY510116.1），应用GenBank的BLAST程序在绵羊基因组V3.1（http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/）中进行同源性搜索。搜索结果中，同源性最高的绵羊基因序列被假定为甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的编码区序列。
Figure 575216DEST_PATH_IMAGE003
引物设计和PCR扩增
根据假定的甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因序列，设计引物，扩增甘肃高山细毛羊该基因的编码区和侧翼调控区序列。两对引物分别是5'-GAACTCAGGAATCCCAACAG-3'（OAR1:123496812_123496793）和5'-TAACCATGAGGTGACTGGAG-3（OAR1:123496318_123496337）。引物由大连宝生物有限责任公司合成。
PCR扩增采用20μL体系，包括DNA模板1.0μL（约50ng/μl）、10×PCR buffer 2.0μL、上下游引物各0.5μL、150μM dNTPs 0.3μL、0.5U TaqDNA polymerase 0.2μL和ddH2O 15.5μL。
PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸5分钟。
PCR扩增结果用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
Figure 135510DEST_PATH_IMAGE004
甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的SSCP多态性检测
取0.7μL PCR产物加入7μL上样缓冲液（98%甲酰胺、10mM EDTA、0.025%甲酰胺和0.025%二甲苯青）。95℃变性5分钟后立即置于冰水混合物中，上样于16×18 cm、10%（Acr：Bis=37.5：1）的聚丙烯酰胺凝胶中，在0.5×TBE、15℃（恒温）、250V电压条件下电泳19小时。电泳结束后采用Byun等的方法对聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色。
Figure 923468DEST_PATH_IMAGE005
等位基因序列测定
凝胶银染显色后判定个体的基因型，测序方法因纯合子和杂合子而异。如果个体的SSCP条带是纯合子，用PCR扩增产物直接测序。如果SSCP条带是杂合子，按照Gong等描述的方法切胶测序。序列测定由上海生工生物有限公司完成，每种基因型均选择3个不同的绵羊个体进行测序，以确保测序结果的准确性。
Figure 936424DEST_PATH_IMAGE006
序列分析
用DNAMAN（V 5.2.10）软件进行核苷酸序列的比对和翻译；用POPGENE（V 3.2）计算用Hardy-Weinberg平衡；用GenBank的在线BLAST软件（http://www.ncbi.nlm.nih.goc/）搜索同源性；用NetPhos 2.0在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测多肽链中潜在的磷酸化位点。
用MEGA（V 4.0）构建邻接进化树（Neighbor-Joining, NJ），NJ树的置信度以1000次自展分析进行重复检验。用于构建进化树的序列包括本发明获得的甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的4条等位基因序列，GenBank下载的人（NM_181623.1）、山羊（AY510116.1）、野牛（XM_010855855.1）和兔子（XM_002716683.2）的KRTAP15-1基因序列，以及绵羊其它的高硫KRTAPs基因序列，包括KRTAP1-1（NM_001159760.1）、KRTAP1-2（HQ897975）、KRTAP1-3（NM_001159761.1）、KRTAP2-3（U60024）、KRTAP3-1（M21099）、KRTAP3-2（M21100）、KRTAP3-3（M21103）、KRTAP11-1（HQ595352）、KRTAP13-3（JN377429）和KRTAP24-1（JX112014）。
Figure 475988DEST_PATH_IMAGE007
相关性分析
采用SPSS（20.0）软件的一般线性混合效应模型（General Liner Mixed-effectModels，GLMMs）分析频率大于5%的等位基因的状态（存在或缺失）和基因型对甘肃高山细毛羊羊毛性状（产毛量、细度和毛长）的影响。相关性分析表明，性别和父本（配种公羊）对羊毛性状有极显著的影响（P<0.01），出生等级（单羔和双羔）对羊毛性状没有显著影响（P>0.05）。因此在模型中，等位基因状态（或基因型）和性别作为固定效应，父本作为随机效应。由于所有甘肃高山细毛羊的羊毛性状均在周岁时被测定，且在天祝县松山镇同一环境条件下饲养，因此在模型中没有考虑年龄和环境因素。
等位基因状态对羊毛性状影响的研究模型：Y=μ + Allele + Gender + Sire +e
基因型对羊毛性状影响的研究模型：Y=μ + Genotype + Gender + Sire +e
其中，Y为羊毛性状表型值，μ为群体均值，Allele为等位基因状态（用0和1分别表示缺失和存在），Genotype为基因型，Gender为性别，Sire为父本（配种公羊），e为随机误差。
Figure 172680DEST_PATH_IMAGE008
结果
2.1 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的鉴定和核苷酸序列变异检测
以山羊KRTAP15-1基因的编码区序列作为模板（GenBank登录号：AY510116.1），应用GenBank的BLAST程序在绵羊基因组V3.1中进行同源性搜索。结果显示，在绵羊1号染色体上发现了一个包含411bp开放阅读框（OAR1：123496381_123496791；E=0）的片段，这个片段与山羊KRTAP15-1基因有98%的序列同源性。同源性最高的绵羊基因序列被假定为甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的编码区序列。11个以前被鉴定的绵羊KRTAPs基因也分布在这个片段附近。从着丝粒着丝点开始，这些基因依次是KRTAP11-1、KRTAP7-1、KRTAP8-1、KRTAP8-2、KRTAP6-5、KRTAP6-2、KRTAP6-4、KRTAP6-1、KRTAP6-3、鉴定的KRTAP15-1、KRTAP13-3和KRTAP24-1（图1）。
图1为假定的甘肃高山细毛羊KRTAP15-1（方框）和已鉴定的11个KRTAPs基因在绵羊1号染色体上的位置；其中，加粗的竖线代表KRTAPs基因，箭头代表转录方向，箭头下的数值代表KRTAPs基因的名称（例如11.1代表KRTAP11-1），基因间的空格代表基因在绵羊基因组V3.1中的距离。
经PCR扩增和测序，得到包含开放阅读框的495bp的扩增片段，与目的大小一致。495bp的扩增片段在绵羊基因组V3.1中的位置为123496318—123496812，开放阅读框的位置为123496381—123496791；经SSCP分析，在286只甘肃高山细毛羊中，鉴定出A、B、C和D 4个带型（图2）。BLAST比对显示，4个带型对应的核酸序列之间有所差别，但它们与绵羊基因组V3.1的序列同源性均在95%以上。
图2为甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的PCR-SSCP检测结果。
NJ进化树显示，这4个带型对应的核酸序列与已鉴定出的绵羊KRTAPs基因有较低的同源性（没有聚为一支），但与山羊、人类、野牛和兔子的KRTAP15-1基因有最高的序列同源性（首先与这些物种的KRTAP15-1基因聚为一支）（图3）。根据与绵羊基因组的高度同源性以及系统进化树结果，这4个带型对应的核酸序列是甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的等位基因，它们被录入GenBank中，序列号为KX817979-KX817982。
图3为基于KRTAPs基因的核苷酸序列构建的NJ树。
Figure 692392DEST_PATH_IMAGE009
甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因的SNPs
测序结果表明，4个等位基因在411bp的编码区内存在6个SNPs：c.133A/G、c.171C/T、c.229C/T、c.245T/C、c.323G/A和c.339T/C。其中c.133A/G、c.229C/T、c.245T/C和c.323G/A是非同义突变，它们分别导致了p.Thr45Ala、p.Pro77Ser、p.Phe82Ser和p.Ser108Asn的氨基酸改变，详见下述序列和表1。
表1 绵羊KRTAP15-1基因的SNPs
Figure 946305DEST_PATH_IMAGE010
注：SNPs参照人类基因组突变学会（HGVS）制定的规则命名（http://www.hgvs.org/mutnomen/）； SNPs的位置指变异位点在KRTAP15-1基因CDS编码区中的位置，如c.133A/G指KRTAP15-1基因CDS编码区中的第133个核苷酸发生了A/G变异。
当等位基因为表1中的A时，包含开放阅读框的495bp的扩增片段的核苷酸序列为：
Figure 507868DEST_PATH_IMAGE011
其中，CDS编码区的核苷酸序列为：
Figure 26442DEST_PATH_IMAGE012
当等位基因为表1中的B时，CDS编码区的核苷酸序列为：
Figure 671050DEST_PATH_IMAGE013
当等位基因为表1中的C时，CDS编码区的核苷酸序列为：
Figure 924177DEST_PATH_IMAGE014
当等位基因为表1中的D时，CDS编码区的核苷酸序列为：
Figure 695955DEST_PATH_IMAGE015
其中，下划线标注部分为等位基因中发生的SNPs。
Figure 600195DEST_PATH_IMAGE016
氨基酸序列分析
甘肃高山细毛羊KRTAP15-1基因编码含有136个氨基酸的多肽链。这条多肽链含有高含量的丝氨酸（20.59～21.32mol%），中等含量的甘氨酸（11.03mol%）、苯丙氨酸（8.82～9.56mol%）、苏氨酸（7.35～8.09 mol%）和半胱氨酸（7.35 mol%），其它氨基酸的含量较低。4条多肽链的等电点均为8.36，它们有14～17个潜在的磷酸化位点。
Figure 478021DEST_PATH_IMAGE017
KRTAP15-1等位基因和基因型在甘肃高山细毛羊中的频率
在286只甘肃高山细毛羊中，共鉴别出A、B、C和D 4种等位基因，它们的频率分别为77.97%、15.21%、5.95%和0.87%。存在8种基因型，其中优势基因型为AA、AB、BB和AC，它们的频率分别为67.83%、12.23%、8.04%和6.99%；其余基因型BC、CC、AD和DD的频率之和仅为4.91%。
Figure 234756DEST_PATH_IMAGE018
甘肃高山细毛羊3种羊毛性状间的表型相关性
由表2可知，剪毛量与羊毛细度和毛长呈极显著正相关（P<0.01），羊毛细度与毛长无相关性（P>0.05）。
表2甘肃高山细毛羊3种羊毛性状间的表型相关性
Figure 574339DEST_PATH_IMAGE019
注：**表示P<0.01。
Figure 818239DEST_PATH_IMAGE020
KRTAP15-1基因多态性与甘肃高山细毛羊羊毛性状的相关性分析
相关性分析结果表明，性别和父本对甘肃高山细毛羊的剪毛量、细度和毛长有极显著影响（P<0.01），出生等级对羊毛性状没有显著影响（P>0.05）（表3）。因此，应用一般线性混合效应模型研究KRTAP15-1基因多态性对甘肃高山细毛羊羊毛性状的影响时，性别作为固定效应，父本作为随机效应，模型中没有考虑出生等级。
表3 性别、父本和出生等级对甘肃高山细毛羊羊毛性状的影响
Figure 820961DEST_PATH_IMAGE021
注：表格数字为P值，** P<0.01。
在甘肃高山细毛羊上发现的8种基因型中，AA、AB、BB和AC的基因型频率大于5%，其余4种基因型的频率均小于5%。因此，比较了这4个基因型之间的羊毛性状差异。结果显示，基因型对甘肃高山细毛羊的剪毛量和毛长没有显著影响（P>0.05），但对细度有极显著影响（P<0.01）。4个基因型个体间的羊毛细度大小顺序为BB>AB>AC>AA，其中BB基因型个体的细度较AB基因型高0.8μm（P<0.05），较AC和AA基因型分别高2.2和2.5μm（P<0.01）；AB基因型个体的细度分别较AC和AA基因型高1.4和1.7μm（P<0.01）；AC和AA基因型个体之间的细度无显著差异（P>0.05）（表4）。
表4 KRTAP15-1基因型与甘肃高山细毛羊羊毛性状的相关性
Figure 783101DEST_PATH_IMAGE022
注：同行不同大、小写字母分别表示差异极显著（P<0.01）或显著（P<0.05），无字母表示差异不显著（P>0.05）。
在甘肃高山细毛羊上发现的4个等位基因中，等位基因A、B和C的频率均大于5%，等位基因D的频率小于5%，因此分析了前三个等位基因的存在或缺失对羊毛性状的影响（表5）。结果表明，3个等位基因对剪毛量和毛长均没有显著影响（P>0.05），等位基因A和B对细度有极显著影响，等位基因C对细度没有显著影响（P>0.05）。含有等位基因A的个体的细度较缺失等位基因A的个体低2.3um（P<0.01），含有等位基因B的个体的细度较缺失等位基因B的个体高2.0um（P<0.01）。等位基因对甘肃高山细毛羊羊毛细度的影响结果与基因型结果一致。
表5 KRTAP15-1等位基因与甘肃高山细毛羊羊毛性状的相关性
Figure DEST_PATH_IMAGE023
3 结论
KRTAP15-1的基因型和等位基因对甘肃高山细毛羊的细度有极显著影响（P<0.01），4个基因型个体间的羊毛细度大小顺序为BB>AB>AC>AA。含有等位基因A的个体的细度较缺失等位基因A的个体低2.3um（P<0.01），含有等位基因B的个体的细度较缺失等位基因B的个体高2.0um（P<0.01）。因此，对甘肃高山细毛羊的羊毛细度进行选种时，应选留含有AA和AC基因型的个体，淘汰含有等位基因B的个体，以减低甘肃高山细毛羊的细度。
实施例2
甘肃高山细毛羊羊毛细度检测试剂盒，包括：
1、引物对
5'- GAACTCAGGAATCCCAACAG-3；
5'-TAACCATGAGGTGACTGGAG-3。
2、PCR检测试剂
PCR扩增采用20μL体系，包括DNA模板1.0μL（约50ng/μl）、10 × PCR buffer 2.0μL、上下游引物各0.5μL、150μM dNTPs 0.3μL、0.5U TaqDNA polymerase 0.2μL和ddH2O15.5μL。
3、阳性对照
阳性对照A：将序列表SEQ ID No.1中的核苷酸序列；
阳性对照B：将序列表SEQ ID No.1的等位基因换成表1中的B；
阳性对照C：将序列表SEQ ID No.1的等位基因换成表1中的C；
阳性对照D：将序列表SEQ ID No.1的等位基因换成表1中的D。
该试剂盒的使用方法参照实施例1。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记及其应用
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1核苷酸序列
<400> 1
gaactcagga atcccaacag catgtctttc aactgtagca cgggaaactt ctcccgttcc 60
cttggaggtt acttgggagt cccagtttcc acctgtgatt ctttctaccc cagcaatgtt 120
gtctactccc ccagcacttt ccagctgggc tccactctct acagtgactg tcaggagaac 180
ttctttaggc ccgtcagctt ccagacaccc tgtgctgtga ccagatcttt ccagacatcc 240
tgctcccatc cacagaattt catcttccgc agtccctgcc agacaattta cactggatct 300
ctagggtctg gaaatattgg ccttgggtct tttggttgtg gaagtactgg cttccagtct 360
ctgggctgtg gatccaactt ctgctcccca acgtacgttt cctccaggag ttgccggtca 420
tcttattact aaccagcctt tagctcacgc ttttgtgaat caactttctg aaggactcca 480
gtcacctcat ggtta 495
<210> 2
<211> 411
<212> DNA
<213> 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1的等位基因A
<400> 2
atgtctttca actgtagcac gggaaacttc tcccgttccc ttggaggtta cttgggagtc 60
ccagtttcca cctgtgattc tttctacccc agcaatgttg tctactcccc cagcactttc 120
cagctgggct ccactctcta cagtgactgt caggagaact tctttaggcc cgtcagcttc 180
cagacaccct gtgctgtgac cagatctttc cagacatcct gctcccatcc acagaatttc 240
atcttccgca gtccctgcca gacaatttac actggatctc tagggtctgg aaatattggc 300
cttgggtctt ttggttgtgg aagtactggc ttccagtctc tgggctgtgg atccaacttc 360
tgctccccaa cgtacgtttc ctccaggagt tgccggtcat cttattacta a 411
<210> 3
<211> 411
<212> DNA
<213> 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1的等位基因B
<400> 3
atgtctttca actgtagcac gggaaacttc tcccgttccc ttggaggtta cttgggagtc 60
ccagtttcca cctgtgattc tttctacccc agcaatgttg tctactcccc cagcactttc 120
cagctgggct ccactctcta cagtgactgt caggagaact tctttaggcc cgtcagcttc 180
cagacaccct gtgctgtgac cagatctttc cagacatcct gctcccattc acagaatttc 240
atctcccgca gtccctgcca gacaatttac actggatctc tagggtctgg aaatattggc 300
cttgggtctt ttggttgtgg aaatactggc ttccagtccc tgggctgtgg atccaacttc 360
tgctccccaa cgtacgtttc ctccaggagt tgccggtcat cttattacta a 411
<210> 4
<211> 411
<212> DNA
<213> 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1的等位基因C
<400> 4
atgtctttca actgtagcac gggaaacttc tcccgttccc ttggaggtta cttgggagtc 60
ccagtttcca cctgtgattc tttctacccc agcaatgttg tctactcccc cagcactttc 120
cagctgggct ccgctctcta cagtgactgt caggagaact tctttaggcc cgtcagcttc 180
cagacaccct gtgctgtgac cagatctttc cagacatcct gctcccattc acagaatttc 240
atctcccgca gtccctgcca gacaatttac actggatctc tagggtctgg aaatattggc 300
cttgggtctt ttggttgtgg aaatactggc ttccagtccc tgggctgtgg atccaacttc 360
tgctccccaa cgtacgtttc ctccaggagt tgccggtcat cttattacta a 411
<210> 5
<211> 411
<212> DNA
<213> 甘肃高山细毛羊KRTAP15-1的等位基因D
<400> 5
atgtctttca actgtagcac gggaaacttc tcccgttccc ttggaggtta cttgggagtc 60
ccagtttcca cctgtgattc tttctacccc agcaatgttg tctactcccc cagcactttc 120
cagctgggct ccactctcta cagtgactgt caggagaact tctttaggcc tgtcagcttc 180
cagacaccct gtgctgtgac cagatctttc cagacatcct gctcccatcc acagaatttc 240
atcttccgca gtccctgcca gacaatttac actggatctc tagggtctgg aaatattggc 300
cttgggtctt ttggttgtgg aagtactggc ttccagtctc tgggctgtgg atccaacttc 360
tgctccccaa cgtacgtttc ctccaggagt tgccggtcat cttattacta a 411

Claims (5)

1.与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记在鉴定甘肃高山细毛羊羊毛细度中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：
（1）提取待测羊的基因组DNA；
（2）以待测羊的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增；
（3）检测PCR扩增产物，如果扩增序列的开放阅读框区中，等位基因为A，羊毛较细；等位基因为B，羊毛较粗；
所述遗传标记位于KRTAP15-1基因上，具体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1；
在序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列中，其编码区存在6个SNPs：c.133A/G、c.171C/T、c.229C/T、c.245T/C、c.323G/A和c.339T/C；
所述等位基因A为：在序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为C，第245处的碱基为T，第323处的碱基为G，第339处的碱基为T；
所述等位基因B为：在序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列中，第133bp处的碱基为A，第171bp处的碱基为C，第229bp处的碱基为T，第245处的碱基为C，第323处的碱基为A，第339处的碱基为C；
所述引物对为：
5'-GAACTCAGGAATCCCAACAG-3；
5'-TAACCATGAGGTGACTGGAG-3。
2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述PCR反应使用的扩增体系以20μL 计为：DNA 模板 1.0μL、10×PCR buffer 2.0μL、上下游引物各0.5μL、150μMdNTPs 0.3μL、0.5U TaqDNA polymerase 0.2μL 和 ddH2O 15.5μL。
3.根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述 PCR 反应的条件为：
94℃预变性 2 分钟，94℃变性 30 秒，60℃退火 30 秒，72℃延伸 30 秒，共 35 个循环，最后延伸 5 分钟。
4.根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述检测 PCR 扩增产物采用 SSCP 检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到 SSCP 电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的羊毛细度性状进行判断。
5.权利要求1所述与甘肃高山细毛羊羊毛细度相关的遗传标记在甘肃高山细毛羊羊毛细度分子标记辅助育种中的应用。
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