CN110527731A

CN110527731A - 与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用

Info

Publication number: CN110527731A
Application number: CN201910773114.2A
Authority: CN
Inventors: 王继卿; 刘秀; 罗玉柱; 李少斌; 胡江; 杨雄; 赵孟丽
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2019-08-21
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明提供与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其特征在于：其位于KRTAP28‑1基因上，具有A、B、C和D四个优势等位基因，所述等位基因A、B、C和D的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.1‑SEQ ID No.4所示；含有等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最大。本发明公开的遗传标记能够用于鉴定子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小，能够用于选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的子午岭黑山羊。

Description

与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用。

背景技术

山羊绒是由山羊皮肤中的次级毛囊形成的无髓毛纤维，纤维直径小于等于25.0μm。山羊绒具有细而柔软、保暖性能强、表面光滑等优点，它的价格通常远高于羊毛和马海毛，被称为“软黄金”。中国山羊绒产量居世界第一，其总产量的1/3-1/2被出口到世界各地。甘肃省是中国绒山羊的传统养殖区域之一，分布有河西绒山羊、子午岭黑山羊和中卫山羊等优良品种资源。子午岭黑山羊是我国一个历史悠久的地方山羊品种，以生产紫绒和西路猾子皮而著称，甘肃省庆阳市是其主产区之一。子午岭黑山羊的被毛由外层的粗毛和内层纤细的绒毛组成，具有放牧采食能力强、对黄土高原干旱和半干旱生态环境适应性强等优点，但是体格较小、产绒量不高(成年公羊和母羊的产绒量分别为313和152g)，羊绒品质一般。同时由于缺乏系统的选育计划，子午岭黑山羊群体内的生产性能变异较大，如部分个体的羊绒纤维直径在14.0μm左右，但也有一部分个体的羊绒纤维直径超过了16.5μm。因此，急需制定细致的育种计划，综合应用传统育种、现代分子育种等技术，加强本品种选育力度，提高羊群的整齐度，增加产绒量，改善羊绒品质(主要是降低羊绒纤维直径)，以此提高子午岭黑山羊的生产性能。

和羊毛一样，羊绒纤维成分的90％以上由角蛋白(Keratins)和角蛋白关联蛋白(Keratin-associatedproteins，KAPs；其编码基因为KRTAPs)组成，这两类蛋白共同决定了羊绒纤维的理化特性。角蛋白聚集成束形成角蛋白中间丝(Keratin intermediatefilaments，KIFs)，KAPs通过大量的二硫键交联形成一个半刚性基质嵌入到KIFs的半胱氨酸残基中，从而形成羊绒纤维的主体结构。

KAPs蛋白的结构中含有高含量的半胱氨酸或甘氨酸/酪氨酸残基。根据其氨基酸组成，KAPs蛋白可被分为三类，分别是：(1)高硫KAPs蛋白(high-sulfurKAPs，HS-KAPs，半胱氨酸的含量≤30％)；(2)超高硫KAPs蛋白(ultra-high-sulfur KAPs，UHS-KAPs，半胱氨酸的含量大于30％)；(3)高甘氨酸/酪氨酸KAPs蛋白(high glycine/tyrosine KAPs，HGT-KAPs，甘氨酸和酪氨酸的含量占35～60％)。根据氨基酸序列的同源性，KAPs蛋白能被进一步分类为不同的家族。

与人类和绵羊相比，山羊基因组中的KRTAPs研究严重滞后。例如，在人类基因组中，已至少发现了来自25个基因家族的80多个KRTAPs基因；在绵羊基因组中，已发现了来自13个基因家族的29个KRTAPs基因。然而，在山羊基因组中，目前只挖掘出了来自10个基因家族的13个KRTAPs基因。这表明，山羊基因组中还有大量的KRTAPs基因有待进一步鉴定。在已鉴定的山羊KRTAPs基因中，已发现KRTAP8-2、KRTAP13-1、KRTAP20-1、KRTAP20-2和KRTAP24-1基因的核苷酸序列变异显著或极显著影响了绒山羊的羊绒纤维直径、产绒量、绒层高度、纤维长度等羊绒纤维性状。在新西兰和澳大利亚，一些高校和科研院所(如新西兰林肯大学)已将KRTAPs基因作为分子遗传标记用于绵山羊的育种实践中。这表明在绒山羊分子育种实践中，鉴定新的山羊KRTAPs基因、以及研究这类基因的核苷酸序列变异对羊绒纤维性状的影响具有重要意义，这将为绒山羊的分子遗传改良提供理论依据和指导。

KRTAP28-1基因编码的KAP28-1蛋白属于高硫角蛋白关联蛋白。有学者已研究了绵羊KRTAP28-1基因的多态性及其对羊毛性状的影响，结果发现绵羊的KRTAP28-1基因中存在8个SNPs，该基因的基因型与绵羊的羊毛纤维直径显著相关(P<0.05)。然而，在山羊基因组中至今尚未挖掘出该基因。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记。

本发明提供与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其位于KRTAP28-1基因上，具有A、B、C和D四个优势等位基因，所述等位基因A、B、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.4；含有等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最大；

所述等位基因A为：在KRTAP28-1基因c.-8处为A，c.17处为G，c.129处为T，c.166处为C，c.190处为A，c.*6处为A，c.*39处为C，c.*71处为G，c.*102处为T，c.*103处为G，c.*104处为T，c.*105处为G，c.*108处为C，c.*112处为C，c.*113处为G；

所述等位基因B为：在KRTAP28-1基因c.-8处为G，c.17处为A，c.129处为T，c.166处为C，c.190处为A，c.*6处为G，c.*39处为T，c.*71处为C，c.*102处为T，c.*103处为G，c.*104处删除了T，c.*105处删除了G，c.*108处为T，c.*112处为T，c.*113处为G；

所述等位基因C为：在KRTAP28-1基因c.-8处为A，c.17处为A，c.129处为A，c.166处为T，c.190处为G，c.*6处为G，c.*39处为C，c.*71处为T，c.*102处为T，c.*103处为G，c.*104处删除了T，c.*105处删除了G，c.*108处为C，c.*112处为C，c.*113处为A；

所述等位基因D为：在KRTAP28-1基因c.-8处为G，c.17处为A，c.129处为T，c.166处为C，c.190处为A，c.*6处为G，c.*39处为T，c.*71处为C，c.*102处为T，c.*103处为G，c.*104处删除了T，c.*105处删除了G，c.*108处为T，c.*112处为C，c.*113处为G。

本发明提供用于检测上述的与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记的引物对，所述引物对为：

上游引物：5′-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3′；

下游引物：5′-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3′。

本发明提供用于检测子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小的试剂盒，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP28-1基因中位置c.-8处，c.17处，c.129处，c.166处，c.190处，c.*6处，c.*39处，c.*71处，c.*102处，c.*103处，c.*104处，c.*105处，c.*108处，c.*112处，c.*113处的多态性位点；

b、由步骤a的结果预测所述子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小。

作为优选，所述试剂盒构造成能够：

a、由核酸样本确定KRTAP28-1基因中位置c.-8处为A，c.17处为G，c.129处为T，c.166处为C，c.190处为A，c.*6处为A，c.*39处为C，c.*71处为G，c.*102处为T，c.*103处为G，c.*104处为T，c.*105处为G，c.*108处为C，c.*112处为C，c.*113处为G的多态性位点；

作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP28-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5′-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3′；

下游引物：5′-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3′。

本发明提供与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记在鉴定子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小中的应用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取子午岭黑山羊血液中的基因组DNA；

(2)以子午岭黑山羊基因组DNA为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，当山羊个体含有等位基因A时，其羊绒纤维直径最小；当山羊个体不含有等位基因A时，其羊绒纤维直径最大；

所述等位基因A的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。

作为优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

本发明提供上述遗传标记在选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的子午岭黑山羊中的应用。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

(1)提取子午岭黑山羊血液中的基因组DNA；

(3)对PCR扩增产物进行鉴定，选留含有等位基因A的子午岭黑山羊，淘汰含有等位基因B、C或D的子午岭黑山羊；

所述等位基因A、B、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ IDNo.4；

作为进一步优选，步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

本发明公开的遗传标记能够用于鉴定子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小，能够用于选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的子午岭黑山羊。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为KRTAPs基因在山羊1号染色体上的位置。

图2为山羊KRTAP28-1基因的PCR-SSCP检测结果。

图3为基于已鉴定的所有山羊、绵羊和人类高硫KAPs的氨基酸序列构建的系统进化树。

图4为山羊KRTAP28-1基因中5个等位基因的核苷酸序列比较结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

在环县世强黑山羊繁育有限责任公司，以11只子午岭黑山羊种公羊作为父本，采用人工授精方式对子午岭黑山羊母羊进行配种。在所产后代中，随机选择385只健康无病、生长发育正常的子午岭黑山羊，待其周岁时，采用梳绒法现场测定产绒量，背中线处测定绒层高度。并在背中线处采集羊绒样本，带回实验室测定平均纤维直径。对于测定了羊绒性状的所有子午岭黑山羊，每只羊颈静脉采血8ml，加入酸性柠檬酸葡萄糖(citric aciddextrose，ACD)抗凝，-20℃冻存，用于基因组DNA提取。

1.2基因组DNA提取

采用常规的苯酚-氯仿法提取血液基因组DNA。

1.3山羊基因组中寻找KRTAP28-1基因

以绵羊KRTAP28-1基因序列作为模板，应用GenBank的BLAST程序在山羊基因组GCF_001704415.1(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)中进行同源性搜索。搜索结果中，与绵羊KRTAP28-1基因同源性最高的山羊序列被假定为山羊的KRTAP28-1基因序列。

1.4山羊KRTAP28-1基因的PCR-SSCP分析

根据同源性搜索获得的序列，设计引物，扩增子午岭黑山羊的KRTAP28-1基因。上游引物是5′-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3′，下游引物是5′-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3′。引物由大连宝生物有限责任公司合成。

采用20μL体系扩增PCR，包括1.0μL DNA模板(约50ng/μl)、各0.25μL的0.25μmol/L上下游引物、0.2μL的0.5U TaqDNA polymerase、2.0μL的10×PCRbuffer、0.3μL的150μMdNTPs和16.0μL的ddH₂O。PCR扩增条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸5分钟。PCR扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

取0.7μL PCR产物，加入7μL上样缓冲液(98％甲酰胺、10mM EDTA、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青)，95℃变性5分钟后立即置于冰水混合物中，上样于16×18cm、12％(Acr：Bis＝37.5：1)的聚丙烯酰胺凝胶中，在0.5×TBE、17.5℃(恒温)、300V电压条件下电泳20小时。电泳结束后，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染显色，判定每一个样本的基因型。

1.5山羊KRTAP28-1基因的等位基因序列测定和序列分析

测序方法因纯合子和杂合子而异。如果个体的基因型是纯合子，用PCR扩增产物直接测序；如果某个等位基因无纯合子个体，全部以杂合子形式存在，则按照Gong等描述的方法切胶测序。序列测定由上海生工生物有限公司完成。为保证测序结果的准确性，每种基因型均选择3个不同的个体进行测序。

用DNAMAN(V 5.2.10)软件进行核苷酸序列的比对和翻译，用MEGA(V 7.0)构建系统进化树。

1.6相关性分析

在子午岭黑山羊上发现的KRTAP28-1等位基因中，只分析了频率大于5％的等位基因对子午岭黑山羊羊绒性状的影响。对于频率小于5％的等位基因，则未进行相关性分析。

采用SPSS(20.0)软件的一般线性混合效应模型(General LinerMixed-effectModels，GLMMs)，分析了KRTAP28-1基因的优势等位基因状态(存在或缺失)对子午岭黑山羊羊绒性状(产绒量、羊绒纤维直径和绒层高度)的影响。为了确定建模的因素，分析了性别、父本(配种公羊)和出生等级(单羔和双羔)对羊绒性状的影响。结果表明，性别和父本(配种公羊)对羊绒性状有极显著的影响(P<0.01)，出生等级(单羔和双羔)对羊绒性状没有显著影响(P>0.05)。因此在GLMMs模型中，等位基因和性别作为固定效应，父本作为随机效应。由于所有的子午岭黑山羊均饲养于同一条件，且都在周岁时测定羊绒性状，因此在模型中没有考虑环境和年龄因素。分析模型如下：

Y＝μ+Allele+Gender+Sire+e

其中，Y为羊绒性状表型值，μ为群体均值，Allele为等位基因状态(用0和1分别表示缺失和存在)，Gender为性别，Sire为父本(配种公羊)，e为随机误差。

2结果

2.1鉴定子午岭黑山羊的KRTAP28-1基因

以绵羊的KRTAP28-1基因序列作为模板，应用GenBank的BLAST程序在山羊基因组GCF_001704415.1中进行同源性搜索。结果显示，在山羊1号染色体上有一个与绵羊KRTAP28-1基因序列相似性高达95.07％的片段，这个片段包含了一个255bp的开放阅读框。该片段周围分布有11个以前鉴定的KRTAPs基因，它的上游分布有KRTAP11-1，KRTAP7-1，KRTAP8-1，KRTAP8-2，KRTAP6-2，KRTAP20-2，KRTAP20-1，KRTAP15-1，KRTAP13-1和KRTAP13-3基因，它的下游分布有KRTAP24-1基因。12个基因在山羊1号染色体上的具体位置见图1，图1中竖线代表KRTAPs基因的位置，竖线下的数字代表基因的名字(例如28-1表示KRTAP28-1)。

应用SSCP方法，在385只子午岭黑山羊中共检测出A、B、C、D和E 5个等位基因(图2)。BLAST比对显示，5个等位基因之间的核苷酸序列有所差别，但它们与山羊基因组GCF_001704415.1的序列同源性均在97％以上。

基于在绵羊、人类和山羊中已鉴别的所有高硫KAP蛋白的氨基酸序列，构建了系统进化树(图3)。图3中，分支上的数字表示自展值，山羊、绵羊和人类的KAPs序列分别用字母g、s和h表示。构建系统发育树所用到的KAPs序列及其GenBank/EMBL登录号分别是gKAP1-4(JN012101.1)、gKAP3-1(NM_001285774)、gKAP11-1(NM_001285767.1)、gKAP13-1(AY510115)、gKAP13-3(JX426138)、gKAP24-1(MG996011)、sKAP1-1和sKAP1-4(X01610)、sKAP1-2(HQ897973)、sKAP1-3(X02925)、sKAP2-1(P02443)、sKAP2-3(P02441)、sKAP3-1(P02446)、sKAP3-2(P02444)、sKAP3-3(P02445)、sKAP11-1(HQ595347)、sKAP13-3(JN377429)、sKAP15-1(KX817979)、sKAP24-1(J X112014)、sKAP26-1(KX644903)、sKAP28-1(MN053915)、hKAP1-1(NM_030967.2)、hKAP1-3(NM_030966.1)、hKAP1-4(NM_001257305.1)、hKAP1-5(NM_031957.1)、hKAP2-1(NM_001123387.1)、hKAP2-2(NM_033032.2)、hKAP2-3(NM_001165252.1)、hKAP2-4(NM_033184.3)、hKAP3-1(NM_031958.1)、hKAP3-2(NM_031959.2)、hKAP3-3(NM_033185.2)、hKAP11-1(NM_175858.2)、hKAP13-1(NM_181599.2)、hKAP13-2(NM_181621.3)、hKAP13-3(NM_181622.1)、hKAP13-4(NM_181600.1)、hKAP15-1(NM_181623.1)、hKAP16-1(NM_001146182.1)、hKAP23-1(NM_181624.1)、hKAP24-1(NM_001085455.2)、hKAP25-1(NM_001128598.1)、hKAP26-1(NM_203405.1)和hKAP27-1(NM_001077711.1)。

进化树结果显示，A、B、C、D和E 5个等位基因所编码的氨基酸序列与绵羊的KAP28-1序列有最高的同源性(首先与绵羊的KAP28-1序列聚为一支)，这表明本研究鉴定的5个等位基因就是山羊KRTAP28-1基因的等位基因。

2.2子午岭黑山羊KRTAP28-1基因的核苷酸序列变异

5个等位基因的核苷酸序列分别为：

等位基因A的序列为：

GCTTATCTGAAATTTTTGCTTCACATTCTACTATGTCATCCAACGACCGCTGTTCTGGAAACAATGACTCTTGTTCATTTGGGAGTTATTGCCATGTTCCTGTCACCTCATTCACTACTCTCTACTTTACTGGTGTAAACTATGGTGATGCTTTTGACTTTTTCAGCCGAAACAAAACCTGGCTTCTGGACAACTCCCCAGAGACACGTGACAAGCTTTCCAGCTACCAACCATCCAGCTGTGAGCACACAACCTATAAAACTTCACACTACTCTTCCACCACTTAACTGTGACCACAGGTCCTATGAGCAACTGGTTCTTTCCCCGTTAGTTCGCATTTCTCCAGTTCTTGTCAACGGTCAATGCATAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCACGTGCGCACATGTGCGCGCACACTCAGTCATGTCCAACTCTTTGTAACCCCATGAACTGTAGCCTGCCAGGCTCCTCTGTCCATGA

等位基因B的序列为：

GCTTATCTGAAATTTTTGCTTCACGTTCTACTATGTCATCCAACGACCACTGTTCTGGAAACAATGACTCTTGTTCATTTGGGAGTTATTGCCATGTTCCTGTCACCTCATTCACTACTCTCTACTTTACTGGTGTAAACTATGGTGATGCTTTTGACTTTTTCAGCCGAAACAAAACCTGGCTTCTGGACAACTCCCCAGAGACACGTGACAAGCTTTCCAGCTACCAACCATCCAGCTGTGAGCACACAACCTATAAAACTTCACACTACTCTTCCACCACTTAACTGTGGCCACAGGTCCTATGAGCAACTGGTTCTTTCCCTGTTAGTTCGCATTTCTCCAGTTCTTGTCAACCGTCAATGCATAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGTGTGCACATGTGCGCGCACACTCAGTCATGTCCAACTCTTTGTAACCCCATGAACTGTAGCCTGCCAGGCTCCTCTGTCCATGA

等位基因C的序列为：

GCTTATCTGAAATTTTTGCTTCACATTCTACTATGTCATCCAACGACCACTGTTCTGGAAACAATGACTCTTGTTCATTTGGGAGTTATTGCCATGTTCCTGTCACCTCATTCACTACTCTCTACTTTACTGGTGTAAACTATGGTGATGCTTTTGACTTATTCAGCCGAAACAAAACCTGGCTTCTGGACAACTCCTCAGAGACACGTGACAAGCTTTCCGGCTACCAACCATCCAGCTGTGAGCACACAACCTATAAAACTTCACACTACTCTTCCACCACTTAACTGTGGCCACAGGTCCTATGAGCAACTGGTTCTTTCCCCGTTAGTTCGCATTTCTCCAGTTCTTGTCAACTGTCAATGCATAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCACGTGCACACATGTGCGCGCACACTCAGTCATGTCCAACTCTTTGTAACCCCATGAACTGTAGCCTGCCAGGCTCCTCTGTCCATGA

等位基因D的序列为：

GCTTATCTGAAATTTTTGCTTCACGTTCTACTATGTCATCCAACGACCACTGTTCTGGAAACAATGACTCTTGTTCATTTGGGAGTTATTGCCATGTTCCTGTCACCTCATTCACTACTCTCTACTTTACTGGTGTAAACTATGGTGATGCTTTTGACTTTTTCAGCCGAAACAAAACCTGGCTTCTGGACAACTCCCCAGAGACACGTGACAAGCTTTCCAGCTACCAACCATCCAGCTGTGAGCACACAACCTATAAAACTTCACACTACTCTTCCACCACTTAACTGTGGCCACAGGTCCTATGAGCAACTGGTTCTTTCCCTGTTAGTTCGCATTTCTCCAGTTCTTGTCAACCGTCAATGCATAATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGTGCGCACATGTGCGCGCACACTCAGTCATGTCCAACTCTTTGTAACCCCATGAACTGTAGCCTGCCAGGCTCCTCTGTCCATGA

等位基因E的序列为：

GCTTATCTGAAATTTTTGCTTCACATTCTACTATGTCATCCAACGACCGCTGTTCTGGAAACAATGACTCTTGTTCATTTGGGAGTTATTGCCATGTTCCTGTCACCTCATTCACTACTCTCTACTTTACTGGTGTAAACTATGGTGATGCTTTTGACTTTTTCAGCCGAAACAAAACCTGGCTTCTGGACAACTCCTCAGAGACACGTGACAAGCTTTCCGGCTACCAACCATCCAGCTGTGAGCACACAACCTATAAAACTTCACACTACTCTTCCACCACTTAACTGTGGCCACAGGTCCTATGAGCAACTGGTTCTTTCCCCGTTAGTTCGCATTTCTCCAGTTCTTGTCAACTGTCAATGCATAATGTGTGTGTGTGTGTGTGCACGTGCACACATGTGCGCGCACACTCAGTCATGTCCAACTCTTTGTAACCCCATGAACTGTAGCCTGCCAGGCTCCTCTGTCCATGA

测序结果表明，5个等位基因之间存在15个SNPs(图4)。图4中PCR扩增的引物序列用横线表示，序列中的“-”符号表示与等位基因A的序列一致。KRTAP28-1基因中，CDS区的碱基序列用大写字母表示，非编码区的碱基序列用小写字母表示。图中注释了15个SNPs位点以及非同义突变。起始密码子ATG和终止密码子TAA用方框显示。

在15个SNPs中，1个SNP(c.-8A/G)位于5′-UTR区域，10个SNPs(c.*6A/G、c.*39C/T、c.*71G/C/T、c.*102delT、c.*103delG、c.*104delT、c.*105delG、c.*108C/T、c.*112C/T和c.*113G/A)位于3′-UTR区域，剩余4个SNPs(c.17G/A、c.129T/A、c.166C/T和c.190A/G)位于CDS区域。这4个CDS区域的SNPs都属于非同义突变，它们分别引起了p.Arg6His、p.Phe43Leu、p.Pro56Ser和p.Ser64Gly氨基酸的改变。

表1子午岭黑山羊KRTAP28-1基因的SNPs

1.SNPs和氨基酸的顺序和书写格式遵循了HGVS的命名规则(http://varnomen.hgvs.org/)。

2.3子午岭黑山羊中KRTAP28-1的等位基因和基因型频率

在385只子午岭黑山羊中，等位基因A的频率最高，为40.52％。等位基因B、C、D和E的频率分别为24.03％，19.35％，14.03％和2.07％。这5种等位基因共构成11种基因型，这些基因型及其频率分别为AA(20.52％)、AB(16.62％)、BB(6.75％)、AC(16.10％)、BC(7.27％)、CC(4.16％)、AD(7.27％)、BD(6.49％)、CD(7.01％)、DD(3.65％)和BE(4.16％)。

2.4 KRTAP28-1基因核苷酸序列变异对子午岭黑山羊羊绒性状的影响

在子午岭黑山羊上发现的5个等位基因中，由于等位基因E的频率小于5％，因此在相关性分析中，只分析了优势等位基因A、B、C和D的存在(缺失)对子午岭黑山羊羊绒性状的影响。

KRTAP28-1等位基因对子午岭黑山羊羊绒性状的影响结果见表2。由表2可知，等位基因B、C和D对羊绒性状无显著影响(P>0.05)，而等位基因A对羊绒纤维直径有极显著影响(P<0.01)。含有等位基因A的个体的羊绒纤维直径较缺失等位基因A的个体低0.2μm。

表2 KRTAP28-1等位基因对子午岭黑山羊羊绒性状的影响

3结论

KRTAP28-1等位基因对子午岭黑山羊的羊绒纤维直径有极显著影响(P<0.01)，含有等位基因A的个体的羊绒纤维直径较缺失等位基因A的个体低0.2μm。因此，在对子午岭黑山羊进行分子选种时，应选留含有等位基因A的个体，以减低子午岭黑山羊的羊绒纤维直径。

实施例2

本发明的子午岭黑山羊的羊绒纤维直径检测PCR-SSCR试剂盒包括：

1、引物对

上游引物：5′-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3′

下游引物：5′-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3′。

2、PCR反应体系

20μL PCR反应体系为：1.0μL DNA模板(约50ng/μl)、各0.25μL的0.25μmol/L上下游引物、0.2μL的0.5U TaqDNA polymerase、2.0μL的10×PCRbuffer、0.3μL的150μM dNTPs和16.0μL的ddH₂O。

3、SSCP上样变性缓冲液

包括98％甲酰胺、10mM EDTA、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青。

4、标准样

标准样A：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1；

标准样B：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.2。

标准样C：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3。

标准样D：其核苷酸序列为序列表SEQ ID No.4。

DNA模板的获得方法以及试剂盒的使用方法参照实施例1。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> 与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 480

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 1

gcttatctga aatttttgct tcacattcta ctatgtcatc caacgaccgc tgttctggaa 60

acaatgactc ttgttcattt gggagttatt gccatgttcc tgtcacctca ttcactactc 120

tctactttac tggtgtaaac tatggtgatg cttttgactt tttcagccga aacaaaacct 180

ggcttctgga caactcccca gagacacgtg acaagctttc cagctaccaa ccatccagct 240

gtgagcacac aacctataaa acttcacact actcttccac cacttaactg tgaccacagg 300

tcctatgagc aactggttct ttccccgtta gttcgcattt ctccagttct tgtcaacggt 360

caatgcataa tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgcacgtgcg cacatgtgcg cgcacactca 420

gtcatgtcca actctttgta accccatgaa ctgtagcctg ccaggctcct ctgtccatga 480

<210> 2

<211> 478

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 2

gcttatctga aatttttgct tcacgttcta ctatgtcatc caacgaccac tgttctggaa 60

acaatgactc ttgttcattt gggagttatt gccatgttcc tgtcacctca ttcactactc 120

tctactttac tggtgtaaac tatggtgatg cttttgactt tttcagccga aacaaaacct 180

ggcttctgga caactcccca gagacacgtg acaagctttc cagctaccaa ccatccagct 240

gtgagcacac aacctataaa acttcacact actcttccac cacttaactg tggccacagg 300

tcctatgagc aactggttct ttccctgtta gttcgcattt ctccagttct tgtcaaccgt 360

caatgcataa tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg catgtgtgca catgtgcgcg cacactcagt 420

catgtccaac tctttgtaac cccatgaact gtagcctgcc aggctcctct gtccatga 478

<210> 3

<211> 478

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 3

gcttatctga aatttttgct tcacattcta ctatgtcatc caacgaccac tgttctggaa 60

acaatgactc ttgttcattt gggagttatt gccatgttcc tgtcacctca ttcactactc 120

tctactttac tggtgtaaac tatggtgatg cttttgactt attcagccga aacaaaacct 180

ggcttctgga caactcctca gagacacgtg acaagctttc cggctaccaa ccatccagct 240

gtgagcacac aacctataaa acttcacact actcttccac cacttaactg tggccacagg 300

tcctatgagc aactggttct ttccccgtta gttcgcattt ctccagttct tgtcaactgt 360

caatgcataa tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cacgtgcaca catgtgcgcg cacactcagt 420

catgtccaac tctttgtaac cccatgaact gtagcctgcc aggctcctct gtccatga 478

<210> 4

<211> 478

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 4

gcttatctga aatttttgct tcacgttcta ctatgtcatc caacgaccac tgttctggaa 60

acaatgactc ttgttcattt gggagttatt gccatgttcc tgtcacctca ttcactactc 120

tctactttac tggtgtaaac tatggtgatg cttttgactt tttcagccga aacaaaacct 180

ggcttctgga caactcccca gagacacgtg acaagctttc cagctaccaa ccatccagct 240

gtgagcacac aacctataaa acttcacact actcttccac cacttaactg tggccacagg 300

tcctatgagc aactggttct ttccctgtta gttcgcattt ctccagttct tgtcaaccgt 360

caatgcataa tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg catgtgcgca catgtgcgcg cacactcagt 420

catgtccaac tctttgtaac cccatgaact gtagcctgcc aggctcctct gtccatga 478

<210> 5

<211> 476

<212> DNA

<213> 角蛋白关联蛋白(Keratin-associated proteins)

<400> 5

gcttatctga aatttttgct tcacattcta ctatgtcatc caacgaccgc tgttctggaa 60

acaatgactc ttgttcattt gggagttatt gccatgttcc tgtcacctca ttcactactc 120

tctactttac tggtgtaaac tatggtgatg cttttgactt tttcagccga aacaaaacct 180

ggcttctgga caactcctca gagacacgtg acaagctttc cggctaccaa ccatccagct 240

gtgagcacac aacctataaa acttcacact actcttccac cacttaactg tggccacagg 300

tcctatgagc aactggttct ttccccgtta gttcgcattt ctccagttct tgtcaactgt 360

caatgcataa tgtgtgtgtg tgtgtgtgca cgtgcacaca tgtgcgcgca cactcagtca 420

tgtccaactc tttgtaaccc catgaactgt agcctgccag gctcctctgt ccatga 476

Claims

1.与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记，其特征在于：其位于KRTAP28-1基因上，具有A、B、C和D四个优势等位基因，所述等位基因A、B、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.4；含有等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最小；缺失等位基因A的个体，其羊绒纤维直径最大；

2.用于检测权利要求1所述的与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记的引物对，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：5'-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3'；

下游引物：5'-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3'。

3.用于检测子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒构造成能够：

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增KRTAP28-1基因的引物对，所述引物对为：

上游引物：5'-GCTTATCTGAAATTTTTGCTT-3'；

下游引物：5'-TCATGGACAGAGGAGCCTGGC-3'。

6.权利要求1所述的与子午岭黑山羊羊绒纤维直径相关的遗传标记在鉴定子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取子午岭黑山羊血液中的基因组DNA；

所述等位基因A的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(3)中，所述PCR扩增产物采用SSCP检测，同时设置阳性对照，凝胶电泳后染色，得到SSCP电泳带型图，根据图谱中条带的类型和阳性对照结果对待测样本的子午岭黑山羊羊绒纤维直径大小进行判断。

9.权利要求1所述的遗传标记在选留羊绒纤维直径小、淘汰羊绒纤维直径大的子午岭黑山羊中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

(1)提取子午岭黑山羊血液中的基因组DNA；

所述等位基因A、B、C和D的核苷酸序列分别为序列表中SEQ ID No.1-SEQ ID No.4；