CN106319065A - 基于高通量测序检测人brca1/2基因的捕获探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于高通量测序检测人BRCA1/2基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人BRCA1/2捕获探针是多种探针的混合物，所述多种探针分别能够捕获人BRCA1/2基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多种探针的集合能够捕获人BRCA1/2基因全部编码外显子区域及外显子内含子交接区域。
Description
发明领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人BRCA1/2基因的捕获的探针及试剂盒。
背景技术
乳腺癌是一种严重影响妇女身体健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，其发病率占各种恶性肿瘤的7-10％，乳腺癌的发病常与遗传有关，另外，40-60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。
乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类。其中遗传性乳腺癌约占乳癌发病率的5％-10％。乳腺癌易感基因BRCA1(the first familial breast and ovarian cancersusceptibility gene)和BRCA2(the second familial breast cancer susceptibilitygene)存在可遗传突变，BRCA1或BRCA2突变基因携带者一生中患乳腺癌的危险性估计为90％。此外，BRCA1和BRCA2的突变也和卵巢癌有关。不论有无家族史还是发病年龄，所有卵巢癌中2-6％有BRCA1的突变，3-4％有BRCA2的突变。因此，筛选BRCA基因的突变也来越受到研究者的关注。
BRCA1和BRCA2基因分别定位于17ql2_21和13ql2_13，编码序列分别为5711bp和10987bp，其表达有一定的组织特异性。BRCA1和BRCA2蛋白分别由1863个氨基酸和3418个氨基酸组成，这两个蛋白都具有Granin蛋白的某些特征。BRCA1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病人的两侧乳房都患癌，且同时患有卵巢癌。如果BRCA1/2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。截止2013年，已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多。有学者总结了BRCA1和BRCA2基因突变相关的癌症的终身风险，显示有BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和15％～45％，有BRCA2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和10％～20％。
通过对BRCA1/2的检测可筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。
耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。在这期间，建立了两项非常重要的高通量技术：基因芯片和第二代测序技术。这两种技术进一步结合，就产生了一种新的解决方案：目标序列捕获测序技术。目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定区域。一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理设计与目的区域互补的探针序列，而根据杂交时状态不同，目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。液相杂交是通过在溶液中，目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。相较于固相杂交，液相杂交具有操作简便、易于自动化等优点。
常规的探针设计方式为探针间首尾相连，且不存在重叠部分，这样做的缺点是在基因文库中BRCA1/2基因多数片段只能被单一探针捕获，且探针交界处的捕获效果差，造成捕获效率偏低。同时，常规探针设计方式对探针长度和Tm值无特殊要求，这就导致探针间差异较大，在相同的实验条件下绝大多数探针不能同时达到最佳的捕获效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人BRCA1/2基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人BRCA1/2捕获探针是多条探针的混合物，所述多条探针分别能够捕获人BRCA1/2基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多条探针的集合能够捕获人BRCA1/2基因全部编码外显子区域及外显子内含子交接区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度均一。
根据本发明的一个方面，提供用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。
本发明中，目标区域是指包含人BRCA1/2基因上的任何一个或多个变异的区域。
本发明中，全部目标区域优选为人BRCA1/2基因全部编码外显子区域及外显子内含子交接区域。
根据本发明的一个方面，提供用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的捕获探针混合物，所述捕获探针混合物至少包括具有SEQ ID NO:1-4,28-30,34-36,42-47,55,56,59-61,63-67,70,71,73-84,86,87,91-96,98,100-106,108-111,113-117,119,120,122-124,127-130,132-138,140,141,143,145-155,158-166,169-189,191-193,196-201,203,205-210,213-220,223,224,226,227,233-240,243,246-248,250-253,255,260-262,264-268,274,275,277-285,288-290,293-299,301,304-306,308-311,313,314,316,317,319,320,322-342,345-348,351,354-358,362,363,366-368,372-375,379-382,386-393,403-405,409-440,445-510,534和535所示序列的368条探针。
在一些实施方案中，所述捕获探针混合物由具有SEQ ID NO:1-4,28-30,34-36,42-47,55,56,59-61,63-67,70,71,73-84,86,87,91-96,98,100-106,108-111,113-117,119,120,122-124,127-130,132-138,140,141,143,145-155,158-166,169-189,191-193,196-201,203,205-210,213-220,223,224,226,227,233-240,243,246-248,250-253,255,260-262,264-268,274,275,277-285,288-290,293-299,301,304-306,308-311,313,314,316,317,319,320,322-342,345-348,351,354-358,362,363,366-368,372-375,379-382,386-393,403-405,409-440,445-510,534和535所示序列的368条探针组成。
在另一些实施方案中，所述捕获探针混合物还进一步包括一条或更多条具有选自SEQ ID NO:5-27,31-33,37-41,48-54,57,58,62,68,69,72,85,88-90,97,99,107,112,118,121,125,126,131,139,142,144,156,157,167,168,190,194,195,202,204,211,212,221,222,225,228-232,241,242,244,245,249,254,256-259,263,269-273,276,286,287,291,292,300,302,303,307,312,315,318,321,343,344,349,350,352,353,359-361,364,365,369-371,376-378,383-385,394-402,406-408,441-444,511-533或536-631的序列的探针。
在预选的实施方案中，所述捕获探针混合物为SEQ ID NO:1-631所示的631条探针的混合物。
在一些优选的实施方案中，捕获探针混合物中包含的探针按相同比例混合在一起。
优选地，本发明的捕获探针混合物中每条探针均具有标记，优选为生物素标记。
本发明的捕获探针混合物的工作浓度是0.1PM～6PM，优选1.5PM；其中PM＝皮摩尔/升。
根据本发明的另一个方面，提供人BRCA1/2基因变异检测试剂盒，其中包含上述探针混合物。
本发明的人BRCA1/2基因变异检测试剂盒还可以包含用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述人BRCA1/2基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阴性对照和阳性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。在特别优选的实施方案中，所述人BRCA1/2基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。
根据本发明的又一方面，提供上述用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的捕获探针在制备用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。
本发明针对当前新一代测序过程中捕获探针存在的缺陷，采用特殊的设计方式在BRCA1/2基因外显子区域进行探针设计，解决了BRCA1/2基因外显子测序数据质量较差的问题。本发明通过增加探针间的重叠区间，使基因组文库中BRCA1/2基因每个区域存在被两个或两个以上的捕获探针捕获的可能，提高了对目的片段的捕获能力。通过限制探针的长度和Tm值，降低了探针之间的差异性，使绝大多数探针在特定实验条件下均处于解链和二级结构充分打开的状态，可与目的区域充分结合，提高了对目的区域捕获的均一性。本发明的捕获探针具有杂交效果好，捕获效率高，目的区域测序数据质量好等优点。
具体实施方式
本文所述的“杂交捕获”是通过固相表面的互补DNA序列与靶向DNA进行杂交，对待测核酸进行靶向富集的方法。
本文所述的“Tm值”是指DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。
本文所述的“基因组文库”是将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆形成的集合，可用于下游的扩增、Sanger测序或新一代测序。
本文所述的“新一代测序技术”又称大规模平行测序massively parallelsequencing(MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序、二代测序等。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，Ion Torrent等测序仪进行测序。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。
实施例1：人BRCA1/2基因变异检测质控品的制备
1.1.从ATCC购买获得四个常用的可稳定传代人肿瘤细胞系HCC1599、HCT-15、Jurkat、NCI-H720。
1.2.采用专用培养基培养这四个人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，分别抽提每个细胞系的基因组DNA，并过柱纯化、洗脱。
1.3.将纯化后的每个细胞系的基因组DNA分别用Tris-EDTA buffer solution缓冲液稀释至100±5ng/μL，外观为透明液体，无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞OD260/280＞1.7，得到质控品原料DNA。
1.4.用Sanger测序法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，经Sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点，确认为野生型的位点作为阴性对照位点。经验证共含有27个阳性变异位点及660个野生型位点。
1.5.将四种细胞系HCC1599、HCT-15、Jurkat、NCI-H720的质控品原料DNA按照1：1：1：1的体积比进行均匀混合，-20℃保存。
实施例2：人BRCA1/2基因变异检测试剂盒的制备
2.1.设计并合成针对人BRCA1/2基因上不同的目标区域的多个捕获探针，所有捕获探针的集合能够覆盖人BRCA1/2基因全部编码外显子区域及外显子内含子交接区域；捕获探针上具有生物素标记；所述捕获探针的序列如序列表中SEQ ID NO:1-631所示。
2.2.将序列表中SEQ ID NO:1-631所示的全部捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。
2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。
2.4.准备说明书、外包装，组装封口。
2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为5μL/3反应，10μL/6反应，20μL/12反应，40μL/24反应。
实施例3：人BRCA1/2基因变异的测序检测
本实施例中测序所使用的仪器为NextSeq500。
质控品的制备方法同实施例1。
3.1.从20例阳性血液样本中提取人基因组DNA，质控品直接使用，无需提取。
3.2.DNA样本和质控品的片段化
每个人基因组DNA样本取200ng，质控品也取200ng，不足50μL的可用PCR-gradewater补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。随后将溶液全部转移至microtube中，选择片段长度为200～300bp的打断程序进行基因组DNA样本和质控品DNA的片段化。取5μL片段化后的样本进行琼脂糖凝胶电泳。
3.3.文库构建
3.3.1.末端修复和接头连接
0.2ml PCR反应管，加入200～400ng打断后的基因组DNA样本或质控品，用PCR-grade water补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。分别加入3μL末端修复酶混合物和7μL末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在20℃保温30min，随后在65℃保温30min，进行末端修复。取出PCR反应管，短暂离心后分别加入2μL接头(含index标签)、10μL DNA连接酶、30μL连接反应缓冲液和8μL PCR-grade water。震荡混匀，短暂离心后在20℃保温15min，进行接头连接。
3.3.2.纯化
取核酸纯化磁珠，平衡至室温。取步骤3.3.1中接头连接后的PCR反应管，短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。然后加入99μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。随后加入200μL 80％乙醇，静置1min后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向管中加入22μL Nuclease-free water重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的0.2ml PCR反应管中备用。
3.3.3.文库扩增与纯化
向步骤3.3.2中的装有20μL上清的0.2ml PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和5μL文库扩增引物，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增：98℃1min；7-9个循环，每个循环为98℃15s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。扩增后取出PCR反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入45μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL 80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入52μL Nuclease-free water重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取50μL上清至新的1.5mL离心管中备用。取2μL文库DNA或质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。
3.4.文库捕获
3.4.1.杂交
每8个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，最后不足8个的混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mL LoBind离心管中成为一个样品池，血液样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μL DNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μL PCR-grade water，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mL PCR反应管中，95℃保温10分钟。取出PCR反应管，短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在65℃保温4h，热盖温度为75℃。
3.4.2.富集
取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mL PCR反应管中。
将步骤3.4.1中的PCR反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL 65℃预热的1×洗液Ⅰ，将全部悬液转移至1.5mL LoBind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。
加入200μL 65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。
再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL Nuclease-free water，震荡重悬后全部转移至0.2mL PCR反应管中备用。
3.4.3.捕获文库扩增与纯化
向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。
将PCR反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-free water震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的1.5mL LoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。
3.5.测序及数据分析
3.5.1.测序
按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度：血液样本≥300×。
3.5.2.数据分析
获得原始测序数据后，与参比数据库比对，进行变异分析和解读。
检测结果如下：
临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率：20/20＝100％。所有临床样本经Sanger测序法验证无误。
表1临床样本突变位点及检测结果
| 样本编号 | 基因名称 | 变异类型 | 转录本编号 | 外显子或内含子 | cDNA位置 | 检测结果 |
| BR-5 | BRCA1 | splicing | NM_007294 | Intron19 | c.5277+1G>A | 突变一致，阳性 |
| BR-1 | BRCA1 | frameshift | NM_007294 | exon19 | c.5266dupC | 突变一致，阳性 |
| 2851 | BRCA1 | Splicing | NM_007294 | intron16 | c.5074+1_5074+3del | 突变一致，阳性 |
| 1553 | BRCA1 | deletion | NM_007294 | exon11 | c.4161_4162del,MUT | 突变一致，阳性 |
| MG229 | BRCA1 | deletion | NM_007294 | exon6 | c.439delT | 突变一致，阳性 |
| 00001789 | BRCA1 | deletion | NM_007294 | exon23 | c.5470_5477del | 突变一致，阳性 |
| 00001105 | BRCA1 | deletion | NM_007294 | exon23 | c.5521delA | 突变一致，阳性 |
| BR25 | BRCA1 | insertion | NM_007294 | exon2 | c.66dupA | 突变一致，阳性 |
| 00001533 | BRCA1 | nonsense | NM_007294 | exon15 | c.A4801T | 突变一致，阳性 |
| 1577 | BRCA1 | nonsense | NM_007294 | exon12 | c.C4327T | 突变一致，阳性 |
| 1145 | BRCA1 | nonsense | NM_007294 | exon5 | c.G223T | 突变一致，阳性 |
| 00001349 | BRCA2 | deletion | NM_000059 | exon18 | c.8164_8167del | 突变一致，阳性 |
| 2727 | BRCA2 | deletion | NM_000059 | exon10 | c.1796_1800del | 突变一致，阳性 |
| 00001419 | BRCA2 | insertion | NM_000059 | exon10 | c.1813_1814insG | 突变一致，阳性 |
| 00001390 | BRCA2 | deletion | NM_000059 | exon5 | c.464_468del | 突变一致，阳性 |
| 2392 | BRCA2 | splice | NM_000059 | intron2 | c.67+1G>A | 突变一致，阳性 |
| 2567 | BRCA2 | splice | NM_000059 | intron2 | c.68-1G>T | 突变一致，阳性 |
| 2528 | BRCA2 | deletion | NM_000059 | exon9 | c.767_771del | 突变一致，阳性 |
| 2616 | BRCA2 | splice | NM_000059 | exon20 | c.8632+1G>A | 突变一致，阳性 |
| 2419 | BRCA2 | nonsense | NM_000059 | exon13 | c.C6952T | 突变一致，阳性 |
质控品的变异阳性位点及变异阴性(即野生型)位点检测结果如表2和表3所示，其中参考突变频率为根据混合比例以及经Sanger测序法测定的变异频率计算获得的理论变异频率值，检测值为高通量测序实验检测结果。
表2质控品变异位点及检测结果
表3质控品变异阴性位点及检测结果
由表2和表3的结果可见，质控品中阳性变异对照符合率为100％，野生型序列对照符合率为100％。
实施例4：可重复性实验
按照实施例1的制备方法制备质控品B-P1，与实施例1的不同之处在于四个细胞系DNA按照2:1:1:1的体积比混合制备而成。
使用质控品B-P1按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20160126，20160127，20160128。
按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160126，检测B-P1三次，检测结果见表4。不同批次试剂盒20160126，20160127，20160128，检测B-P1各1次，检测结果见表5。
表4批内差异
| 批号 | 样本名称 | 阳性变异符合率 | 野生型序列符合率 |
| 20160126 | B-P1 | 100％ | 100％ |
| 20160126 | B-P1 | 100％ | 100％ |
| 20160126 | B-P1 | 100％ | 100％ |
表5批间差异
| 批号 | 样本名称 | 阳性变异符合率 | 野生型序列符合率 |
| 20160126 | B-P1 | 100％ | 100％ |
| 20160127 | B-P1 | 100％ | 100％ |
| 20160128 | B-P1 | 100％ | 100％ |
检测结果：试剂盒可重复性满足要求。
实施例5：探针对比测试的性能分析指标
分别使用常规捕获探针和实施例2的捕获探针，按照与实施例3相同的实验步骤进行操作。其中常规捕获探针为158条探针的混合物，其中所包含的158条探针首尾相接覆盖BRCA1/2的全部目标区域，每条探针长度随机，Tm值无限制，所有探针均具有生物素标记。
经过测序和数据分析，两种探针的性能指标比较如表6和表7所示。
表6常规捕获探针性能指标验证分析
| 样本 | 重复率(％) | 目标区占比(％) | 目标区边缘占比(％) | 非目标区占比(％) |
| 1 | 0.44 | 46.13 | 13.68 | 40.19 |
| 2 | 0.84 | 28.92 | 7.29 | 63.79 |
| 3 | 0.64 | 42.69 | 13.24 | 44.07 |
| 4 | 0.60 | 36.46 | 27.32 | 36.22 |
| 5 | 0.49 | 42.70 | 9.73 | 47.57 |
| 6 | 0.41 | 38.08 | 27.90 | 34.02 |
| 7 | 0.82 | 22.69 | 7.07 | 70.24 |
| 8 | 0.54 | 42.97 | 21.55 | 35.48 |
| 9 | 0.52 | 44.27 | 21.75 | 33.98 |
| 10 | 0.55 | 46.93 | 7.10 | 45.97 |
| 11 | 0.42 | 29.66 | 9.27 | 61.08 |
| 12 | 0.30 | 50.82 | 10.35 | 38.83 |
| 13 | 0.41 | 30.24 | 8.92 | 60.84 |
| 14 | 0.43 | 31.85 | 9.45 | 58.70 |
| 15 | 0.34 | 45.16 | 6.83 | 48.00 |
| 16 | 0.48 | 46.25 | 22.45 | 31.30 |
| 17 | 0.39 | 31.69 | 9.64 | 58.67 |
| 18 | 0.53 | 48.37 | 7.16 | 44.47 |
| 19 | 0.41 | 50.41 | 7.89 | 41.70 |
| 20 | 0.52 | 50.60 | 7.88 | 41.51 |
| 均值 | 0.50 | 40.34 | 12.82 | 46.83 |
表7实施例2探针性能指标验证分析
其中
重复率：测序重复的数据量与测序得到的总数据量之比；
目标区占比：目标区域测序测得的数据量与测序得到的总数据量之比；
目标区边缘占比：目标区边缘区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比；
非目标区占比：非目标区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比。
实施例6：利用368条探针组合对人BRCA1/2基因变异进行测序检测
将序列表中SEQ ID NO:1-4,28-30,34-36,42-47,55,56,59-61,63-67,70,71,73-84,86,87,91-96,98,100-106,108-111,113-117,119,120,122-124,127-130,132-138,140,141,143,145-155,158-166,169-189,191-193,196-201,203,205-210,213-220,223,224,226,227,233-240,243,246-248,250-253,255,260-262,264-268,274,275,277-285,288-290,293-299,301,304-306,308-311,313,314,316,317,319,320,322-342,345-348,351,354-358,362,363,366-368,372-375,379-382,386-393,403-405,409-440,445-510,534,535所示的捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述368条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。
对人BRCA1/2基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的368条捕获探针混合物。
检测结果如下：
临床样本的突变位点及检测结果如表8所示。临床样本检测符合率：20/20＝100％。所有临床样本经Sanger测序法验证无误。
表8 368条探针组合临床样本检测结果
利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的368条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表9所示：
表9捕获核酸得率比较
| 样本编号 | 常规捕获探针 | 本实施例的368条探针 |
| 1 | 0.3％ | 1.4％ |
| 2 | 1.1％ | 3.5％ |
| 3 | 1.8％ | 2.7％ |
| 4 | 0.6％ | 1.1％ |
| 5 | 0.5％ | 1.9％ |
| 6 | 1.4％ | 2.9％ |
| 7 | 0.2％ | 1.6％ |
| 8 | 0.3％ | 3.0％ |
注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。
实施例7：利用556条探针组合对人BRCA1/2基因变异进行测序检测
将序列表中SEQ ID NO:1-556所示的捕获探针按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述556条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。
对人BRCA1/2基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的556条捕获探针混合物。
检测结果如下：
临床样本的突变位点及检测结果如表10所示。临床样本检测符合率：20/20＝100％。所有临床样本经Sanger测序法验证无误。
表10 556条探针组合临床样本检测结果
利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的556条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表11所示：
表11捕获核酸得率比较
| 样本编号 | 常规捕获探针 | 本实施例的556条探针 |
| 1 | 0.3％ | 1.8％ |
| 2 | 1.1％ | 3.7％ |
| 3 | 1.8％ | 3.1％ |
| 4 | 0.6％ | 1.1％ |
| 5 | 0.5％ | 2.0％ |
| 6 | 1.4％ | 3.2％ |
| 7 | 0.2％ | 2.4％ |
| 8 | 0.3％ | 3.1％ |
注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。
Claims (11)
1.用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。
2.权利要求1的捕获探针，所述捕获探针至少包括具有SEQ ID NO:1-4,28-30,34-36,42-47,55,56,59-61,63-67,70,71,73-84,86,87,91-96,98,100-106,108-111,113-117,119,120,122-124,127-130,132-138,140,141,143,145-155,158-166,169-189,191-193,196-201,203,205-210,213-220,223,224,226,227,233-240,243,246-248,250-253,255,260-262,264-268,274,275,277-285,288-290,293-299,301,304-306,308-311,313,314,316,317,319,320,322-342,345-348,351,354-358,362,363,366-368,372-375,379-382,386-393,403-405,409-440,445-510,534和535所示序列的368条探针。
3.权利要求2的捕获探针，所述捕获探针由具有SEQ ID NO:1-4,28-30,34-36,42-47,55,56,59-61,63-67,70,71,73-84,86,87,91-96,98,100-106,108-111,113-117,119,120,122-124,127-130,132-138,140,141,143,145-155,158-166,169-189,191-193,196-201,203,205-210,213-220,223,224,226,227,233-240,243,246-248,250-253,255,260-262,264-268,274,275,277-285,288-290,293-299,301,304-306,308-311,313,314,316,317,319,320,322-342,345-348,351,354-358,362,363,366-368,372-375,379-382,386-393,403-405,409-440,445-510,534和535所示序列的368条探针组成。
4.权利要求2的捕获探针，所述捕获探针还包括一条或更多条具有选自SEQ ID NO:5-27,31-33,37-41,48-54,57,58,62,68,69,72,85,88-90,97,99,107,112,118,121,125,126,131,139,142,144,156,157,167,168,190,194,195,202,204,211,212,221,222,225,228-232,241,242,244,245,249,254,256-259,263,269-273,276,286,287,291,292,300,302,303,307,312,315,318,321,343,344,349,350,352,353,359-361,364,365,369-371,376-378,383-385,394-402,406-408,441-444,511-533或536-631的序列的探针。
5.权利要求4的捕获探针，所述捕获探针为SEQ ID NO:1-631所示的631条探针的混合物。
6.权利要求2-5任一项的捕获探针，其中混合物中包含的探针按相同质量混合在一起。
7.权利要求1-6任一项的捕获探针，其中每条探针均具有生物素标记。
8.人BRCA1/2基因变异检测试剂盒，其中包含权利要求1-7任一项的捕获探针。
9.权利要求8的试剂盒，所述试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
10.权利要求8的试剂盒，所述试剂盒进一步包含末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠。
11.权利要求1-7任一项的捕获探针在制备用于人BRCA1/2基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。
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