CN109609610A - 一种自制探针检测brca基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自制探针检测BRCA基因的方法，其方法包括以下步骤：A、扩增BRCA1/2基因的目的片段；B、物理超声随机打断；C、生物素进行标记；D、链霉亲和素磁珠纯化；E、获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获；F、上机测序；G、生物信息学分析，步骤A中，可选用48对特异性引物，将BRCA1及BRCA2外显子区域扩增出来。本发明通过本方法，由于其绕过了传统杂交捕获探针的合成方法，因此可大幅度降低合成过程中所需要的成本问题，同时通过本方法制备的探针，不仅克服了合成探针成本过大的问题，而且制备方法简单、制备时间短（几天即可制备完成）、极大的节约探针合成的时间，适宜推广普及。

Description

一种自制探针检测BRCA基因的方法
技术领域
本发明涉及核酸探针制备技术领域，具体为一种自制探针检测BRCA基因的方法。
背景技术
自从2005年，下一代测序（NGS）技术开始发展以来，在生物医学研究领域得到了越来越广泛的应用，NGS技术相比于传统Sanger测序而言，优势在于其规模大、通量高，在文库构建时或捕获后目标序列扩增阶段均可引入序列标签，从而可实现多样本的平行分析。
1990年，一种与遗传性乳腺癌密切相关的基因---乳腺癌易感基因1号（BRCA1）首次被发现，1994年，又发现了另一种与乳腺癌相关的基因---BRCA2，这两种基因均为抑癌基因，正常情况下，BRCA1/2表达的蛋白质会帮助修复受损的DNA，减少组织癌变的风险，因此，一旦BRCA1/2发生突变，癌变发生率也会随之提高。
前几年，BRCA1/2基因的检测大多使用一代测序，测序成本高、操作复杂、周期长且通量低，最近基本已被下一代测序取代，为节约测序成本，BRCA1/2的下一代测序一般采用杂交捕获的方式，杂交捕获的关键因素之一就是捕获所用的探针，但是目前市面上常用的杂交捕获探针主要是通过合成的方法，其制备原理主要针对感兴趣的区域设计一定长度的探针序列，每个序列沿着基因位置移动一定距离，然后采用人工合成的方式大量合成上述序列，该方法最大的缺点是成本过于昂贵，由于每次合成的探针不存在小规格型号，每次都需几百次反应起，合成的成本高达几十万元，同时，随着目标区域的增大，探针合成的成本急速上升，这极大的提高了二代测序的成本，不利于二代测序向普通民众普及，以及不利于提高此项测序服务的价格市场竞争力，除成本过于高昂外，该方法还有其它缺点，如制备条件复杂，需要大量专业仪器，提高了探针制备的门槛，使得很多情况下都要从特定供应商处定制购买，从定制到获得杂交捕获探针往往需要几个月，这不仅增加了制备成本，而且耗费了很多的时间，为此，我们提出一种自制探针检测BRCA基因的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自制探针检测BRCA基因的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种自制探针检测BRCA基因的方法，其方法包括以下步骤：
A、扩增BRCA1/2基因的目的片段；
B、物理超声随机打断；
C、生物素进行标记；
D、链霉亲和素磁珠纯化；
E、获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获；
F、上机测序；
G、生物信息学分析。
优选的，所述步骤A中，可选用48对特异性引物，将BRCA1及BRCA2外显子区域扩增出来。
优选的，所述步骤B中，采用物理方法将扩增好的产物超声打断为100～350bp，并切取150～300bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
优选的，所述步骤C中，对目的条带进行生物素标记，并用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的BRCA1/2捕获探针。
优选的，所述步骤D中，包括链霉亲和素磁珠清洗和链霉亲和素磁珠纯化探针，且链霉亲和素磁珠清洗包括以下步骤：1）、将链霉亲和磁珠（Dynabeads M-270 Streptavidinbeads）取出，并室温平衡至少30min；2）、涡旋15s使磁珠充分混匀；3）、将适量体积的磁珠置于新的1.7ml的低吸附管中，一次纯化需加100μl亲和素包被的磁珠（一管中最多加600μl磁珠）；4）、将管子置于磁力架上，使磁珠与上清完全分离；5）、弃上清，尽量避免吸到磁珠；6）、每100μl起始量的磁珠加入200μl 1×bead wash bμffer，涡旋震荡10s后置于磁力架上，待上清澄清，移除上清；7）、重复步骤6）一次；8）、加入100μl 1×bead wash bμffer，涡旋混匀；9）、转移100μl重悬的磁珠到0.2ml的低吸附管中；10）、将管置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（少量wash bμffer残留不影响实验结果）；链霉亲和素磁珠纯化探针为：先将生物素标记探针产物加入到亲和素包被的磁珠中，震荡混匀后瞬离，65℃孵育1h（热盖温度设置为75℃），期间每间隔12min涡旋混匀样本3s，在涡旋震荡器正中涡旋（涡旋时略加力压紧，震荡速度调至中速，这样可避免液体四处飞散后的离心步骤），弃上清（ 此时生物素标记的DNA片段结合在亲和素包被的磁珠上），后用50μL 1.25M的NaOH洗涤3次，涡旋震荡，瞬离后置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（去掉未标记的DNA单链，此时亲和素包被的磁珠上结合的是生物素标记的DNA 单链），再用100μL去离子甲酰胺重悬磁珠（使DNA变性：它可使碱基间形成H键），金属浴中95℃孵育10 min。使标记生物素的DNA单链与亲和素分离，吸取上清转移到一个新的管中，上清即为获得的生物素标记的探针，最后使用DNA纯化试剂盒纯化DNA，获得生物素标记的DNA探针。
优选的，所述步骤E中，用制备好的BRCA1/2捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
优选的，所述步骤F中，采用二代测序仪，如Ion Torrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序。
优选的，所述步骤G中，包括下机数据质控、质控合格数据比对、探针捕获率统计和分析和探针特异性比较，且下机数据质控为：数据下机后，得到原始下机数据，称之为RawData，首先用软件fastqc对Raw Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，之后用软件trimmomatic-0.36对Raw Data进行去除adapter、去除低质量数据、去除N含量较高的数据等，并得到Clean Data，然后，用软件fastqc对Clean Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，最后，用内部程序统计和比较质控前后数据信息，主要包括数据量、Reads数、Reads长度、Q20、Q30、GC含量等，对于质控合格的数据，进行下游分析；质控合格数据比对为：对质控合格数据（Clean Data），用软件BWA，以人类基因组hg19为参考，进行比对，并用内部程序进行比对信息统计，主要包括比对率、重复率、插入片段大小、比对质量值、覆盖度、平均测序深度等信息；探针捕获率统计和分析为：根据探针目标区域，用bedtools、samtools以及内部程序，对目标区域进行捕获情况统计和分析，主要包括目标区域平均测序深度、覆盖度一致性等信息；探针特异性比较为：选择三为女性外周血样本构建基因组文库，使用自制探针对其进行杂交捕获后上机测序，并经过生物信息学分析，最后将结果与市面上多重PCR试剂盒进行比较。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过本方法，由于其绕过了传统杂交捕获探针的合成方法，因此可大幅度降低合成过程中所需要的成本问题，同时通过本方法制备的探针，不仅克服了合成探针成本过大的问题，而且制备方法简单、制备时间短（几天即可制备完成）、极大的节约探针合成的时间，适宜推广普及。
附图说明
图1为本发明方法流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种自制探针检测BRCA基因的方法，其方法包括以下步骤：
A、扩增BRCA1/2基因的目的片段；
B、物理超声随机打断；
C、生物素进行标记；
D、链霉亲和素磁珠纯化；
E、获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获；
F、上机测序；
G、生物信息学分析，由于其绕过了传统杂交捕获探针的合成方法，因此可大幅度降低合成过程中所需要的成本问题，同时通过本方法制备的探针，不仅克服了合成探针成本过大的问题，而且制备方法简单、制备时间短（几天即可制备完成）、极大的节约探针合成的时间，适宜推广普及。
步骤A中，可选用48对特异性引物，将BRCA1及BRCA2外显子区域扩增出来。
步骤B中，采用物理方法将扩增好的产物超声打断为100～350bp，并切取150～300bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
步骤C中，对目的条带进行生物素标记，并用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的BRCA1/2捕获探针。
步骤D中，包括链霉亲和素磁珠清洗和链霉亲和素磁珠纯化探针，且链霉亲和素磁珠清洗包括以下步骤：1）、将链霉亲和磁珠（Dynabeads M-270 Streptavidin beads）取出，并室温平衡至少30min；2）、涡旋15s使磁珠充分混匀；3）、将适量体积的磁珠置于新的1.7ml的低吸附管中，一次纯化需加100μl亲和素包被的磁珠（一管中最多加600μl磁珠）；4）、将管子置于磁力架上，使磁珠与上清完全分离；5）、弃上清，尽量避免吸到磁珠；6）、每100μl起始量的磁珠加入200μl 1×bead wash bμffer，涡旋震荡10s后置于磁力架上，待上清澄清，移除上清；7）、重复步骤6）一次；8）、加入100μl 1×bead wash bμffer，涡旋混匀；9）、转移100μl重悬的磁珠到0.2ml的低吸附管中；10）、将管置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（少量wash bμffer残留不影响实验结果）；链霉亲和素磁珠纯化探针为：先将生物素标记探针产物加入到亲和素包被的磁珠中，震荡混匀后瞬离，65℃孵育1h（热盖温度设置为75℃），期间每间隔12min涡旋混匀样本3s，在涡旋震荡器正中涡旋（涡旋时略加力压紧，震荡速度调至中速，这样可避免液体四处飞散后的离心步骤），弃上清（ 此时生物素标记的DNA片段结合在亲和素包被的磁珠上），后用50μL 1.25M的NaOH洗涤3次，涡旋震荡，瞬离后置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（去掉未标记的DNA单链，此时亲和素包被的磁珠上结合的是生物素标记的DNA 单链），再用100μL去离子甲酰胺重悬磁珠（使DNA变性：它可使碱基间形成H键），金属浴中95℃孵育10 min。使标记生物素的DNA单链与亲和素分离，吸取上清转移到一个新的管中，上清即为获得的生物素标记的探针，最后使用DNA纯化试剂盒纯化DNA，获得生物素标记的DNA探针。
步骤E中，用制备好的BRCA1/2捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
步骤F中，采用二代测序仪，如Ion Torrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序。
步骤G中，包括下机数据质控、质控合格数据比对、探针捕获率统计和分析和探针特异性比较，且下机数据质控为：数据下机后，得到原始下机数据，称之为Raw Data，首先用软件fastqc对Raw Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，之后用软件trimmomatic-0.36对Raw Data进行去除adapter、去除低质量数据、去除N含量较高的数据等，并得到Clean Data，然后，用软件fastqc对Clean Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，最后，用内部程序统计和比较质控前后数据信息，主要包括数据量、Reads数、Reads长度、Q20、Q30、GC含量等，对于质控合格的数据，进行下游分析；质控合格数据比对为：对质控合格数据（Clean Data），用软件BWA，以人类基因组hg19为参考，进行比对，并用内部程序进行比对信息统计，主要包括比对率、重复率、插入片段大小、比对质量值、覆盖度、平均测序深度等信息；探针捕获率统计和分析为：根据探针目标区域，用bedtools、samtools以及内部程序，对目标区域进行捕获情况统计和分析，主要包括目标区域平均测序深度、覆盖度一致性等信息；探针特异性比较为：选择三为女性外周血样本构建基因组文库，使用自制探针对其进行杂交捕获后上机测序，并经过生物信息学分析，最后将结果与市面上多重PCR试剂盒进行比较。
使用时，通过本方法，由于其绕过了传统杂交捕获探针的合成方法，因此可大幅度降低合成过程中所需要的成本问题，同时通过本方法制备的探针，不仅克服了合成探针成本过大的问题，而且制备方法简单、制备时间短（几天即可制备完成）、极大的节约探针合成的时间，适宜推广普及。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：
A、扩增BRCA1/2基因的目的片段；
B、物理超声随机打断；
C、生物素进行标记；
D、链霉亲和素磁珠纯化；
E、获得的捕获探针对构建好的文库进行捕获；
F、上机测序；
G、生物信息学分析。
2.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤A中，可选用48对特异性引物，将BRCA1及BRCA2外显子区域扩增出来。
3.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤B中，采用物理方法将扩增好的产物超声打断为100～350bp，并切取150～300bp片段进行胶回收，以获得目的条带。
4.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤C中，对目的条带进行生物素标记，并用链霉亲和素磁珠进行纯化，以获得生物素标记的BRCA1/2捕获探针。
5.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤D中，包括链霉亲和素磁珠清洗和链霉亲和素磁珠纯化探针，且链霉亲和素磁珠清洗包括以下步骤：1）、将链霉亲和磁珠（Dynabeads M-270 Streptavidin beads）取出，并室温平衡至少30min；2）、涡旋15s使磁珠充分混匀；3）、将适量体积的磁珠置于新的1.7ml的低吸附管中，一次纯化需加100μl亲和素包被的磁珠（一管中最多加600μl磁珠）；4）、将管子置于磁力架上，使磁珠与上清完全分离；5）、弃上清，尽量避免吸到磁珠；6）、每100μl起始量的磁珠加入200μl 1×bead wash bμffer，涡旋震荡10s后置于磁力架上，待上清澄清，移除上清；7）、重复步骤6）一次；8）、加入100μl 1×bead wash bμffer，涡旋混匀；9）、转移100μl重悬的磁珠到0.2ml的低吸附管中；10）、将管置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（少量wash bμffer残留不影响实验结果）；链霉亲和素磁珠纯化探针为：先将生物素标记探针产物加入到亲和素包被的磁珠中，震荡混匀后瞬离，65℃孵育1h（热盖温度设置为75℃），期间每间隔12min涡旋混匀样本3s，在涡旋震荡器正中涡旋（涡旋时略加力压紧，震荡速度调至中速，这样可避免液体四处飞散后的离心步骤），弃上清（ 此时生物素标记的DNA片段结合在亲和素包被的磁珠上），后用50μL 1.25M的NaOH洗涤3次，涡旋震荡，瞬离后置于磁力架上，待上清澄清后吸除上清（去掉未标记的DNA单链，此时亲和素包被的磁珠上结合的是生物素标记的DNA 单链），再用100μL去离子甲酰胺重悬磁珠（使DNA变性：它可使碱基间形成H键），金属浴中95℃孵育10 min，使标记生物素的DNA单链与亲和素分离，吸取上清转移到一个新的管中，上清即为获得的生物素标记的探针，最后使用DNA纯化试剂盒纯化DNA，获得生物素标记的DNA探针。
6.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤E中，用制备好的BRCA1/2捕获探针对基因组文库进行捕获，并上机测序，进行生物信息学分析。
7.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤F中，采用二代测序仪，如Ion Torrent平台或Illμmina平台的相关测序仪进行上机测序。
8.根据权利要求1所述的一种自制探针检测BRCA基因的方法，其特征在于：所述步骤G中，包括下机数据质控、质控合格数据比对、探针捕获率统计和分析和探针特异性比较，且下机数据质控为：数据下机后，得到原始下机数据，称之为Raw Data，首先用软件fastqc对Raw Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，之后用软件trimmomatic-0.36对Raw Data进行去除adapter、去除低质量数据、去除N含量较高的数据等，并得到Clean Data，然后，用软件fastqc对Clean Data进行检测，主要统计和查看数据量、adapter、碱基分布、GC含量等信息，最后，用内部程序统计和比较质控前后数据信息，主要包括数据量、Reads数、Reads长度、Q20、Q30、GC含量等，对于质控合格的数据，进行下游分析；质控合格数据比对为：对质控合格数据（Clean Data），用软件BWA，以人类基因组hg19为参考，进行比对，并用内部程序进行比对信息统计，主要包括比对率、重复率、插入片段大小、比对质量值、覆盖度、平均测序深度等信息；探针捕获率统计和分析为：根据探针目标区域，用bedtools、samtools以及内部程序，对目标区域进行捕获情况统计和分析，主要包括目标区域平均测序深度、覆盖度一致性等信息；探针特异性比较为：选择三为女性外周血样本构建基因组文库，使用自制探针对其进行杂交捕获后上机测序，并经过生物信息学分析，最后将结果与市面上多重PCR试剂盒进行比较。
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