CN104789672B - 一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒,该试剂盒包括扩增地中海贫血基因的PCR试剂和检测地中海贫血基因的杂交试剂,其中,所述杂交试剂包括液相芯片;所述液相芯片由偶联有特异性杂交探针的条码化磁珠、空白条码化磁珠、游离的杂交阳性反序探针和杂交缓冲液组成。本发明具有操作简单、反应快、通量高、数字化的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体涉及一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒。
背景技术
地中海贫血又称海洋性贫血,简称地贫,是世界上最常见的人类单基因遗传性血液病,是一组由于珠蛋白基因缺失或点突变,使血红蛋白中珠蛋白肽链合成减少或不能合成所致的遗传性溶血性贫血。我国长江以南各省发病率较高,其中以广东、广西、四川、云南、海南、香港、台湾较为多见,在北方则少见。
地中海贫血病由于珠蛋白缺失的多样性所致(缺乏的珠蛋白链的类型、数量不一),临床表现呈多样性,症状的轻重程度也不同。有的胎儿及婴幼儿即因患极重的溶血性贫血致死,有的患者需要进行反复输血治疗,也有的患者虽血红蛋白异常而一生无任何临床症状的。如夫妻为同型地中海贫血携带者,则其子女有1/4机会患重型地中海贫血。世界上约有4.83%的人口携带珠蛋白变异基因,我国发病率较高的广西人群中地中海贫血基因携带率为12.22%~23.02%。由于地中海贫血的患者缺少正常的血红蛋白,红血球携氧能力差,体内主要造血器官骨髓与次要造血器官肝脏、脾脏均会进行旺盛的造血作用,但造出的红血球也多半品质不佳,容易被破坏,成为恶性循环。骨髓增生会侵犯周围的皮质骨,使骨骼变的脆弱。旺盛的造血作用会消耗极多的养分与能量,使身体其他部位的养分供需失调。目前尚无针对地中海贫血的有效的治疗方法,不断的输血虽然可以改善贫血的症状,也可避免过度的造血作用,但血红蛋白中的铁质会过度累积在身体中,并堆积至各重要器官造成器官病变,而且输血治疗费用昂贵,给患者及家庭带来巨大的经济负担和精神痛苦。因此遗传咨询、产前诊断以及在我国南方开展大范围人群的分子筛查作为防治该疾病的首要途径,对控制重型地贫患儿的出生,提高出生人口素质具有重要意义。
人体血浆中正常的血红蛋白由两对不同的珠蛋白肽链(α链和非α链)组成,非α链有β、γ、δ、ξ(结构与α链相似)及ε5种。珠蛋白的这几种肽链分别由其相应的基因编码,这些基因的缺失或点突变可造成各种肽链的合成障碍,致使血红蛋白的组分改变。根据本病缺乏的珠蛋白链的种类及缺乏程度,通常将地中海贫血分为α、β、δ和δ等4种类型,其中以β和α地中海贫血最多见,也最严重。
现在对地中海贫血的基因检测手段有Southern blotting印迹杂交、PCR限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)连锁分析技术、PCR-单链构象多态性检测(PCR-SSCP)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)技术、反向点杂交法(RDB)、突变寡核苷酸延伸扩增(MOEA)、多重等位基因特异性PCR法(MAS-PCR)、跨越断裂点PCR法(Gap-PCR)、荧光PCR、基因芯片等。目前临床使用的方法主要为反向点杂交法(RDB)结合跨越断裂点PCR(Gap-PCR)电泳法,但其存在通量低、操作繁琐、耗时长和需人工判读等弊端。基于Luminex液相芯片建立的检测方法能极大改善此局面,可是该系统的微球是由荧光染料混合而成,通过荧光对微球进行区分,由于微球对光敏感,易发生光漂白,而且基于Luminex液相芯片建立的检测方法还存在微球的荧光染料与藻红蛋白荧光信号互相干扰的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒。本发明使用条码化磁珠(BMB)的IntelliplexTM技术在可见光下识别磁珠上微蚀刻的条码,对磁珠进行解码分类,由于条码化磁珠本身不含有荧光物质,从而有效地解决了Luminex平台存在的问题。
一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒,包括扩增地中海贫血基因的PCR试剂和检测地中海贫血基因的杂交试剂,其中,所述杂交试剂包括液相芯片;所述液相芯片由偶联有特异性杂交探针的条码化磁珠、空白条码化磁珠、游离的杂交阳性反序探针和杂交缓冲液组成。
在根据本发明的一个实施方案中,所述特异性杂交探针包含:
检测-32C>A位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:19的β1N探针和序列为SEQ IDNO:20的β1M探针;
检测-30T>C位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:21的β2N探针和序列为SEQ IDNO:22的β2M探针;
检测-29A>G位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:23的β3N探针和序列为SEQ IDNO:24的β3M探针;
检测-28A>G位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:25的β4N探针和序列为SEQ IDNO:26的β4M探针;
检测CAP+40-+43(-AAAC)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:27的β5N探针和序列为SEQ ID NO:28的β5M探针;
检测起始密码子ATG>AGG位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:29的β6N探针和序列为SEQ ID NO:30的β6M探针;
检测CD14-15(+G)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:31的β7N探针和序列为SEQ ID NO:32的β7M探针;
检测CD17A>T位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:33的β8N探针和序列为SEQ IDNO:34的β8M探针;
检测CD26G>A位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:35的β9N探针和序列为SEQ IDNO:36的β9M探针;
检测CD27-28(+C)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:37的β10N探针和序列为SEQ ID NO:38的β10M探针;
检测IVS-1-1G>T位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:39的β11N探针和序列为SEQ ID NO:40的β11M探针;
检测IVS-1-5G>C位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:41的β12N探针和序列为SEQ ID NO:42的β12M探针;
检测CD31(-C)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:43的β13N探针和序列为SEQID NO:44的β13M探针;
检测CD41-42(-TCTT)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:45的β14N探针和序列为SEQ ID NO:46的β14M探针;
检测CD43G>T位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:47的β15N探针和序列为SEQID NO:48的β15M探针;
检测CD71/72+A位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:49的β16N探针和序列为SEQID NO:50的β16M探针;
检测IVS2-654C->T位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:51的β17N探针和序列为SEQ ID NO:52的β17M探针;
检测Westmead(WS)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:53的α1N探针和序列为SEQ ID NO:54的α1M探针;
检测Quong Sze(QS)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:55的α2N探针和序列为SEQ ID NO:56的α2M探针;
检测Constant Spring(CS)位点的探针,优选为序列为SEQ ID NO:57的α3N探针和序列为SEQ ID NO:58的α3M探针;
检测α2的探针,优选为序列为SEQ ID NO:62的α2探针;
检测3.7缺失片段的探针,优选为序列为SEQ ID NO:59的3.7探针;
检测4.2缺失片段的探针,优选为序列为SEQ ID NO:60的4.2探针;
检测SEA缺失片段的探针,优选为序列为SEQ ID NO:61的SEA探针;
监控杂交体系是否正常工作的杂交阳性探针,优选地,所述杂交阳性探针的序列为SEQ ID NO:63。
在根据本发明的一个实施方案中,所述PCR试剂包括扩增非缺失型α珠蛋白基因和/或β珠蛋白基因的正义引物及反义引物的PCR mix A、对应所述PCR mix A的阳性对照品A、扩增缺失型α珠蛋白基因的正义引物及反义引物的PCR mix B、对应所述PCR mix B的阳性对照品B;所述PCR mix A和PCR mix B中的正义引物或反义引物的5’端以及所述杂交阳性反序探针的5’端带有生物素标记;其中,
所述阳性对照品A由包含-32C>A、CAP+40-+43(-AAAC)、CD14-15(+G)、CD26G>A、IVS-1-1G>T、CD31(-C)、CD41-42(-TCTT)、CD71/72+A、IVS2-654C->T、Constant Spring(CS)、Westmead(WS)杂合突变位点的质粒组成;所述阳性对照品B由包含α2扩增目的片段的质粒和3.7缺失后扩增目的片段的质粒组成。
在根据本发明的一个实施方案中,所述PCR mix A由序列为SEQ ID NO:1的β1-引物F、序列为SEQ ID NO:2的β1-引物R、序列为SEQ ID NO:3的β2-引物F、序列为SEQ ID NO:4的β2-引物R、序列为SEQ ID NO:5的β3-引物F、序列为SEQ ID NO:6的β3-引物R、序列为SEQID NO:7的β4-引物F、序列为SEQ ID NO:8的β4-引物R、序列为SEQ ID NO:9的α-引物F、序列为SEQ ID NO:10的α-引物R、序列为SEQ ID NO:11的Tag引物和酶及PCR常规组分组成;所述PCR mix B由序列为SEQ ID NO:12的3.7引物F、序列为SEQ ID NO:13的3.7引物R、序列为SEQ ID NO:14的α2引物R、序列为SEQ ID NO:15的4.2引物F、序列为SEQ ID NO:16的4.2引物R、序列为SEQ ID NO:17的SEA引物F、序列为SEQ ID NO:18的SEA引物R和酶及PCR常规组分组成。
在根据本发明的一个实施方案中,所述PCR mix A和PCR mix B中β1-引物F、β2-引物F、β3-引物F、β4-引物F、α-引物F、Tag引物、3.7引物R、α2引物R、4.2引物F、SEA引物R的5’端以及杂交阳性反序探针带有生物素标记;优选地,所述β1-引物F、β2-引物F、β3-引物F、β4-引物F和α-引物F由5’端Tag序列和3’端特异性序列组成。
在根据本发明的一个实施方案中,所述特异性杂交探针的5’端进行AminolinkerC12修饰。
在根据本发明的一个实施方案中,所述条码化磁珠为IntelliPlexTM carboxylbarcoded magnetic beads(BMB)磁珠。
在根据本发明的一个实施方案中,所述杂交试剂还包括显色液、洗液和检测液;优选地,所述显色液为链霉亲和素R-藻红蛋白;更优选地,所述显色液为显色浓缩液,并且以1×TMAC为显色稀释液进行稀释;再优选地,所述洗液为PBS-T溶液。
在根据本发明的一个实施方案中,所述偶联有特异性杂交探针的条码化磁珠是通过包括以下步骤的方法制备的:
将一种特异性杂交探针、条码化磁珠与浓度为25mM、pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液混合,再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应2h,然后用牛血清白蛋白溶液封闭,最后用吐温-20溶液洗涤,得到偶联有一种特异性杂交探针的条码化磁珠;
优选地,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量终浓度为3mg/ml;所述牛血清白蛋白溶液质量百分比为1%,溶剂为pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液;所述吐温-20体积百分比为0.05%,溶剂为pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液。
在根据本发明的一个实施方案中,所述试剂盒的缺失型α珠蛋白基因PCR的扩增条件为:
37℃ 10min;
95℃ 10min;
(97℃20秒、72℃2分50s)×40循环;
72℃ 5分钟;
所述非缺失型α、β珠蛋白基因PCR的扩增条件为:
37℃ 10min;
95℃ 10min;
(95℃30秒、62℃45秒、72℃30秒)×30循环;
(95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒)×25循环;
72℃ 10分钟;
优选地,所述试剂盒实施杂交的条件为95℃变性5分钟后55℃以转速1000rpm孵育25分钟;
所述试剂盒实施显色的条件为55℃1000rpm孵育5分钟;
更优选地,所述试剂盒适用的液相芯片扫描仪为数码多元磁珠荧光酶标分析仪MA100或DigiPlex。
在根据本发明的一个实施方案中,所述试剂盒是通过包括以下步骤的方法实施的:
a)将所述的PCR mix A和PCR mix B分别对筛查基因进行扩增;
b)将步骤a)得到的两种扩增产物同时与液相芯片杂交;
c)通过磁力聚集磁珠去除上清,洗涤磁珠;
d)用显色液进行显色处理,再通过磁力聚集磁珠去除上清,洗涤磁珠后加入检测液;
e)使用液相芯片扫描仪进行磁珠识别和信号读取,利用软件对结果进行自动判读。
另一方面,本发明还具有以下有益效果:
1)本发明具有操作简单、反应快、通量高、数字化的优点。利用本试剂盒在一次实验内可同时完成3个α缺失型突变、3个α非缺失型突变和17个β非缺失型突变共23种突变位点的检测。单人使用96孔微孔板结合排枪操作可在6小时内一次最少完成96个样本的检测,并且,检测结果以数字形式呈现,调用软件自动判读,避免使用目前常用方法反向点杂交法(RDB)和跨越断裂点PCR(Gap-PCR)电泳法时肉眼判读所带来的人为主观性影响。
2)本发明使用IntelliPlexTM液相芯片技术,利用可见光解码条码化的磁珠(BMB),不会造成荧光标记的光漂白,与显色荧光无交叉干扰,并且还可进一步配合自动化仪器设备实现全自动操作,最大程度地降低了工作量。
附图说明
图1是本发明的地中海贫血基因检测试剂盒对样本进行检测的使用流程图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本发明,并非用于限制本发明。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1扩增地中海贫血基因靶标片段的PCR mix和阳性对照品的配制
1.PCR引物设计合成
根据人群中地中海贫血基因的突变热点分布情况,从NCBI下载基因组序列,根据序列1(gi|568815587:c5227271-5225466Homo sapiens chromosome11,GRCh38.p2PrimaryAssembly),设计出扩增产物涵盖所有非缺失型β珠蛋白基因突变位点的上下游特异引物序列;并根据序列2(gi|568815582:165047-186210Homo sapiens chromosome 16,GRCh38.p2Primary Assembly)设计出扩增产物涵盖所有非缺失型和缺失型α珠蛋白基因突变位点的上下游特异引物序列,并设计出与人类基因组无同源性的Tag序列。扩增点突变所在基因组的上游特异引物序列合并Tag序列作为最终的点突变上游PCR引物,引物5’端进行生物素修饰。Tag序列同时作为一条单独的引物在5’端也进行生物素修饰,用于制备单链产物。扩增a2片段和3.7缺失片段的上游引物使用同一特异序列,分别在a2下游引物R、3.7下游引物R、SEA下游引物R和4.2上游引物F的5’端进行生物素修饰。
所有引物在Invitrogen公司合成(具体引物序列如表1所示),每条引物用灭菌纯化水配制成100μmole/L的储存液,使用时稀释成10μmole/L的工作液。
2.阳性对照
本发明根据目标检测的位点,设计PCR扩增和杂交的阳性对照质粒,分为突变对照A和缺失对照B两种,所述突变对照A为点突变扩增的靶标区域,其中-32C>A、CAP+40-+43(-AAAC)、CD14-15(+G)、CD26G>A、IVS-1-1G>T、CD31(-C)、CD41-42(-TCTT)、CD71/72+A、IVS2-654C->T、Constant Spring(CS)、Westmead(WS)是杂合突变位点。所述缺失对照B为包含α2扩增目的片段的质粒和3.7缺失后扩增目的片段的质粒混合物。此对照用于监控PCR扩增体系和条件是否正常工作、杂交探针是否能准确判读。
突变对照A质粒是Invitrogen公司按照点突变靶标基因序列进行oligo合成和PCR拼接,靶标基因序列包含11个阳性突变位点,然后克隆到T载体中,将载体转入宿主菌中,测序验证和筛选。提取质粒,紫外分光光度计定量,稀释至105拷贝/ul于-20℃保存备用。
缺失对照B是分别利用a2和3.7特异引物扩增出目的片段,由信诺金达公司克隆到T载体中,将载体转入宿主菌中,测序验证和筛选。分别提取a2质粒和3.7质粒,紫外分光光度计定量,将两种质粒混合稀释至终浓度106拷贝/μL于-20℃保存备用。
3.PCR mix配置
PCR Mix是PCR扩增预混和溶液,含有DNA聚合酶、dNTPs、引物、缓冲液等PCR扩增必需组分,但是其中不包含扩增模板。
利用上述PCR引物扩增地贫中海贫血靶基因片段,由于检测非缺失型突变和缺失型突变的扩增产物片段差异较大,因此分为PCR mix A和PCR mix B两个体系。
非缺失型α、β珠蛋白基因PCR mix A所用引物为β1-引物F、β1-引物R、β2-引物F、β2-引物R、β3-引物F、β3-引物R、β4-引物F、β4-引物R、α-引物F、α-引物R、Tag引物。每个反应体系23μL,包含10×PCR Buffer 2.5μL、2.5mM dNTP mix 2μL、HS Taq Polymerase 1.5U、5M甜菜碱3.75μL、Tag引物1μM、上述其余引物各0.2μM。
缺失型α珠蛋白基因PCR mix B所用引物为3.7引物F、3.7引物R、α2引物R、4.2引物F、4.2引物R、SEA引物F、SEA引物R。每个反应体系23μL,包含10×PCR Buffer 2.5μL、2.5mMdNTP mix 2μL、HS Taq Polymerase 2.5U、5M甜菜碱5μL、3.7引物F 0.4μM、上述其余引物各0.2μM。
表1地中海贫血基因的PCR引物序列
引物名称 | 序列编号 | 序列(5'-3') |
β1-引物F | SEQ ID NO:1 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATCCCCTAGGGTTGGCCAATC |
β1-引物R | SEQ ID NO:2 | TCCTCAGGAGTCAGATGCA |
β2-引物F | SEQ ID NO:3 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATCAGTCTGCCGTTACTGCC |
β2-引物R | SEQ ID NO:4 | CATGCCCAGTTTCTATTGGTC |
β3-引物F | SEQ ID NO:5 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATCTGGTCTATTTTCCCACCCTTAG |
β3-引物R | SEQ ID NO:6 | CTCACTCAGTGTGGCAAAG |
β4-引物F | SEQ ID NO:7 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATCTCATGCCTCTTTGCACCAT |
β4-引物R | SEQ ID NO:8 | GCAGAATGGTAGCTGGATTG |
α-引物F | SEQ ID NO:9 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATCTTCTCTGCACAGCTCCTAAG |
α-引物R | SEQ ID NO:10 | CAGGAGGAACGGCTACC |
Tag引物 | SEQ ID NO:11 | TACGGCTGGCTACTTCGACGACTACGGATC |
3.7引物F | SEQ ID NO:12 | CACAGGGGCCTTCTCTCCCCTGTCCTTTCCCTA |
3.7引物R | SEQ ID NO:13 | GACGTCCCAGGCAGAAAGCCAGCCAGTTCTTG |
α2引物R | SEQ ID NO:14 | GGCTGCTGCCCACTCAGACTTTATTCAAAGACCAGG |
4.2引物F | SEQ ID NO:15 | CTAGGCCTGCCACACCCTTCCCAGTTTACCCA |
4.2引物R | SEQ ID NO:16 | CTGTCTGCCACCCTCTTCTGACTCTGCCCACA |
SEA引物F | SEQ ID NO:17 | CACCCTCCCACAGTTCCTGCCCTGACTCCAATA |
SEA引物R | SEQ ID NO:18 | TAAGCAGACAGCGTCACCCTCAGAGCCATCACC |
实施例2包含地中海贫血基因位点特异性探针的液相芯片的制备
1.探针的设计与合成
通过NCBI SNP数据库确定地中海贫血靶基因序列上各热点突变的分布和具体的突变碱基情况,设计位点特异性探针,每个非缺失型位点分别设计检测野生模板的N探针和检测阳性突变的M探针,缺失型位点则分别设计1条检测缺失后扩增产物的特异探针和公用的1条检测野生模板的特异探针,位点特异探针5’端进行Aminolinker C12修饰,序列与PCR扩增产物的生物素链互补。同时设计与扩增产物片段无同源性的杂交阳性探针和与其互补的杂交阳性反序探针,杂交阳性探针5’端进行Aminolinker C12修饰,杂交阳性反序探针5’端进行生物素修饰。
所有探针在Invitrogen公司合成(探针具体序列如表2所示,每条探针用灭菌纯化水配制成100μmol/L的储存液,使用时将位点特异探针和杂交阳性探针稀释成10μmole/L的工作液,将杂交阳性反序探针稀释成100nmol/L的工作液。
表2地中海贫血基因的杂交探针序列
探针名称 | 序列编号 | 序列(5'-3') |
β1N探针 | SEQ ID NO:19 | GACTTTTATGCCCAGCCCTG |
β1M探针 | SEQ ID NO:20 | GACTTTTATTCCCAGCCCTG |
β2N探针 | SEQ ID NO:21 | CTGACTTTTATGCCCAGCCC |
β2M探针 | SEQ ID NO:22 | CTGACTTTTGTGCCCAGCCC |
β3N探针 | SEQ ID NO:23 | CCTGACTTTTATGCCCAGCC |
β3M探针 | SEQ ID NO:24 | CCTGACTTTCATGCCCAGCC |
β4N探针 | SEQ ID NO:25 | CCCTGACTTTTATGCCCAG |
β4M探针 | SEQ ID NO:26 | CCCTGACTTCTATGCCCAG |
β5N探针 | SEQ ID NO:27 | GGTGTCTGTTTGAGGTTGC |
β5M探针 | SEQ ID NO:28 | ATGGTGTCTGAGGTTGCTA |
β6N探针 | SEQ ID NO:29 | AGATGCACCATGGTGTCTG |
β6M探针 | SEQ ID NO:30 | AGATGCACCCTGGTGTCTG |
β7N探针 | SEQ ID NO:31 | TGCCCCACAGGGCAGTAAC |
β7M探针 | SEQ ID NO:32 | GCCCCACCAGGGCAGTAAC |
β8N探针 | SEQ ID NO:33 | ACGTTCACCTTGCCCCACAGG |
β8M探针 | SEQ ID NO:34 | ACGTTCACCTAGCCCCACAG |
β9N探针 | SEQ ID NO:35 | CCCAGGGCCTCACCACCAAC |
β9M探针 | SEQ ID NO:36 | CCCAGGGCCTTACCACCAAC |
β10N探针 | SEQ ID NO:37 | TGCCCAGGGCCTCACCACCA |
β10M探针 | SEQ ID NO:38 | TGCCCAGGGGCCTCACCACA |
β11N探针 | SEQ ID NO:39 | TTGATACCAACCTGCCCAGGG |
β11M探针 | SEQ ID NO:40 | TGATACCAAACTGCCCAGG |
β12N探针 | SEQ ID NO:41 | CCTTGATACCAACCTGC |
β12M探针 | SEQ ID NO:42 | CCTTGATAGCAACCTGC |
β13N探针 | SEQ ID NO:43 | CCACCAGCAGCCTAAGGGT |
β13M探针 | SEQ ID NO:44 | CCACCAGCACCTAAGGGTG |
β14N探针 | SEQ ID NO:45 | GGACTCAAAGAACCTCTGG |
β14M探针 | SEQ ID NO:46 | AAGGACTCAACCTCTGGGT |
β15N探针 | SEQ ID NO:47 | CAAAGGACTCAAAGAACCT |
β15M探针 | SEQ ID NO:48 | CAAAGGACTAAAAGAACCT |
β16N探针 | SEQ ID NO:49 | GCCATCACTAAAGGCACC |
β16M探针 | SEQ ID NO:50 | GCCATCACTTAAAGGCAC |
β17N探针 | SEQ ID NO:51 | ATATTGCTATTGCCTTAACCCAG |
β17M探针 | SEQ ID NO:52 | ATATTGCTATTACCTTAACCCAG |
α1N探针 | SEQ ID NO:53 | AGGGAGGCGTGCACCGCA |
α1M探针 | SEQ ID NO:54 | AGGGAGGCCTGCACCGCA |
α2N探针 | SEQ ID NO:55 | AACTTGTCCAGGGAGGCG |
α2M探针 | SEQ ID NO:56 | AACTTGTCCGGGGAGGCG |
α3N探针 | SEQ ID NO:57 | CTCCAGCTTAACGGTATT |
α3M探针 | SEQ ID NO:58 | CTCCAGCTTGACGGTATT |
α3.7探针 | SEQ ID NO:59 | TGGGACACACATGGCTAGAACCTCTC |
α4.2探针 | SEQ ID NO:60 | GACCACCAATGCTCTAGCTTAATGGTG |
αSEA探针 | SEQ ID NO:61 | GGACCTGTCCTTCAGCTGTAATCAGC |
α2探针 | SEQ ID NO:62 | CCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCC |
杂交阳性探针 | SEQ ID NO:63 | AAGAGTGAGTTTCAGCCGCA |
杂交阳性反序探针 | SEQ ID NO:64 | TGCGGCTGAAACTCACTCTT |
2.偶联探针与磁珠
取5万颗购自台湾博铼生技的Carboxyl Barcoded Magnetic Beads(BMB)磁珠,离心后去除上清,加入600μL 25mM pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液和100μL的10μM位点特异探针或杂交阳性探针或纯水,接着加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,充分混匀,室温旋转反应2h,去除上清后用含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭30min,去除上清后用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤一次,最后将偶联好探针的条码化磁珠重悬于含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液中4℃保存。
表3磁珠与探针的偶联对应关系
探针名称 | 磁珠编号 | 探针名称 | 磁珠编号 |
β1N探针 | BMB-74 | β12M探针 | BMB-104 |
β1M探针 | BMB-75 | β13N探针 | BMB-105 |
β2N探针 | BMB-77 | β13M探针 | BMB-106 |
β2M探针 | BMB-79 | β14N探针 | BMB-108 |
β3N探针 | BMB-81 | β14M探针 | BMB-109 |
β3M探针 | BMB-83 | β15N探针 | BMB-110 |
β4N探针 | BMB-84 | β15M探针 | BMB-111 |
β4M探针 | BMB-85 | β16N探针 | BMB-112 |
β5N探针 | BMB-86 | β16M探针 | BMB-113 |
β5M探针 | BMB-87 | β17N探针 | BMB-114 |
β6N探针 | BMB-89 | β17M探针 | BMB-115 |
β6M探针 | BMB-90 | α1N探针 | BMB-116 |
β7N探针 | BMB-91 | α1M探针 | BMB-117 |
β7M探针 | BMB-92 | α2N探针 | BMB-118 |
β8N探针 | BMB-95 | α2M探针 | BMB-119 |
β8M探针 | BMB-97 | α3N探针 | BMB-120 |
β9N探针 | BMB-93 | α3M探针 | BMB-121 |
β9M探针 | BMB-94 | α3.7探针 | BMB-88 |
β10N探针 | BMB-98 | α4.2探针 | BMB-124 |
β10M探针 | BMB-100 | αSEA探针 | BMB-125 |
β11N探针 | BMB-101 | α2探针 | BMB-122 |
β11M探针 | BMB-102 | 杂交阳性探针 | BMB-123 |
β12N探针 | BMB-103 | 空白磁珠 | BMB-76 |
3.制备液相芯片
分别将偶联有特异探针的磁珠、偶联有杂交阳性探针的磁珠、无探针只进行封闭的空白磁珠各取40颗混匀,离心后去除上清,加入33μL 1.5×TMAC缓冲液、13.5μL TE缓冲液(pH8.0,Sigma T9285)以及1.5μL100nmole/L杂交阳性反序探针,混合均匀,制备成液相芯片,4℃保存备用。
表4 1.5×TMAC缓冲液配方
实施例3应用地中海贫血基因检测试剂盒对样本进行检测
图1所示为实施本发明的地中海贫血基因检测试剂盒的流程图,现结合图1对本发明的地中海贫血基因检测试剂盒检测样本的方法进行进一步说明。
1.人类DNA基因组的提取
人类DNA基因组的提取可使用市售提取试剂盒或《分子克隆实验指南》第三版中方法,按照使用说明书或《分子克隆实验指南》上的操作方法对全血样本进行提取。
2.PCR扩增
对待检样本DNA和纯水分别进行PCR A和PCR B两个体系的扩增,同时扩增阳性对照品,其中突变对照A使用PCR A体系扩增,缺失对照B使用PCR B体系扩增。23μL PCR mix中分别加入2μL模板。
非缺失型α、β珠蛋白基因PCR mix A进行的PCR程序为:95℃10min;(95℃30秒、62℃45秒、72℃30秒)×30循环;(95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒)×25循环;72℃10分钟。
缺失型α珠蛋白基因PCR mix B进行的PCR程序为:95℃10min;(97℃20秒、72℃2分50s)×40循环;72℃5分钟。
3.杂交
使用包含表2探针的液相芯片与待检样本DNA和阳性对照的PCR产物进行杂交反应,具体操作如下:
a.PCR产物变性
将装有PCR产物的PCR管放置在PCR仪中,95℃变性5min,然后迅速降温至4℃。
b.杂交反应
涡旋混匀多重磁珠杂交液,然后按每孔48μL分装至96孔微孔板中,封膜,在恒温振荡器上55℃预热3min后,揭开封板膜,将同一个样本的PCR A和PCR B产物各取1μL加入同一反应孔中,阳性对照则将突变对照A和缺失对照B产物加至同一反应孔中,杂交总体积50μL。封膜后在恒温振荡器上55℃1000rpm杂交孵育25min。
c.终止反应
揭开封板膜,每个反应孔加入100μL PBS-T(如表5所示),1000rpm30s终止杂交反应。将96孔微孔板放置在磁板上,然后将磁板放置在恒温振荡器中,1000rpm 30s后500rpm2min,吸除上清。
表5 PBS-T缓冲液配方
d.洗涤
每个反应孔加入150μL PBS-T,将96孔微孔板放置在磁板上,然后将磁板放置在恒温振荡器中,1000rpm 30s后500rpm 2min,吸除上清。
e.显色反应
每个反应孔加入50μl浓度为2.5μg/mL的链霉亲和素-藻红蛋白,封膜后在恒温振荡器中55℃1000rpm显色5min。
f.洗涤
每个反应孔加入150μL PBS-T,将96孔微孔板放置在磁板上,然后将磁板放置在恒温振荡器中,1000rpm 30s后500rpm 2min,吸除上清。重复1次。
g.消磁
每个反应孔加入150μL PBS-T,1200rpm振荡10s,消磁器上来回滑动5次,1200rpm振荡10s。
4.上机检测
打开数码多元磁珠荧光酶标分析仪MA100,预热15min。将96孔板放入MA100中,电脑端DeXipher软件输入样本名称后进行扫描,获取各反应孔微珠的荧光信号。
5.结果判读
使用试剂盒配套软件,可直接对检测到的荧光信号值进行分析,并自动判读检测样本的地中海贫血基因型。
判读前若阳性对照和纯水对照不符合预设结果,则认为当次检测结果不准确,不对样本进行判读,若符合预设结果,则对各待检样本进行后续分析判读。结果如表6和表7:
表6样本检测荧光信号值
表7样本基因分型的判读结果
由上述实施例可见,本发明地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒可以对地中海贫血基因准确分型。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (18)
1.一种地中海贫血基因的条码化磁珠液相芯片检测试剂盒,该试剂盒包括扩增地中海贫血基因的PCR试剂和检测地中海贫血基因的杂交试剂,其中,所述杂交试剂包括液相芯片;所述液相芯片由偶联有特异性杂交探针的条码化磁珠、空白条码化磁珠、游离的杂交阳性反序探针和杂交缓冲液组成;
其中,所述特异性杂交探针包含:
检测-32C>A位点的探针、检测-30T>C位点的探针、检测-29A>G位点的探针、检测-28A>G位点的探针、检测CAP+40-+43(-AAAC)位点的探针、检测起始密码子ATG>AGG位点的探针、检测CD14-15(+G)位点的探针、检测CD17A>T位点的探针、检测CD26G>A位点的探针、检测CD27-28(+C)位点的探针、检测IVS-1-1G>T位点的探针、检测IVS-1-5G>C位点的探针、检测CD31(-C)位点的探针、检测CD41-42(-TCTT)位点的探针、检测CD43G>T位点的探针、检测CD71/72+A位点的探针、检测IVS2-654C->T位点的探针、检测Westmead(WS)位点的探针、检测QuongSze(QS)位点的探针、检测Constant Spring(CS)位点的探针、检测α2的探针、检测3.7缺失片段的探针、检测4.2缺失片段的探针、检测SEA缺失片段的探针和监控杂交体系是否正常工作的杂交阳性探针;
其中,检测-32C>A位点的探针是序列为SEQ ID NO:19的β1N探针和序列为SEQ ID NO:20的β1M探针;
检测-30T>C位点的探针是序列为SEQ ID NO:21的β2N探针和序列为SEQ ID NO:22的β2M探针;
检测-29A>G位点的探针是序列为SEQ ID NO:23的β3N探针和序列为SEQ ID NO:24的β3M探针;
检测-28A>G位点的探针是序列为SEQ ID NO:25的β4N探针和序列为SEQ ID NO:26的β4M探针;
检测CAP+40-+43(-AAAC)位点的探针是序列为SEQ ID NO:27的β5N探针和序列为SEQID NO:28的β5M探针;
检测起始密码子ATG>AGG位点的探针是序列为SEQ ID NO:29的β6N探针和序列为SEQID NO:30的β6M探针;
检测CD14-15(+G)位点的探针是序列为SEQ ID NO:31的β7N探针和序列为SEQ ID NO:32的β7M探针;
检测CD17A>T位点的探针是序列为SEQ ID NO:33的β8N探针和序列为SEQ ID NO:34的β8M探针;
检测CD26G>A位点的探针是序列为SEQ ID NO:35的β9N探针和序列为SEQ ID NO:36的β9M探针;
检测CD27-28(+C)位点的探针是序列为SEQ ID NO:37的β10N探针和序列为SEQ ID NO:38的β10M探针;
检测IVS-1-1G>T位点的探针是序列为SEQ ID NO:39的β11N探针和序列为SEQ ID NO:40的β11M探针;
检测IVS-1-5G>C位点的探针是序列为SEQ ID NO:41的β12N探针和序列为SEQ ID NO:42的β12M探针;
检测CD31(-C)位点的探针是序列为SEQ ID NO:43的β13N探针和序列为SEQ ID NO:44的β13M探针;
检测CD41-42(-TCTT)位点的探针是序列为SEQ ID NO:45的β14N探针和序列为SEQ IDNO:46的β14M探针;
检测CD43G>T位点的探针是序列为SEQ ID NO:47的β15N探针和序列为SEQ ID NO:48的β15M探针;
检测CD71/72+A位点的探针是序列为SEQ ID NO:49的β16N探针和序列为SEQ ID NO:50的β16M探针;
检测IVS2-654C->T位点的探针是序列为SEQ ID NO:51的β17N探针和序列为SEQ IDNO:52的β17M探针;
检测Westmead(WS)位点的探针是序列为SEQ ID NO:53的α1N探针和序列为SEQ ID NO:54的α1M探针;
检测Quong Sze(QS)位点的探针是序列为SEQ ID NO:55的α2N探针和序列为SEQ IDNO:56的α2M探针;
检测Constant Spring(CS)位点的探针是序列为SEQ ID NO:57的α3N探针和序列为SEQID NO:58的α3M探针;
检测α2的探针是序列为SEQ ID NO:62的α2探针;
检测3.7缺失片段的探针是序列为SEQ ID NO:59的3.7探针;
检测4.2缺失片段的探针是序列为SEQ ID NO:60的4.2探针;
检测SEA缺失片段的探针是序列为SEQ ID NO:61的SEA探针;
监控杂交体系是否正常工作的杂交阳性探针的序列为SEQ ID NO:63。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR试剂包括扩增非缺失型α珠蛋白基因和/或β珠蛋白基因的正义引物及反义引物的PCR mix A、对应所述PCR mix A的阳性对照品A、扩增缺失型α珠蛋白基因的正义引物及反义引物的PCR mix B、对应所述PCR mix B的阳性对照品B;所述PCR mix A和PCR mix B中的正义引物或反义引物的5’端以及所述杂交阳性反序探针的5’端带有生物素标记;其中,
所述阳性对照品A由包含-32C>A、CAP+40-+43(-AAAC)、CD14-15(+G)、CD26G>A、IVS-1-1G>T、CD31(-C)、CD41-42(-TCTT)、CD71/72+A、IVS2-654C->T、Constant Spring(CS)、Westmead(WS)杂合突变位点的质粒组成;所述阳性对照品B由包含α2扩增目的片段的质粒和3.7缺失后扩增目的片段的质粒组成。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR mix A由序列为SEQ ID NO:1的β1-引物F、序列为SEQ ID NO:2的β1-引物R、序列为SEQ ID NO:3的β2-引物F、序列为SEQ IDNO:4的β2-引物R、序列为SEQ ID NO:5的β3-引物F、序列为SEQ ID NO:6的β3-引物R、序列为SEQ ID NO:7的β4-引物F、序列为SEQ ID NO:8的β4-引物R、序列为SEQ ID NO:9的α-引物F、序列为SEQ ID NO:10的α-引物R、序列为SEQ ID NO:11的Tag引物和酶及PCR常规组分组成;所述PCR mix B由序列为SEQ ID NO:12的3.7引物F、序列为SEQ ID NO:13的3.7引物R、序列为SEQ ID NO:14的α2引物R、序列为SEQ ID NO:15的4.2引物F、序列为SEQ ID NO:16的4.2引物R、序列为SEQ ID NO:17的SEA引物F、序列为SEQ ID NO:18的SEA引物R和酶及PCR常规组分组成。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR mix A和PCR mix B中β1-引物F、β2-引物F、β3-引物F、β4-引物F、α-引物F、Tag引物、3.7引物R、α2引物R、4.2引物F、SEA引物R的5’端以及杂交阳性反序探针带有生物素标记。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述β1-引物F、β2-引物F、β3-引物F、β4-引物F和α-引物F由5’端Tag序列和3’端特异性序列组成。
6.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性杂交探针的5’端进行Aminolinker C12修饰。
7.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述条码化磁珠为IntelliPlexTMcarboxylbarcoded magnetic beads(BMB)磁珠。
8.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述杂交试剂还包括显色液、洗液和检测液。
9.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,显色液为链霉亲和素R-藻红蛋白溶液。
10.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述显色液为显色浓缩液,并且以1×TMAC为显色稀释液进行稀释。
11.如权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述洗液为PBS-T溶液。
12.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述偶联有特异性杂交探针的条码化磁珠是通过包括以下步骤的方法制备的:
将一种特异性杂交探针、条码化磁珠与浓度为25mM、pH6.0的2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液混合,再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应2h,然后用牛血清白蛋白溶液封闭,最后用吐温-20溶液洗涤,得到偶联有一种特异性杂交探针的条码化磁珠。
13.如权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量终浓度为3mg/ml;所述牛血清白蛋白溶液质量百分比为1%,溶剂为pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液;所述吐温-20体积百分比为0.05%,溶剂为pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液。
14.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的缺失型α珠蛋白基因PCR的扩增条件为:
37℃10min;
95℃10min;
(97℃20秒、72℃2分50s)×40循环;
72℃5分钟;
所述非缺失型α、β珠蛋白基因PCR的扩增条件为:
37℃10min;
95℃10min;
(95℃30秒、62℃45秒、72℃30秒)×30循环;
(95℃30秒、65℃45秒、72℃30秒)×25循环;
72℃10分钟。
15.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒实施杂交的条件为95℃变性5分钟后55℃以转速1000rpm孵育25分钟。
16.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒实施显色的条件为55℃1000rpm孵育5分钟。
17.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒适用的液相芯片扫描仪为数码多元磁珠荧光酶标分析仪MA100或DigiPlex。
18.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是通过包括以下步骤的方法实施的:
a)将所述的PCR mix A和PCR mix B分别对筛查基因进行扩增;
b)将步骤a)得到的两种扩增产物同时与液相芯片杂交;
c)通过磁力聚集磁珠去除上清,洗涤磁珠;
d)用显色液进行显色处理,再通过磁力聚集磁珠去除上清,洗涤磁珠后加入检测液;
e)使用液相芯片扫描仪进行磁珠识别和信号读取,利用软件对结果进行自动判读。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |