CN1718742A - 用于诊断β－地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于临床诊断β－地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒。所述核酸杂交膜条包括一基底；以及固定于所述基底上的特异性探针；每一条所述的特异性探针分别针对一个突变的β－珠蛋白基因位点，称为突变探针；所述突变的β－珠蛋白基因位点为选自27－28M、41－42M、654M、－28M、71－72M、17M、β EM、31M、IVS1－1M、43M、－32M、－29M、－30M、14－15M、CAP、IntM和IVS1－5M的一个或一个以上的组合；其中每一条突变探针包含14至20个碱基的序列，在该碱基序列的中部位置包含其相对应的突变的β－珠蛋白基因的突变碱基。本发明所述用于β－地中海贫血疾病诊断的核酸杂交膜条，对正常、突变杂合子、突变纯合子都很容易判断，且信号特异性非常好，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本，且易于在医院进行推广。

Description

用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒

技术领域

本发明涉及用于诊断地中海贫血的核酸杂交膜条，具体地说涉及用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条。

本发明还涉及用于扩增待检样品中DNA的PCR引物。

本发明还涉及用于诊断β-地中海贫血的试剂盒。

背景技术

地中海贫血(简称地贫)是一种常见的遗传性疾病，世界各地都有发生，最多见于西自地中海区域，中经土耳其、中东各国，东至东南亚和我国南部。地中海贫血症的临床表型多样，可以从正常到需要反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年前夭折甚至死胎。由于该病在我国南方的高发病率，对社会和家庭产生巨大的精神和经济压力。然而，目前尚缺乏有效的治疗措施，因此做好遗传咨询和产前诊断，阻止该类病重症患儿的出生，对有效监控此类疾病，提高人口素质有重要意义。

地中海贫血分为α-地中海贫血和β-地中海贫血(简称β-地贫)。β-地中海贫血(简称β-地贫)是一种由β-珠蛋白基因异常导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。

由于地中海贫血的临床症状具有较大的变异性，轻型患者及携带者的检测易出现漏检。随着地中海贫血症分子遗传学研究的进展，使基因诊断成为可能。β-地中海贫血的基因缺陷绝大多数属于非缺失型，即由于基因点突变造成β-珠蛋白合成异常。β-地中海贫血症具有种族特异性，表现为许多突变仅发生在某个别种族中，而且几乎每一种族都具有几种常见的突变。到1998年，在中国β-地中海贫血群体中已发现23种不同的突变类型，大陆各省份共发现22种(其中3种仅见于少数民族)，台湾共发现18种。在中国人群中常见的突变位点有41-42M、654M、-28M、71-72M等，其中5种突变在中国人群中表现出较高的发病频率，约占总发生率的90％以上。表1为β-地中海贫血症各种突变类型发生频率的统计。

表1  β-地中海贫血症各种突变类型发生频率的统计

β-地中海贫血症突变类型	突变发生率(％)
		CD41-42	36.22
IVS-2-654	24.80
		-28	16.54
βE(CD26)	5.12
		CD17	3.94
CD71-72	3.54
		CD43	3.54
-29	1.97
		CD27-28	1.97
其它	2.36
		总计	100

β-地中海贫血症的常用诊断技术有：核酸杂交膜条法、PCR-SSCP、PCR-异源双链分析、PCR-DGGE、PCR-ARMS、PCR-ASO、PCR-RFLP、PCR-错配化学裂解以及DNA芯片(荧光标记玻璃芯片)法等。、

申请号为02117287.0的中国专利申请公开了用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法，提供一种用于临床诊断α-型和β-型地贫的DNA芯片，芯片由一基底和固定于基底上的探针组成，针对迄今已知的α-和β-珠蛋白突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的寡核苷酸探针。

前述DNA芯片在探针设计原理和产品实现载体上都不同于本专利申请。在该专利申请中，采用玻璃片作为基底(即为载体)，即采用玻璃芯片法检测DNA突变，并且在设计探针序列时，将突变的碱基设计在位于探针的端部。该方法的不足之处在于突变探针和正常探针在玻片的同一个位置，只是靠颜色不同来区分，这样突变杂合子的样品就是混合色，不好判断；再加上此法信号的单一性较差，经常伴有假信号，当出现混合信号时有时很难区分是伴有假信号还是突变杂合子。而且用此法进行检测需要购买昂贵的激光扫描仪，中国一般的医院实验室还没有这样的经济条件。这就造成该方法产品在中国的推广具有很大的局限性。

核酸杂交膜条法检测β-地中海贫血症应用的是PCR加反向点杂交(RDB)技术，该技术是在PCR-ASO技术的基础上，1989年由Saiki等人提出的。该方法是将一系列已知的检测探针固定在载体上，由检测样品的PCR产物与之杂交，再通过一系列显色反应，检测样品PCR产物是否有与已知探针互补的系列。该方法具有检测通量大，信号特异性高等特点。从技术原理来说，核酸杂交膜条在本质上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)中的一种，但它不同于一般所说的玻璃DNA芯片，其检测结果用肉眼就可直接判断，而无需购买昂贵的激光扫描仪，更易于在中国的医院进行临床推广。

以尼龙膜为基底的核酸杂交膜条技术，其主要的基本原理如下：寡核苷酸探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端带有氨基标记。经活化处理的尼龙膜带有羧基，可以与氨基形成共价结合。利用这种方法可将寡核苷酸探针按一定的排列规律牢固的固定在尼龙膜的表面。在此基础上结合PCR技术对病人基因组DNA样品进行大量快速扩增，扩增后的PCR产物含有生物素标记(事先标记在PCR引物上)。PCR产物与膜条上的探针进行特异性杂交后，通过生物素、链霉亲和素-过氧化物酶、四甲基联苯胺等一系列反应，有PCR产物杂交上的相应探针位点就会有蓝色杂交信号显示，据此就可判断临床样品相应位点突变的有无。由于膜条上的突变位点大都设计了相应的正常对照，结合正常探针信号有无就可判断相应位点突变是杂合子还是纯合子。其最主要优点为信号特异性强，几无非特异性信号。除此外，其优点主要还有简便易行，技术要求低，仪器设备投入小，易于在发展中国家做临床推广等。医院只需要购买一台普通的PCR仪、一台杂交仪和其它实验室常用设备就可完成整个实验过程，在中国一般的医院实验室都可以做到。

迄今为止，尚无文献报道针对β-地中海贫血症的以尼龙膜为基底或突变基因位于寡核苷酸探针中部的核酸杂交膜条。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于临床诊断β-地贫的核酸杂交膜条。

本发明的另一个目的在于提供用于扩增待检样品中DNA的PCR引物。

本发明的再一个目的在于提供用于诊断β-地中海贫血的试剂盒。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条，包括一基底；以及

固定于所述基底上的特异性探针；其特征在于：

每一条所述的特异性探针分别针对一个突变的β-珠蛋白基因位点，称为突变探针；

所述突变的β-珠蛋白基因位点为选自27-28M、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M、43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM和IVS1-5M的一个或一个以上的组合；

其中每一条突变探针包含14至20个碱基的序列，在该碱基序列的中部位置包含其相对应的突变的β-珠蛋白基因的突变碱基。

与突变位点在寡核苷酸探针的端部相比，突变位点在寡核苷酸探针的中间可明显降低非特异性杂交信号，大大提高检测的特异性。

在本发明中，N代表正常型，M代表突变型，在本发明中涉及到的正常或突变位点的含义列表如下：

表2：

字母	含义
		27-28M	β-珠蛋白第27/28位氨基酸对应的碱基突变
41-42M	β-珠蛋白第41/42位氨基酸对应的碱基突变
		654M	β-珠蛋白第二个内含子的第654位碱基突变
-28M	β-珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变
		71-72M	β-珠蛋白第71/72位氨基酸对应的碱基突变
17M	β-珠蛋白第17位氨基酸对应的碱基突变
		βEM	β-珠蛋白第26位氨基酸对应的碱基突变(即26M)
31M	β-珠蛋白第31位氨基酸对应的碱基突变
		IVS1-1M	β-珠蛋白第一个内含子的第1位碱基突变
43M	β-珠蛋白基因的第43位碱基突变
		-32M	β-珠蛋白基因启动子上游第32位碱基突变
-29M	β-珠蛋白基因启动子上游第29位碱基突变
		-30M	β-珠蛋白基因启动子上游第30位碱基突变
14-15M	β-珠蛋白第14/15位氨基酸对应的碱基突变
		CAP	β-珠蛋白转录起始子发生突变
IntM	β-珠蛋白翻译起始位点突变
		IVS1-5M	β-珠蛋白第一个内含子的第5位碱基突变
654N	第二个内含子的第654位碱基是正常的β-珠蛋白基因，其他后面标注N的可以依此类推

用于该核酸杂交膜条的基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

在本发明的一个优选实施方式中，该基底为尼龙膜。将尼龙膜用活化液预处理30分钟后，激活表面羧基，然后活化的羧基与末端带有氨基标记的寡核苷酸探针的氨基发生反应生成稳定的共价键，从而可将探针固定在尼龙膜表面。

固定于基底上的探针则是针对如上所述的β-珠蛋白突变检测基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计的诊断这些突变的寡核苷酸探针，通过点样装置将探针按照一定规律排列在基底，如尼龙膜等上，经过固定和相关处理后就制成了核酸杂交膜条。

设计突变探针时根据GC含量的不同设计大约14至20个碱基的探针，但每个探针都必须包含有相应的突变位点，一般在中间。

所述的突变探针选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.17中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA，覆盖了β-珠蛋白17个突变位点。在选择探针时，可以根据需要任选一组或多组，然后从每组中任选一条。设计的探针序列见表3：

                                表3  突变探针的DNA序列

序列编号	探针名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.1	27-28M	14	5’GGTGAGGCCCCTGG       3’
SEQ ID NO.2	41/42M	19	5’CAAAGGACTCAACCTCTGG  3’
				SEQ ID NO.3	654M	19	5’ATTGCTATTACCTTAACCC  3’
SEQ ID NO.4	-28M	17	5’CCCTGACTTCTATGCCC    3’
				SEQ ID NO.5	71/72M	17	5’GGTGCCTTTAAGTGATG    3’
SEQ ID NO.6	17M	17	5’TGTGGGGCTAGGTGAAC    3’
				SEQ ID NO.7	BEM	16	5’TTGGTGGTAAGGCCCT     3’
SEQ ID NO.8	31M：	16	5’CTTAGGTGCTGGTGGT     3’
				SEQ ID NO.9	IVS1-1M	16	5’CTGGGCAGWTTGGTAT     3’
SEQ ID NO.10	43M	19	5’GGTTCTTTTAGTCCTTTGG  3’
				SEQ ID NO.11	-32M：	17	5’CCTGACTTTTATTCCCA    3’
SEQ ID NO.12	-29M	17	5’CCCTGACTTTCATGCCC    3’
				SEQ ID NO.13	-30M：	16	5’CCTGACTTTTGTGCCC     3’
SEQ ID NO.14	14/15M	16	5’CCCTGGTGGGGCAAGG     3’
				SEQ ID NO.15	CAP	17	5’CATGGTGTCTGAGGTTG    3’
SEQ ID NO.16	IntM：	17	5’GGTGCACCCTGGTGTCT    3’
				SEQ ID NO.17	IVS1-5M：	16	5’GCAGGTTGCTATCAAG     3’

注：SEQ ID NO.9探针IVS1-1M序列中的W＝A/T。

进一步的，所述核酸杂交膜条还包括固定于所述基底上的针对β-珠蛋白正常基因的特异性探针，称为正常探针，其与突变探针分别固定于基底的不同位置上。

所述的正常探针，是作为对照，以利于更准确的判断突变类型。以上探针也都可以是反向互补的序列。正常和突变探针还可以是不同的区段。

所述的正常探针选自SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.24中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA；每一个正常探针都分别对应于一个或几个突变的β-珠蛋白基因位点；具体见表4和表5：

                    表4：正常探针针对的突变位点

正常探针序列编号	正常探针名称	针对的突变位点
			SEQ ID NO.18	41/42N	41-42M、43M
SEQ ID NO.19	654N	654M
			SEQ ID NO.20	-28N	-28M、-29M、-30M、-32M
SEQ ID NO.21	71/72N	71-72M

SEQ ID NO.22	17N	17M、14-15M
			SEQ ID NO.23	BEN	BEM
SEQ ID NO.24	31N	31M

                               表5  正常探针的DNA序列

序列编号	探针名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.18	41/42N	20	5’CAGAGGTTCTTTGAGTCCTT  3’
SEQ ID NO.19	654N	19	5’GGGTTAAGGCAATAGCAAT   3’
				SEQ ID NO.20	-28N	18	5’TGGGCATAAAAGTCAGGG    3’
SEQ ID NO.21	71/72N	17	5’TCGGTGCCTTTAGTGAT     3’
				SEQ ID NO.22	17N	17	5’TGTGGGGCAAGGTGAAC     3’
SEQ ID NO.23	BEN	16	5’CAGGGCCTCACCACCA      3’
				SEQ ID NO.24	31N	16	5’CTTAGGCTGCTGGTGG      3’

进一步的，上述突变探针和/或正常探针可在5’端或3’端进一步进行氨基或oligo(T)等方式标记，以使探针可以与基底更好地结合。不标记而用紫外联法，也可以固定探针。

上述用于诊断β-地贫的核酸杂交膜条的制备方法包括合成探针，将合成的探针及相应的对照组DNA按一定的顺序点样并排列于基底上，将点样后的探针DNA固定于基底上而制备得到核酸杂交膜条。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了用于扩增待检样品中DNA的PCR引物。所述引物的扩增产物含有可与β-珠蛋白突变检测探针(其中的一部分正常和/或突变探针)发生特异性杂交的DNA序列，所述引物包括两对引物，分别为SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；

其中SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的扩增产物可与654N和/或654M杂交，用于检测654位点突变；SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的扩增产物用于检测除654位点外的其它位点的突变。

                 表6  不同长度的β-珠蛋白基因PCR引物DNA序列

序列编号	引物名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.25	B1	19	5’CACTTAGACCTCACCCTGT   3’
SEQ ID NO.26	B2	20	5’TGACATGAACTTAACCATAG  3’
				SEQ ID NO.27	B3	20	5’TAACAGTGATAATTTCTGGG  3’
SEQ ID NO.28	B4	20	5’CCAGTTTAGTAGTTGGACTT  3’

对上述引物中的部分或全部进行生物素或放射性、荧光(如CY5、CY3、TAMRA)等方式标记，使得扩增的产物中含有相应的标记，以便可以在杂交后对杂交结果进行分析。

根据本发明的再一个方面，提供了用于检测β-地中海贫血症的试剂盒，其中它包含上述的用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条；以及

上述的用于扩增待检样品中DNA的PCR反应液；

核酸杂交的反应温度是40℃～46℃，其最佳反应温度为42℃～44℃。

该试剂盒用于检测β-地中海贫血症时，包括以下步骤：

1)将来自待检样品的DNA用本发明所述的特异性引物进行PCR扩增获得扩增产物；

2)将获得的产物与本发明所述用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条进行杂交；

3)检测结果。

在本发明的一个优选实施方式中，制备本发明所述核酸杂交膜条并利用其检测样品的方法简述如下：

1、膜条的制作

尼龙膜经活化液预处理30分钟后，激活表面羧基；同时，将在5’或3’端带有氨基标记的探针用缓冲液稀释到适当的浓度后，按阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上，此时，氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的共价键，从而将探针固定在尼龙膜表面；最后，用封阻液处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面羧基，膜条制作完成。

2、待检样品DNA的制备

采用煮沸裂解法或全血DNA快速提取试剂盒提取法从血液中提取人基因组DNA。

3、PCR扩增待检样品

扩增的PCR片段包含待测基因片段，且在PCR产物5’端带有生物素标记。

4、杂交

将标记后的待测产物与固定在膜条上的探针进行杂交，其杂交原理与普通核酸杂交相同。杂交温度与探针和标记后的待测样品的长度、GC含量、盐浓度、甲酰胺等有关。在本发明的体系中42℃孵育1.5～4小时后可获得满意的杂交结果。

5、洗脱非特异性结合物

利用不同的洗脱条件，如温度、盐浓度等最大限度的去除非特异性杂交。

6、显色

标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)与PCR产物5’端带有的生物素特异结合，并在过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的存在下发生化学显色反应，膜条上相应探针位置显现蓝色斑点。

7、检测结果

经肉眼观察即可判断检测结果。也可经阅读仪阅读后，对信号与背景进行计算机分析，由相应的软件系统分析获得最终的杂交结果，并自动对结果进行保存和统计。

本发明所述的用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条，其固定于基底的用于检测样本的探针包含了与β-地贫发生相关的主要突变位点，探针序列中将突变的碱基包含在整个序列的大致中间位置，并且突变探针与正常探针分别排列在基底的不同位置上，对正常、突变杂合子、突变纯合子都很容易判断，且信号特异性非常好，可提高诊断效率和诊断准确性、降低成本、缩短诊断时间，降低成本，易于在医院推广。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图说明

图1为本发明以尼龙膜为基底的核酸杂交膜条的检测结果图，其中，由上至下依次为核酸杂交膜条A～C的三个结果图，每个图中，第一排由左至右依次为41-42N、654N、-28N、71-72N、17N、βEN、31N、27-28M，第二排由左至右依次为41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M，第二排由左至右依次为43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM、IVS1-5M；

图2为以玻璃片为基底的DNA芯片的检测结果图，其中，图(A)为正常人的样品，图(B)为发生突变的样品，两个图中，-28位点均在第一排左起第二个，41-42位点均在第二排左起第四个；

图3为本发明以尼龙膜为基底的核酸杂交膜条的检测结果图，其中，由上至下依次为核酸杂交膜条D和E的结果图，每个图中，探针的位置同图1。

具体实施方式

本发明所用实验材料，如无特别说明，均为市售产品。

【实施例1】用于检测β-地贫的核酸杂交膜条的制备

1、探针的制备

按照表3中的序列合成探针，反向互补序列的探针具有与表中序列相同的效果，在此表中不再一一列出。对探针的5’端或3’端进行氨基标记具有相同的效果，合成的方法为常规的DNA合成法。

                                 表3  突变探针的DNA序列

序列编号	探针名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.1	27-28M	14	5’GGTGAGGCCCCTGG         3’
SEQ ID NO.2	41/42M	19	5’CAAAGGACTCAACCTCTGG    3’
				SEQ ID NO.3	654M	19	5’ATTGCTATTACCTTAACCC    3’
SEQ ID NO.4	-28M	17	5’CCCTGACTTCTATGCCC      3’
				SEQ ID NO.5	71/72M	17	5’GGTGCCTTTAAGTGATG      3’
SEQ ID NO.6	17M	17	5’TGTGGGGCTAGGTGAAC      3’
				SEQ ID NO.7	B EM	16	5’TTGGTGGTAAGGCCCT       3’
SEQ ID NO.8	31M：	16	5’CTTAGGTGCTGGTGGT       3’
				SEQ ID NO.9	IVS1-1M	16	5’CTGGGCAGWTTGGTAT       3’
SEQ ID NO.10	43M	19	5’GGTTCTTTTAGTCCTTTGG    3’
				SEQ ID NO.11	-32M：	17	5’CCTGACTTTTATTCCCA      3’
SEQ ID NO.12	-29M	17	5’CCCTGACTTTCATGCCC      3’
				SEQ ID NO.13	-30M：	16	5’CCTGACTTTTGTGCCC       3’
SEQ ID NO.14	14/15M	16	5’CCCTGGTGGGGCAAGG       3’
				SEQ ID NO.15	CAP	17	5’CATGGTGTCTGAGGTTG      3’
SEQ ID NO.16	IntM：	17	5’GGTGCACCCTGGTGTCT      3’
				SEQ ID NO.17	IVS1-5M：	16	5’GCAGGTTGCTATCAAG       3’

注：SEQ ID NO.9探针IVS1-1M序列中的W＝A/T。

                              表5  正常探针的DNA序列

序列编号	探针名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.18	41/42N	20	5’CAGAGGTTCTTTGAGTCCTT   3’
SEQ ID NO.19	654N	19	5’GGGTTAAGGCAATAGCAAT    3’
				SEQ ID NO.20	-28N	18	5’TGGGCATAAAAGTCAGGG     3’
SEQ ID NO.21	71/72N	17	5’TCGGTGCCTTTAGTGAT      3’
				SEQ ID NO.22	17N	17	5’TGTGGGGCAAGGTGAAC      3’
SEQ ID NO.23	BEN	16	5’CAGGGCCTCACCACCA       3’
				SEQ ID NO.24	31N	16	5’CTTAGGCTGCTGGTGG       3’

2、核酸杂交膜条的制作

完成寡核苷酸探针的合成之后，需进行直接寡核苷酸探针的固定。先将尼龙膜裁成一定的大小，并在其上打印好格子和相应格子的探针名称，经活化液预处理30分钟后，激活表面羧基；同时，将在5’或3’端带有氨基标记的探针用探针稀释液稀释到适当的浓度后，用点样装置将各个探针点加于相应的格子上。探针末端的氨基与膜表面活化的羧基发生反应生成稳定的共价键，从而将探针固定在尼龙膜上。最后，用封阻液处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面羧基，核酸杂交膜条制作完成。

                     表7  核酸杂交膜条点样的阵列顺序

41-42N	654N	-28N	71-72N	17N	B EN	31N	27-28M
								41-42M	654M	-28M	71-72M	17M	B EM	31M	IVS1-1M
43M	-32M	-29M	-30M	14-15M	CAP	IntM	IVS1-5M

注：43M和41-42M可同时以41-42N为参照，-32M、-30M、-29M及-28M均可以-28N为正常对照，14-15M和17M可以17N作参照。

【实施例2】用于扩增待检样品中DNA的引物的设计

根据β-地中海贫血症基因突变的序列资料，用两对特异性的、具有不同长度和Tm值、并且在5’端含有生物素标记的引物扩增β-珠蛋白基因的两个片段。这两对引物的核苷酸序列见表6。该表中，SEQIDNO.27和SEQIDNO.28的扩增产物可与654N和/或654M杂交，用于检测654位点突变；SEQIDNO.25和SEQIDNO.26的扩增产物用于检测除654位点外的其它位点的突变。

                  表6  不同长度的β-珠蛋白基因PCR引物DNA序列

序列编号	引物名称	碱基长度(bp)	序列
				SEQ ID NO.25	B1	19	5’CACTTAGACCTCACCCTGT   3’
SEQ ID NO.26	B2	20	5’TGACATGAACTTAACCATAG  3’
				SEQ ID NO.27	B3	20	5’TAACAGTGATAATTTCTGGG  3’
SEQ ID NO.28	B4	20	5’CCAGTTTAGTAGTTGGACTT  3’

【实施例3】待检样品DNA的检测

一、试验用仪器及试剂

1、试验用仪器

PCR仪、DNA电泳仪、分子杂交箱、摇床

2、试验用试剂

(1)3％H₂O₂

(2)20×SSC(pH7.0)：取NaCl175.3g，柠檬酸钠88.2g，加H₂O溶至1000mL，用pH计调pH至7.0，高压灭菌。

(3)10％SDS(pH7.0)：将20g SDS加H2O180mL溶解，用HCl调pH至7.0，最后定容至200mL。

(4)A液(2×SSC，0.1％SDS，pH7.4)：取20×SSC100mL、10％SDS 10mL，加H₂O溶至1000mL，调pH至7.4。

(5)B液(0.5×SSC，0.1％SDS，pH7.4)：取20×SSC25mL、10％SDS10mL，加H₂O溶至1000mL，调pH至7.4。

(6)C液(0.1M柠檬酸钠，pH5.4)：取柠檬酸钠14.7g，溶于450mL水，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至500mL。

(7)链霉亲合素-过氧化物酶(streptavidin-POD)

(8)四甲基联苯胺的(TMB)

二、待检样品DNA的检测

1、待检样品DNA的制备

取三份血样(分别记为A、B、C)，选用以下两种方法的任一种进行提取。

(1)煮沸裂解法

取100μL抗凝全血，加1mL无菌水，充分混匀，室温放置5分钟以裂解红细胞，13000rpm离心1分钟，弃上清可见管底有一白色沉淀；重复此操作1～2次，直至白色沉淀块中几乎见不到血红色。吸干上清液，加入裂解液50μL，充分混匀，于100℃水浴煮10分钟；13000rpm离心5分钟，取上清液即可作为β-地贫PCR模板。

(2)全血DNA快速提取试剂盒提取法

使用Qiagen全血提取试剂盒或亚能生物技术(深圳)有限公司的全血DNA快速提取试剂盒从抗凝全血中抽提人基因组DNA。

2、目的基因的PCR扩增

取PCR-Mix反应管三支，在管壁上做好标记，并于5000rpm离心2秒，而后分别加入已提取的待测样品DNA2μL(含基因组DNA约50～100ng)，此时反应总体系为25μL。

β-PCR Mix-I                 23μL

DNA模板                      2μL(50-100ng)

Total                        25μL

按以下条件进行扩增：

50℃                         15min

95℃                         10min

35循环

72C              5min

扩增的PCR片段包含有待测基因片段，且在PCR产物5’端带有生物素标记。

3、杂交

取15mL塑料离心管，标明待检样品编号，放入同样标有待检样品编号的核酸杂交膜条(由实施例1制备)，加入A液5-8mL及PCR产物，将盖拧上。将塑料管放入沸水中加热10分钟(确保杂交液液面完全位于水浴液面之下)，取出拧紧盖子，放入42℃杂交-箱杂交1.5～4小时。取一只50mL塑料管，加入40mLB液于杂交箱或温箱中预热至42℃。

4、洗膜

取出膜条，移至装有预热B液的50mL管中，于42℃轻摇洗涤15分钟。通过上述操作，可最大限度的去除非特异性杂交。

5、显色

用A液配制1：2000的链霉亲合素-过氧化物酶(streptavidin-POD)溶液。先将膜条用该streptavidin-POD溶液室温轻摇浸泡30分钟，弃去streptavidin-POD溶液；再用A液室温轻摇洗膜两次，每次5分钟；然后用C液室温洗膜1～2分钟，同时配制显色液(显色液需新鲜配制。按顺序加入19mL0.1M柠檬酸钠、1mLTMB、10μL3％H₂O₂，配制而成。)。将膜条浸泡于显色液中，避光显色10～15分钟即可见斑点显现。标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)与PCR产物5’端带有的生物素特异结合，并在过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的存在下发生化学显色反应。这样，有杂交产物的膜条相应探针位置就会显现蓝色斑点。

三份样品的检测结果见图1。如图所示，在膜条A中，71-72N和M及654N、M同时出现蓝色斑点，表明待检样品A为71-72及654双重杂合子；在膜条B中，βEN无斑点，而βEM出现蓝色斑点，表明待检样品B为βEM纯合子；在膜条C中，在41-42N和M同时出现蓝色斑点，表明待检样品C为41-42杂合子。

6、结果判定

通过膜条的显色结果即可判断基因突变的类型，还可进一步经阅读仪阅读后对信号与背景进行计算机分析，直接给出杂交结果，并对结果进行保存和统计分析。

【实施例4】核酸杂交膜条法与玻璃芯片法的对比实验

1、玻璃芯片法

玻璃芯片法为采用以玻璃片为基底的DNA芯片进行检测的方法。用于诊断β-地贫基因突变的以玻璃片为基底的DNA芯片的制备方法及检测方法参见申请号为02117287.0的中国专利申请。

利用该DNA芯片进行检测的结果见图2。在图2中，A图为正常人样品(简称1号样品)，B图为发生突变的样品(简称2号样品)。正常人样品的相应位点为红色，突变均为绿色信号。

如图所示，1号样品的-28位点和41-42位点都为红色；2号样品的41-42位点为绿色信号，发生了突变，-28为黄色信号(红与绿混合信号)，无法判断该样品-28位点是否突变，然后，经测序法检测该样品，证实-28位点没有发生突变。

玻璃芯片法的突变探针和正常探针在同一个位点，只是靠颜色不同来区分，这样突变杂合子的样品就是混合色，不好判断；再加上此法信号的单一性较差，经常伴有假信号，当出现混合信号时有时很难区分是伴有假信号还是突变杂合子。

2、核酸杂交膜条法

核酸杂交膜条法为采用以尼龙膜为基底的膜条进行检测的方法。用于诊断β-地贫基因突变的以尼龙膜为基底的核酸杂交膜条的制备方法及检测方法参见上述实施例1～3。

利用该杂交膜条进行检测的结果见图3。在图3中，D图为正常人样品(简称4号样品)，E图为发生突变的样品(简称5号样品)。如图所示，4号样品膜条的突变探针位置均未出现蓝色斑点，表明4号样品未发生突变；5号样品膜条的-28M和N同时出现蓝色斑点，表明5号样品为-28杂合子。

在核酸杂交膜条法中，由于其探针的设计原理不同与如上玻璃芯片法，突变探针与正常探针分别在不同位置上，对正常、突变杂合子、突变纯合子都很容易判断，且信号特异性非常好。

以上对本发明的实施例的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，这些改变和变形均应属于本发明后附的权利要求所定义的范围。

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>亚能生物技术(深圳)有限公司

<120>用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒

<130>

<160>28

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ggtgaggccc ctgg                        14

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caaaggactc aacctctgg                   19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

attgctatta ccttaaccc                     19

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccctgacttc tatgccc                       17

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggtgccttta agtgatg                       17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tgtggggcta ggtgaac                       17

<210>7

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttggtggtaa ggccct                            16

<210>8

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cttaggtgct ggtggt                            16

<210>9

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ctgggcagwt tggtat                            16

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ggttctttta gtcctttgg                         19

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cctgactttt attccca                           17

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccctgacttt catgccc                           17

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

cctgactttt gtgccc                            16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ccctggtggg gcaagg                        16

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

catggtgtct gaggttg                       17

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ggtgcaccct ggtgtct                       17

<210>17

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gcaggttgct atcaag                        16

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cagaggttct ttgagtcctt                     20

<210>19

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gggttaaggc aatagcaat                      19

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tgggcataaa agtcaggg                       18

<210>21

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

tcggtgcctt tagtgat                         17

<210>22

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tgtggggcaa ggtgaac                         17

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cagggcctca ccacca                          16

<210>24

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cttaggctgc tggtgg                          16

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

cacttagacc tcaccctgt                      19

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

tgacatgaac ttaaccatag                     20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

taacagtgat aatttctggg                     20

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

ccagtttagt agttggactt                     20

Claims (10)

1、一种用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条，包括

一基底；以及

固定于所述基底上的特异性探针；其特征在于：

每一条所述的特异性探针分别针对一个突变的β-珠蛋白基因位点，称为突变探针；

所述突变的β-珠蛋白基因位点为选自27-28M、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M、43M、-32M、-29M、-30M、14-15M、CAP、IntM和IVS1-5M的一个或一个以上的组合；

其中每一条突变探针包含14至20个碱基的序列，在该碱基序列的中部位置包含其相对应的突变的β-珠蛋白基因的突变碱基。

2、根据权利要求1所述的核酸杂交膜条，其特征在于：所述的突变探针选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.17中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA。

3、根据权利要求1至2之一所述的核酸杂交膜条，其特征在于：还包括固定于所述基底上的针对β-珠蛋白正常基因的特异性探针，称为正常探针，其与突变探针分别固定于基底的不同位置上。

4、根据权利要求3所述的核酸杂交膜条，其特征在于：所述的正常探针选自SEQ IDNO.18～SEQ ID NO.24中的至少一个序列或其反向互补序列的DNA；

每一个正常探针都分别对应于一个或几个突变的β-珠蛋白基因位点，其中，SEQ IDNO.18针对的突变位点为41-42M和43M；SEQ ID NO.19针对的突变位点654M；SEQ IDNO.20针对的突变位点为-28M、-29M、-30M和-32M；SEQ ID NO.21针对的突变位点为71-72M；SEQ ID NO.22针对的突变位点为17M和14-15M；SEQ ID NO.23针对的突变位点为BEM；SEQ ID NO.24针对的突变位点为31M。

5、根据权利要求1至4之一所述的核酸杂交膜条，其特征在于：所述的基底选自尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片或微缩磁珠。

6、根据权利要求1或2所述的核酸杂交膜条，其特征在于：所述突变探针在5’端或3’端进行氨基标记。

7、根据权利要求3或4所述的核酸杂交膜条，其特征在于：所述正常探针在5’端或3’端进行氨基标记。

8、用于扩增待检样品中DNA的PCR引物，其特征在于：所述引物的扩增产物含有可与β-珠蛋白突变检测探针(其中的一部分探针)发生特异性杂交的DNA序列，所述引物包括两对引物，分别为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28；其中

SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的扩增产物可与654N和/或654M杂交，用于检测654位点突变；

SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的扩增产物用于检测除654位点外的其它位点的突变。

9、根据权利要求8所述的PCR引物，其特征在于所述引物的5’端进行生物素标记。

10、一种用于诊断β-地中海贫血的试剂盒，其特征在于：它包含

权利要求1所述的用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条；以及

权利要求8所述的用于扩增待检样品中DNA的PCR反应液；

核酸杂交的反应温度是40℃～46℃。

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