CN1183259C - 诊断人类乳头状病毒感染的基因型试剂盒 - Google Patents

诊断人类乳头状病毒感染的基因型试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于诊断人类乳头状病毒(HIV)感染的基因型试剂盒，以及利用该试剂盒测定患者体内分离出DNA样品的基因型以诊断HPV感染的方法。本发明的基因型试剂盒包括一个带有与HPV DNA互补的核苷酸序列的探针的DNA芯片，用于PCR扩增样品DNA的引物，以及用于标记与DNA芯片杂交DNA样品的物质。诊断HPV感染的方法包括使用试剂盒中引物扩增样品得到的DNA，将扩增得到的DNA应用于DNA芯片，使扩增DNA与DNA芯片上的探针杂交，通过标记杂交DNA检测结合在DNA芯片表面的DNA。由于本发明的试剂盒可以简便地诊断HPV感染，准确地测定HPV的基因型，所以本发明的基因型试剂盒可应用于子宫颈癌的早期诊断、预防和治疗。

Description

诊断人类乳头状病毒感染的基因型试剂盒
发明背景
所属技术领域
本发明涉及一种诊断人类乳头状病毒(HPV)感染的基因型试剂盒，尤其涉及一种利用DNA芯片检测被感染患者临床样品中人类乳头状病毒的基因型试剂盒，以及制备所述DNA芯片的方法和利用所述基因型试剂盒诊断HPV感染的方法。
背景技术
子宫癌包括子宫颈癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤等。对于子宫颈癌来说，全球每年约有450000起新病例发生，其中大约有6000起在韩国。由于子宫颈癌(包括子宫颈内上皮瘤形成)占据韩国妇女总癌症发生率的22.1％，其发生率占第一位，死亡率占第二位，所以，预防、诊断和治疗子宫颈癌就成为维护妇女健康最重要的问题。
子宫颈癌经历一个癌症前期，子宫颈内上皮瘤形成(CIN)被认为主要由人类乳头状病毒(HPV)感染引起，特别是特定类型的HPV感染能提高侵染性疾病的发生机率。自从认识到HPV是子宫颈癌的主要病原学因素以来，70多种HPV基因型已被鉴定出。在特殊位置或时期的病灶中选择性的发现了特定的HPV基因型，这些基因型是导致已知HPV感染生物多样性的原因。在肛殖区检测到的HPV基因型中，已有10多种基因型被归类为高风险类，该类基因型是与提高子宫颈癌发展风险联系的。基于以上研究，HPV感染的生物学特征对于诊断和预防子宫颈癌是非常有意义的。
为在子宫颈癌的早期阶段诊断该病，应用最广泛的是Pap涂片测试，该测试是一种细胞学测试，按如下步骤进行：子宫颈表面的最外层细胞经过收集，染色，检测包括中空细胞，上皮细胞内核周孔环的形成在内的组织病理学特征。但是，由于Pap测试的低诊断率(1-15％)和其他限制，额外的更可靠诊断方法如阴道镜检查是很必要的。阴道镜检查对HPV感染的检出率高达70％，但是缺点是设备消费高，需要技术熟练的操作人员，并且不能识别高风险和低风险的HPV感染基因型。所以一直在努力发展一种技术可以检出HPV并且鉴定HPV基因型来补充传统的子宫颈癌检测方法及包括Pap测试在内本方法前身的不足。
检测HPV和鉴定HPV基因型的方法可以归纳为两类，即直接检测HPV DNA和检测扩增DNA。直接检测HPV DNA的方法包括液体杂交(Hybrid Capture kit Digene Diagnostics，silver Spring，MD，USA， www.digene.com)，具有HPV类型特异性探针的Sourthern印迹和点印迹，原位杂交过滤(FISH)等，而检测扩增DNA的方法包括类型特异性PCR(聚合酶链式反应)和普通引物PCR。特别是普通引物组进行的扩增HPV DNA基因型分析通常是采用点印迹杂交，微量滴定板杂交或者线性探针测定。在上述方法中，利用Hybrid Capture的液体杂交和普通引物PCR之后线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。线性探针测定可以通过硝化纤维素膜上固定化寡核苷酸探针检测出大约20种不同的HPV基因型，但是由于该方法的低灵敏度以及实验数据难以解释，使得该方法的可信度低。商业化的HybridCapture试剂盒无须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV DNA，并且可区别出高风险类和低风险类。但是Hybrid Capture试剂盒无法鉴定出感染HPV基因型，由于在高风险类HPV中风险因素是不相同的，换言之，中度风险类是包括在高风险类中的，所以限制了精确确定风险类型。并且，使用RNA探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除感染的可能。
基于以上所述，开发研制一种简单、精确的用于检出HPV感染且鉴定感染HPV基因型的方法是非常必要的。
发明简述
本发明者尝试去检测HPV感染和通过鉴定临床样品中的HPV基因型鉴定HPV类型，以及制备一种基因型试剂盒，该试剂盒包括：一个带有互补于HPV DNA的核苷酸序列的探针的DNA芯片，通过PCR扩增临床样品中的DNA时所用的引物，和标记与所述DNA芯片上探针杂交的扩增DNA的物质(means)，通过该基因型试剂盒即可简便，准确的检测HPV感染和鉴定感染HPV的基因型。
本发明的主要目的是提供一种诊断HPV感染的基因型试剂盒。
本发明还提供一种HPV基因型试剂盒内的DNA芯片的制备方法。
本发明还提供一种利用HPV基因型试剂盒诊断HPV感染的方法。
附图说明
以下是附图的相应说明，有助于清楚理解上述目的和本发明的特征。
图1是代表DNA芯片上探针类型和位置的图解
图2a是显示HPV 16 DNA分析结果的照片
图2b是显示HPV 18 DNA分析结果的照片
图2c是显示HPV 31 DNA分析结果的照片
图2d是显示HPV 33 DNA分析结果的照片
图2e是显示HPV 35 DNA分析结果的照片
图2f是显示HPV 39 DNA分析结果的照片
图2g是显示HPV 45 DNA分析结果的照片
图2h是显示HPV 51 DNA分析结果的照片
图2i是显示HPV 52 DNA分析结果的照片
图2j是显示HPV 56 DNA分析结果的照片
图2k是显示HPV 58 DNA分析结果的照片
图2l是显示HPV 59 DNA分析结果的照片
图2m是显示HPV 66 DNA分析结果的照片
图3a是显示HPV 6 DNA分析结果的照片
图3b是显示HPV 11 DNA分析结果的照片
图3c是显示HPV 34 DNA分析结果的照片
图3d是显示HPV 40 DNA分析结果的照片
图3e是显示HPV 42 DNA分析结果的照片
图3f是显示HPV 44 DNA分析结果的照片
图4a是显示使用本发明DNA芯片进行的46号样品DNA分析结果的照片
图4c是显示使用本发明DNA芯片进行的47号样品DNA分析结果的照片
图4d是显示使用本发明DNA芯片进行的51号样品DNA分析结果的照片
图4e是显示使用本发明DNA芯片进行的52号样品DNA分析结果的照片
图4f是显示使用本发明DNA芯片进行的53号样品DNA分析结果的照片
图4g是显示使用本发明DNA芯片进行的54号样品DNA分析结果的照片
图4h是显示使用本发明DNA芯片进行的57号样品DNA分析结果的照片
图4i是显示使用本发明DNA芯片进行的95号样品DNA分析结果的照片
图4j是显示使用本发明DNA芯片进行的107号样品DNA分析结果的照片
图4k是显示使用本发明DNA芯片进行的115号样品DNA分析结果的照片
图4l是显示使用本发明DNA芯片进行的124号样品DNA分析结果的照片
发明详述
本发明用于诊断人类乳头状病毒(HPV)感染的基因型试剂盒包括：一个带有与HPV DNA互补的核苷酸序列探针的DNA芯片；PCR扩增临床样品DNA所用引物；以及标记与所述DNA芯片上探针杂交的扩增DNA的物质。DNA芯片可以进一步包括位置标记以定位探针，通过标记物质，优选生物素结合的物质，最优选的是链亲合素-R-藻红素(是一种荧光基团和带有生物素结合位点的蛋白质的结合物)进行染色和标记。
所述HPV基因型试剂盒中DNA芯片的制备方法包括如下步骤：制备5′末端胺连接的DNA探针，该探针含有与HPV DNA互补的核苷酸序列；将由此制备的DNA探针固定到乙醛衍生物的固体表面；最后还原未与胺反应的过量乙醛。
制备本发明的DNA芯片的过程在下述步骤中详细描述。
第一步：探针的制备
带有与HPV DNA互补核苷酸序列的5′末端胺连接的DNA探针是这样制备的：设计并合成探针的核苷酸序列，使其带有与HPV DNA互补的核苷酸序列，优选HPV DNA的L1区，通过将胺基连接到核苷酸序列5′末端来制备探针，这样胺基可使探针结合到乙醛衍生物固体表面上。
第二步：固定探针
将第一步中制得的探针固定在固体支持物的乙醛衍生物表面，优选玻璃。通过固体支持物表面的乙醛基团与探针5′末端胺基之间的西夫氏碱反应将探针固定在固体支持物表面。该反应温度为30-40℃，湿度70-100％，同时控制探针浓度在优选100-300pmol/μl，最优选浓度为200pmol/μl。
第三步：制备DNA芯片
固体支持物表面的未与胺反应的过量乙醛通过NaBH(硼氢化钠)还原剂去除，最终制得DNA芯片。
利用本发明HPV基因型试剂盒诊断HPV感染的方法包括如下步骤：利用HPV基因型试剂盒中的引物，PCR扩增临床样品中的DNA；将扩增得到的DNA应用于DNA芯片，使扩增DNA与DNA芯片上DNA探针杂交；并且在标记杂交DNA之后测定DNA芯片表面上结合的DNA。
利用本发明HPV基因型试剂盒诊断HPV感染的方法进一步在如下步骤中说明。
第一步：扩增样品DNA
临床样品中得到的DNA通过HPV基因型试剂盒中引物扩增，其中聚合酶链式反应(PCR)中利用生物素-16-dUTP来得到含有生物素的扩增DNA。
第二步：杂交
如上所述的扩增DNA应用于HPV基因型试剂盒DNA芯片，与DNA芯片上的探针杂交。
第三步：检测
与探针杂交的扩增样品DNA通过标记物质被标记，并且利用聚焦激光扫描仪检测：链亲合素-R-藻红素作为优选的标记物质，因为它可将具有高消光系数的荧光团与带有四个生物素结合位点的蛋白质连接起来，因而保证聚焦激光扫描仪对于DNA芯片上的杂交点的高检出率。
本发明所述HPV基因型试剂盒是一种能够简便，准确检测HPV感染以及鉴定HPV感染类型的工具，所以对于子宫颈癌的早期诊断，预防和治疗是很有作用的。
本发明在以下实施例中作了进一步说明，但并不限制本发明的范围。特别是尽管实施例中制备的DNA芯片带有19个探针，但并不能理解为本发明就局限于探针的类型和数量，凡是使用HPV DNA衍生核苷酸序列的生物芯片以及任何使用所述DNA芯片检测试剂盒的变异均属于本发明保护范围。
实施例1：DNA芯片的制备
选择出流行的HPV型，包括13中高风险型(HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66)以及6种低风险型(HPV型6、11、34、40、42、44)，针对于每一种HPV型，制备序列的5′末端带有胺基的特异基因型探针，用来检测HPV基因型。每一种探针的核苷酸序列如下所述：
HPV 16：5′-gtcattatgtgctgccatatctacttcaga-3′(SEQ ID NO：1)，
HPV 18：5′-tgcttctacacagtctcctgtacctgggca-3′(SEQ ID NO：2)，
HPV 31：5′-tgtttgtgctgcaattgcaaacagtgatac-3′(SEQ ID NO：3)，
HPV 33：5′-tttatgcacacaagtaactagtgacagtac-3′(SEQ ID NO：4)，
HPV 35：5′-gtctgtgtgttctgctgtgtcttctagtga-3′(SEQ ID NO：5)，
HPV 39：5′-tctacctctatagagtcttccataccttct-3′(SEQ ID NO：6)，
HPV 45：5′-acacaaaatcctgtgccaagtacatatgac-3′(SEQ ID NO：7)，
HPV 51：5′-agcactgccactgctgcggtttccccaaca-3′(SEQ ID NO：8)，
HPV 52：5′-tgctgaggttaaaaaggaaagcacatataa-3′(SEQ ID NO：9)，
HPV 56：5′-gtactgctacagaacagttaagtaaatatg-3′(SEQ ID NO：10)，
HPV 58：5′-attatgcactgaagtaactaaggaaggtac-3′(SEQ ID NO：11)，
HPV 59：5′-ctgtgtgtgcttctactactgcttctattc-3′(SEQ ID NO：12)，
HPV 66：5′-ctattaatgcagctaaaagcacattaacta-3′(SEQ ID NO：13)，
HPV 6： 5′-atccgtaactacatcttccacatacaccaa-3′(SEQ ID NO：14)，
HPV 11：5′-atctgtgtctaaatctgctacatacactaa-3′(SEQ ID NO：15)，
HPV 34：5′-tacacaatccacaagtacaaatgcaccata-3′(SEQ ID NO：16)，
HPV 40：5′-gctgccacacagtcccccacaccaacccca-3′(SEQ ID NO：17)，
HPV 42：5′-ctgcaacatctggtgatacatatacagctg-3′(SEQ ID NO：18)，
HPV 44：5′-gccactacacagtcccctccgtctacatat-3′(SEQ ID NO：19)，
DNA芯片按如下步骤制备：上述制备的每种探针以200pmol/μl的浓度溶解于3×SSC(45mM柠檬酸钠，0.45M氯化钠pH7.0)，通过微阵列仪(GMS 417 Arrayer，TaKaRa，Japan)在乙醛衍生物硅烷基化的载玻片(CSS-100，CEL，Houston，TX，USA)表面点出点阵列，阵列中点大小为150μm，两点之间间距300μm，然后在37℃且湿度大于70％条件下进行西夫氏碱反应4小时，再用0.2％(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)以及三蒸水洗涤载玻片，然后用NaBH溶液(0.1gNaBH4，30ml磷酸盐缓冲液(PBS)，10ml乙醇)处理载玻片5分钟，以去除未与胺反应的过量乙醛，再用三重蒸水洗涤载玻片，自然干燥。
实施例2：样品制备
为检测人类子宫颈化验标本的HPV感染，从所述样品中提取出DNA，并纯化。为测试样品DNA量是否足够，所述的纯化DNA通过利用β-珠蛋白引物——PC03(5′-acacaactgtgttcactagc-3′，SEQ IDNO：20)和5′-生物素连接的PC04(5′caacttcatccacgttcacc-3′，SEQ IDNO：21)进行PCR扩增。选出那些显示β-珠蛋白DNA扩增的DNA样品，用于下一步HPV DNA的分析。
至于HPV DNA标准，使用含有从下列捐献者获得的HPV序列的质粒DNA:HPV型6，11，40，45，51来源于Dr.Ethel-Michele de Villlers，Angewandte Tumorvirologie，Deutsches Krebsforschungszentrum，Im Neuenheimer Feld 242，69009 Heidelerg，Germany；HPV型35，44和56来源于Dr.Attila Lorincz，Vice President，R&D andScientific Director，Digene Diagnostics，Inc.，2301-BBroadbirch Drive，Silver Spring，MD20904，USA；HPV型42，58和59来源于Dr.Toshihiko Matsukura，Department of Pathology andLaboratory of Pathology，AIDS Reserch Center，National Institueof Infectious Disease，TOKYO 162，Japan；HPV型33，34，39，52，和66来源于Dr.Gérard Orth，UnitéMixte InstitutPasteur/INSERM(U.190)，Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France..
另外，从下列细胞系分离纯化的DNA作为阳性对照：SiHa cellline(HPV 16，KCLB 30035，Human squamous carcinoma，cervix)和Hila cell line(HPV 18，KCLB 10002，Human epithelial carcinoma，cervix)购于Korean Cell Line Bank(Seoul National University，College of Medicine，Seoul，Korea)。
上述的选择出的样品DNA使用如下引物组进行PCR扩增：GP5+(5′-tttgttactgtggtagatactac-3′，SEQ ID NO：22)和生物素结合的GP6+，Bio-GP6+(5′-Biotin-gaaaaataaactgtaaatcatattc-3′，SEQ IDNO：23)，以及GP5d+(5′-tttkttachgtkgtdgatacyac-3′，SEQ ID NO：24)和GP6d+(5′-gaaahataaaytgyaadtcataytc-3′，SEQ ID NO：25)。修饰过的引物组GP5d+/GP6d+促进临床样品HPV DNA的PCR扩增。在对核苷酸序列的描述中，‘k’表示‘g’或‘t’，‘h’表示‘t’、‘a’或‘c’，‘d’表示‘a’、‘t’或‘g’，‘y表示‘t’或‘c’。
实施例2-1：制备阳性对照组样品
为得到生物素标记的扩增DNA样品，上述纯化HPV16和HPV18DNA用GP5+和Bio-GP6+作为引物进行PCR扩增。PCR在50μl的反应混合液中进行，该反应混合液含有PCR缓冲液(50mM氯化钾，4mM氯化镁，10mM tris-HCl，pH8.3)，0.1μg DNA，4.5mM氯化镁，50pmol每种引物，40μM每种dATP，dCTP，dGTP(Pharmacia)，30μM dTTP(Pharmacia)，10μM生物素-16-dUTP(Boehringer Manheim，Germany)和1u Taq聚合酶(TaKaRa，Japan)，PCR过程为：94℃变性1分钟，40℃引物退火两分钟，72℃进行1.5分钟的延长反应，该过程循环40次。
实施例2-2：HPV标准的制备
同实施例2-1相似步骤制备生物素结合的扩增HPV DNA样品，不同之处在于利用上述各种HPV质粒作为模板。
实施例2-3：制备临床样品中DNA样品
同实施例2-1相似步骤获得生物素结合的扩增HPV DNA样品，不同之处在于所用模板为子宫颈化验标本获得的DNA，引物为GP5+和GP6+，并且PCR过程为：94℃变性1分钟，55℃引物退火两分钟，72℃进行1.5分钟的延长反应，该过程循环40次。
实施例3：使用DNA芯片检测HPV感染
实施例2中得到的扩增DNA样品应用于实施例1中制得的DNA芯片，杂交过程在Cover slip(GRACE Bio-Labs，USA，PC4L-1.0)制成的100μl容积的杂交反应箱中进行。
为保证杂交反应样品的数量，10μl每种扩增产物被用做阳性对照和质粒DNA，10μl的HPV扩增产物和5μl β-珠蛋白扩增产物混合液用做子宫颈化验标本得到的DNA。加入3N NaOH溶液(10％v/v)变性所述的反应样品，室温静置5分钟，再加入1M Tris-HCl(Ph7.2，5％v/v)中和，然后加入3N HCl(10％v/v)，冰水中冷却5分钟。再将样品与6×SSPE(磷酸钠盐-EDTA缓冲液，Sigma Chemical Co.，St。Louis，MO，USA)和0.2％SDS(十二烷基硫酸钠)组成的杂交液混合，应用于DNA芯片，40℃条件下杂交2小时，然后用3×SSPE洗涤2分钟，1×SSPE洗涤2分钟，再于室温自然干燥。与样品DNA杂交的DNA芯片用含有5μl链亲和素-R-藻红素偶联物(50μg/ml)和95μl 3×SSPE的混合液染色25分钟，然后用1×SSPE洗涤，再用聚焦激光扫描仪(GMS 418 ArrayScanner，TaKaRa，Japan)分析荧光信号(吸收波长480nm，激发波长＞520nm)(见图1，图2a-2m，3a-3f，4a-4l)。图1是DNA芯片上代表探针类型和位置的图解：数字代表每种HPV探针，‘bg’表示用于检测合适杂交结果的β-珠蛋白探针，‘M’代表用于定位探针的位置标记，空心圆(○)代表HPV和β-珠蛋白探针固定的位置，实心圆(●)代表‘M’位置。图2a-2m是显示使用HPV质粒和子宫颈癌细胞系对于高风险型HPV DNA的分析结果：图2a是HPV 16 DNA分析结果的照片，图2b是HPV 18 DNA分析结果的照片，图2c是HPV 31 DNA分析结果的照片，图2d是HPV 33 DNA分析结果的照片，图2e是HPV 35DNA分析结果的照片，图2f是HPV 39 DNA分析结果的照片，图2g是HPV 45 DNA分析结果的照片，图2h是HPV 51 DNA分析结果的照片，图2i是HPV 52 DNA分析结果的照片，图2j是HPV 56 DNA分析结果的照片，图2k是HPV 58 DNA分析结果的照片，图2l是HPV 59 DNA分析结果的照片，图2m是HPV 66 DNA分析结果的照片，图3a-3f是显示使用HPV质粒分析低风险类HPV DNA的结果照片：图3a是显示HPV 6DNA分析结果，图3b是显示HPV 11 DNA分析结果，图3c是显示HPV34 DNA分析结果，图3d是显示HPV 40 DNA分析结果，图3e是显示HPV 42 DNA分析结果，图3f是显示HPV 44 DNA分析结果。如在图2a-2m和图3a-3f所示，无须显著交差杂交即可在相应探针上清楚地观察到HPV质粒标准对照和HPV阳性对照(子宫颈癌细胞系)的扩增DNA产生的杂交信号。
实施例4：使用DNA芯片检测临床样品中HPV感染
为检测本发明DNA芯片诊断的准确性和有效性，临床样品进行PCR扩增，所用引物含有SEQ ID NO：20-25的核苷酸序列，然后针对合适样品，利用DNA芯片进行诊断以检出HPV感染以及确定感染类型。
124例在子宫颈部获得的样品被分离，然后通过实施例2-3中所述方法扩增，再用实施例3中所述的本发明DNA芯片分析HPV感染，上述124例分离出的DNA进行PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)鉴定，该PCR-RFLP鉴定中，DNA扩增后用限制性酶AvaII，AfaI、BglII、AccI或AvaI处理，然后分析限制性酶作用后得到的片段模式，以确定HPV感染的6种类型(HPV16、18、31、33、52和58)。PCR-RFLP的结果通过类型特异性PCR技术确定(见：Hwang，T.，J.Kor.Med.Sci.，15：593-599，1999；Fujinaga，Y.etal.，J.General Virology，72：1039-1044，1991)。对比两种方法——本分明中的DNA芯片和PCR-RFLP及其随后的类型特异性PCR——的结果，以鉴定DNA芯片方法诊断的有效性(见图4a-4l，表1)。图4a-4l是显示子宫颈化验标本样品中HPV感染的DNA芯片分析结果的照片，如图4a-4l所示，使用本发明的DNA芯片，可准确检测和鉴定HPV感染基因型以实现临床样品中HPV感染的详细诊断。上述124例临床样品通过这两种方法测定，统计其结果的一致程度(见表1)。
表1.采用本发明的试剂盒和较早技术的PCR-RFLP测试方法获得的检测/鉴定基因型结果比较。
  样品号    基因型试剂盒检测/鉴定基因型    PCR-RFLP方法检测鉴定基因型
    34         -        -
    35         -        -
    36         -        HPV 16
    37         HPV 16，56        HPV 16
    38         HPV 58        HPV 58
    39         HPV 56，58        HPV 33
    40         HPV 16        HPV 16
    41         HPV 16        HPV 18
    42         HPV 16        HPV 16
    43         HPV 16        HPV 16
    46         HPV 16        HPV 16
    47         HPV 16        HPV 16
    48         HPV 33        HPV 33
    49         HPV 33        HPV 33
    50       HPV 51      HPV 18
    51       HPV 16      HPV 16
    52       HPV 33      HPV 33
    53       HPV 58      HPV 58
    54       HPV 16，18      HPV 16，18
    57       HPV 58      HPV 58
    58       HPV 33      HPV 33
    59       HPV 18      HPV 18
    60       HPV 18      HPV 18
    62       HPV 39      -
    63       HPV 35      HPV 35
    64       -      -
    65       HPV 58      HPV 58
    66       -      -
    68       无型      HPV 52，58
    69       无型      -
    70       HPV 16      HPV 16
    71       HPV 16      HPV 16
    72       -      -
    73       HPV 16      HPV 16
    75       -      HPV 16
    76       HPV 16      HPV 16
    77       HPV 18      HPV 16
    78       HPV 16      HPV 16
    79       HPV 33，35      HPV 33
    80       HPV 33      HPV 33
    81       HPV 16      HPV 16
    82       HPV 16      HPV 16
    83       -      HPV 33
    84       HPV 16      HPV 16
    85       HPV 16      HPV 16
    86       HPV 16      HPV 16
    87       HPV 16      HPV 16
    88       HPV 16      HPV 16
    89       HPV 58      HPV 58
    90       HPV 16      HPV 16
    91       HPV 16      HPV 16
    92       HPV 16      HPV 16
    93       HPV 16      HPV 16
    94       HPV 16      HPV 16
    95       HPV 16      HPV 16
    96       -      HPV 33
    97       HPV 16      HPV 16
    98       HPV 16      HPV 16
    99       HPV 16      HPV 16
    100       HPV 16      HPV 16
   101      HPV 16    HPV 16
   102      HPV 16    HPV 16
   103      HPV 16    HPV 16
   104      HPV 16    HPV 16
   105      HPV 16    HPV 16
   106      HPV 16    HPV 16
   107      HPV 16    HPV 16
   108      HPV 16    HPV 16
   109      HPV 16    HPV 16
   110      HPV 16    HPV 16
   111      HPV 18    HPV 18
   112      HPV 16    HPV 16
   113      HPV 16    HPV 16
   114      HPV 16    HPV 16
   115      HPV 31，35    HPV 31
   116      HPV 16    HPV 16
   117      HPV 16    HPV 16
   118      HPV 16    HPV 16
   119      HPV 16    HPV 16
   120      HPV 16    HPV 16
   121      HPV 16    HPV 16
   123      HPV 16    HPV 16
   124      HPV 51    HPV 31
表1中，“无型”代表特异性方法未确定出HPV型的情况下，PCR扩增后HPV DNA的存在，“-”代表PCR扩增后HPV DNA不存在。如表1所示，两种方法得到结果对比的良好一致性显示出DNA芯片分析的高可信度。考虑到过程的简单、快速，加之能够方便地检测出基因型多样性和多种感染，DNA芯片分析方法被认为是比PCR-RFLP及其随后的类型特异性PCR和其它相关方法有利得多。基于上述124例样品的结果计算：本发明DNA芯片诊断的准确率为96.5％，其重复率为95％，这被认为是完善更大规模病例研究的原因。FDA(Food and DrugAdministration)证实：用于快速诊断HPV感染的Hybrid Capture试剂盒近来使用率上升。据报道：对于检测和区分高或低风险HPV感染。其准确率为98％，DNA芯片分析与Hybrid Capture试剂盒相比具有竞争性的效率及额外鉴定基因型的优点。以上所述显示：使用本发明基因型试剂盒诊断HPV感染方法在许多方面优于传统用于诊断HPV感染的方法。
以上已清楚解释说明：本发明提供一种用于鉴定感染患者临床样品HPV基因型的基因型试剂盒，以及一种利用该基因型试剂盒鉴定感染病毒基因型的HPV感染诊断方法。本发明所述HPV基因型试剂盒包括：一个带有与HPV DNA互补的核苷酸序列探针的DNA芯片；PCR扩增临床样品DNA所用的引物；以及标记与所述DNA芯片上探针杂交DNA的标记物质。使用本发明所述基因型试剂盒诊断HPV感染的方法包括以下步骤：利用该试剂盒中引物PCR扩增临床样品中的DNA，将扩增DNA应用于DNA芯片，使扩增DNA与DNA芯片上探针杂交；采用基因型试剂盒中标记物质标记与DNA芯片上探针杂交的DNA，之后检测出DNA芯片表面上结合的DNA。本发明所述HPV基因型试剂盒是一种能够简便，准确检测HPV感染以及鉴定HPV感染类型的工具，所以对于子宫颈癌的早期诊断，预防和治疗很有作用。
除以上所示实施例外，本发明还可有各种不同的修改，这些修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，这些修改也属本发明的保护范围。
                            序列表
<110>生物医学实验室有限公司
<120>诊断人类乳头状病毒感染的基因型试剂盒
<130>P0066/BML/PCT
<150>KR 10-2000-0013161
<151>2000-03-15
<160>25
<170>KOPATIN 1.5
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<400>14
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ctgcaacatc tggtgataca tatacagctg       30
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gccactacac agtcccctcc gtctacatat        30
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<212>DNA
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<220>
<223>引物PC03
<400>20
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<223>引物PC04
<400>21
caacttcatc cacgttcacc                    20
<210>22
<211>23
<212>DNA
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<220>
<223>引物GP5+
<400>22
tttgttactg tggtagatac tac               23
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物GP6+
<400>23
gaaaaataaa ctgtaaatca tattc             25
<210>24
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物GP5d+
<400>24
tttkttachg tkgtdgatac yac               23
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物GP6d+
<400>25
gaaahataaa ytgyaadtca taytc             25

Claims (13)

1.一种具有与人类乳头状病毒HPV DNA互补的核苷酸序列的探针，其中探针选自SEQ ID Nos：1-19和与SEQ ID Nos：1-19互补的序列。
2.一种人类乳头状病毒HPV基因型试剂盒，包括：
(i)一个DNA芯片，其上带有探针，探针含有与HPV DNA互补的核苷酸序列，其中探针至少是一个选自SEQ ID Nos：1-19和与SEQ IDNos：1-19互补的序列；
(ii)各种引物，用于PCR扩增临床样品中获得DNA，该引物选自序列为SEQ ID No.22的GP5+，序列为SEQ ID No.23的GP6+，序列为SEQ ID No.24的GP5d+，序列为SEQ ID No.25的GP6d+，以及，
(iii)标记物质，用于标记与所述DNA芯片上探针杂交的扩增DNA。
3.如权利要求2所述的HPV基因型试剂盒，其中DNA芯片包括用于定位探针的位置标记。
4.如权利要求2所述HPV基因型试剂盒，其中标记物质是生物素。
5.如权利要求4所述HPV基因型试剂盒，其中标记物质是以链亲和素-R-藻红素作为生物素-结合物质。
6.如权利要求2所述的HPV基因型试剂盒，其中包括：
(i)一个DNA芯片，该DNA芯片带有一个或多个探针，该探针选自SEQ ID Nos：1-19和与SEQ ID Nos：1-19互补的序列；
(ii)用于PCR扩增临床样品中DNA的各种引物，该引物由序列为SEQ ID No.22的GP5+，序列为SEQ ID No.23的GP6+，序列为SEQ IDNo.24的GP5d+，序列为SEQ ID No.25的GP6d+组成；以及
(iii)用于标记与所述DNA芯片探针杂交的扩增DNA的生物素，并且使用链亲和素-R-藻红素作为生物素结合物质。
7.一种具有权利要求1的探针的DNA芯片的制备方法，包括如下步骤：
(i)制备5′末端连接胺的DNA探针，该探针带有与HPV DNA互补的核苷酸序列；
(ii)将制得的DNA固定于结合有乙醛衍生物的玻璃面，以及，
(iii)还原未与胺反应的过量乙醛。
8.如权利要求7所述DNA芯片的制备方法，其中探针至少是一个选自SEQ ID Nos：1-19和与SEQ ID Nos：1-19互补的序列。
9.如权利要求7所述DNA芯片的制备方法，其中与玻璃面乙醛衍生物反应的探针浓度范围为100-300pmol/μl。
10.如权利要求7所述DNA芯片的制备方法，其中将探针固定于乙醛衍生的玻璃面是通过胺与乙醛基团之间的西夫氏碱反应进行，该反应环境为温度30-40℃，湿度70-100％。
11.如权利要求7所述的DNA芯片的制备方法，其中乙醛的还原是通过还原剂NaBH4进行。
12.一种在活体外利用HPV基因型试剂盒诊断HPV感染的方法，包括如下步骤：
(i)PCR扩增临床样品DNA，所用引物为权利要求2中HPV基因型试剂盒中的引物，以获得含有生物素的扩增DNA，
(ii)将得到的扩增DNA应用于HPV基因型试剂盒中DNA芯片，使扩增DNA与DNA芯片上的DNA探针杂交，其中探针至少是一个选自SEQID Nos：1-19和与SEQ ID Nos：1-19互补的序列，以及，
(iii)用HPV基因型试剂盒中标记物质标记与探针杂交的扩增DNA后，检测结合在DNA芯片表面上的DNA。
13.如权利要求12所述的利用HPV基因型试剂盒诊断HPV感染的方法，其中PCR扩增临床样品中获得的DNA使用了生物素-16-dUTP。
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