CN1828299A - 检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的禽流感病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测禽流感病毒的方法，属于检验检疫领域。一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1－No.3所示的碱基序列。本发明的有益效果为：快速、敏感、特异、灵敏、操作简单；试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。

Description

检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法

技术领域

本发明涉及检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法，尤指一组用以检测各亚型的禽流感病毒的特异性核苷酸序列、含有这些序列的试剂盒、以及用该组序列与试剂盒检测禽流感病毒的方法，属于检验检疫领域。

背景技术

禽流感是危害养禽业的重要传染病，是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征。根据血凝素(H)和神经氨酸酶(N)，可将A型流感病毒分为不同亚型，已报道的有15种血凝素HA亚型(H1～H15)和9种神经氨酸酶NA亚型(N1～N9)。禽流感病毒呈世界分布，绝大多数禽流感病毒呈隐性感染，不表现任何临床症状，只有少数禽流感病毒具有迅速传播和高致死性的特性，称之为高致病力禽流感病毒(HPAI)。高致病力禽流感通常是由H5和H7亚型禽流感病毒引起的，是严重危害养禽业的重大传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病，我国也将其列为一类检疫对象。1994年，墨西哥在其中部地区发病的商品鸡群中分离出H5N2禽流感病毒；1995年，美国犹他州发生由H7N3引起的禽流感，在方圆800公里的暴发地区内，比较集中的火鸡群相互之间都受到了感染；1997年香港的养鸡场和禽类市场爆发了由H5N1引起的禽流感，并导致人的严重疾病，在全世界引起极大恐慌；1999年，意大利发生了由H7N1引起的禽流感，火鸡的死亡率很高；2001年，香港再度受到禽流感病毒H5N1的困扰。自韩国2001年从上海出口的鸭肉中检测出禽流感病毒H5亚型后，日本、欧盟等对我出口禽肉采取严厉检疫措施，日本声称从我出口的禽肉中多次检出高致病力禽流感病毒H9亚型，2003年4月，在我国受“非典”影响出口滑坡的情况下，日本从我出口鸭肉中三次检出禽流感病毒H5亚型，导致封关。在国内疫情复杂、国外频频对我出口禽肉检出问题的严峻形势下，如果我们不采取严格的检验检疫措施，势必影响禽肉的出口。

禽流感主要依靠实验室进行确切诊断，诊断方法主包括血清学检测及病原的分离和鉴定两方面。血清学检测的对象是从禽类体内采集血液析出血清后，检测血清中抗体的有无和滴度变化。病原学检测方法的对象是病毒，因为病毒通常在呼吸道和(或)肠道复制，所以一般从活禽或死禽的器官和(或)泄殖腔能分离到病毒，常用棉拭子从活禽气管或泄殖腔取样来分离病毒，也可以直接采集病料组织，棉拭子或病料均可以放入灭菌的保存液，然后送往专门的流感诊断实验室进行诊断。

国家质检总局在2001年下发文件，要求对禽肉出口企业进行每两个月一次的定期监测，该规定要求用鸡胚病毒分离方法。鸡胚病毒分离是一种敏感、特异的方法，但是耗时长，约需3周左右，操作烦琐，只能起到监测作用，不能作快速检测用，不利于快速通关和控制禽肉携带病毒。

技术内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供一种操作简单、结果准确的用与检测禽流感病毒的试剂盒。

本发明的第四个目的是提供一种快捷、准确、方便的检测禽流感病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

禽流感病毒通用引物、探针序列：

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探针：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

作为探针的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)，委托美国Integrated DNA Technologies，inc合成。

选择A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计多对通用引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。进行大量筛选试验得到以上序列，该通用引物和探针序列不仅能够用来检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型，而且对其他禽流感病毒亚型也能检出，用其检测常见其他禽类病毒，未发现交叉反应。该通用引物可以在短时间内检测出样本是否感染了禽流感病毒，节约人力和物力和检测时间。

禽流感病毒H5亚型引物、探针序列：

上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探针：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

由于H5亚型的禽流感病毒具有高致病性，且可传染给人类，危害极大，因此在检测到样本被禽流感病毒感染后需要进一步确认感染的病毒是否为H5亚型，做到及早发现，及早处理，防止禽流感蔓延。

一种检测禽流感病毒的试剂盒，以上述禽流感病毒通用引物和探针或者禽流感病毒H5亚型特异引物和探针，其组成如下：

一、样本处理试剂：

裂解液：自INVITROGEN公司购买，货号10296

二、核酸扩增试剂：

1、RT-PCR反应液，见下表：

           表1

组分	终浓度
		10×PCR缓冲液	1×PCR缓冲液
TaqE	1u
		引物I	0.2umol/L
引物II	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L

2、RT-PCR酶：0.25颗/test，购自安发玛西亚公司公司购买，货号27-9259-01。

3、Taq酶：5U/ul，自上海普洛麦格公司购买。

4、DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm

三、对照品

1、阴性对照：灭活的阴性尿囊液(委托专业的SPF鸡场孵育SPF鸡胚至12日龄，无菌抽取鸡胚尿囊液；60℃作用1小时灭活)

2、阳性对照：体外转录的RNA

一种检测禽流感病毒的方法，使用禽流感病毒通用引物和探针或者禽流感病毒H5亚型特异引物和探针，灭活尿囊液为阴性对照，对样本进行RT-PCR反应，并判断结果，其中：

(一)RT-PCR反应的循环条件为：

42℃：30min；

92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec  72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec  40个循环，60℃时设置收集荧光；

(二)结果判定标准：

(1)阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于等于28.0；否则，此次实验视为无效；

(2)Ct值无数值的样本为阴性样本；Ct值≤30.0的样本为阳性；

(3)Ct值大于30.0的样本建议重做：重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。

本发明的有益效果为：1)快速：从样品处理到出结果仅需4小时左右；2)敏感：检测组织脏器和拭子的灵敏度与鸡胚病毒分离基本一致；3)特异：与常见禽类其他病毒不发生交叉反应，而且不仅采用了特异性的引物，还采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统PCR方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果；4)灵敏：由于采用了特异性的荧光探针和高灵敏度的荧光PCR仪，使该方法比传统的PCR方法灵敏度高100～1000倍。对于禽流感病毒尿囊液，稀释至10^-7仍可检出，接近鸡胚病毒分离；5)操作简单：试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任该项工作。

下面结合较佳实施例对本发明作进一步说明，可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明，凡依照本发明的内容所做的任何本领域的等同替换均属于本发明的保护范围之内。

具体实施方式

实施例1.筛选通用引物和探针序列

一.材料：涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存

二.方法

(一)设计合成引物和探针序列

A型流感病毒的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，本试剂盒选择禽流感病毒RNA作为靶区域。选择A型禽流感病毒的共有NP基因序列设计多对通用引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

引物和探针从不同厂家合成，如上海生工、大连宝生物、国外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE纯或HPLC纯，到货时同时提供厂家对该产品的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。收到引物后做HPLC分析，应该得到单吸收峰图谱、用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，则视为合格引物。

(二)筛选和配对

1.通过引物、探针的筛选实验将上述上游引物和下游引物结合探针位置进行配对，PCR反应体系如表2所示：

        表2 PCR反应体系

组分	终浓度
		RT-PCR beads	0.25粒
TaqE	1u
		引物I	0.2umol/L
引物II	0.2umol/L
		探针	0.1umol/L
模板RNA	10ul
		补DEPC水至	25ul

RT-PCR beads为Amersham Pharmacia Biotech Inc的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)

2.PCR循环参数如下：

42℃：30min；92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec  72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光；

3.采用上述条件对禽流感病毒的毒株尿囊液10⁵倍稀释提取RNA，选取合适的引物搭配进行扩增，同时对阳性模板10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8进行扩增，得到效率和升幅较高的引物及与之配对的探针序列。

三.结果

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探针：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)，委托美国Integrated DNA Technologies，inc合成。该组通用引物和探针序列可用于检测各型禽流感病毒。

四.阳性对照品的制备：

1.扩增目的核酸片段

按表1配方配成RT-PCR反应液，加入阳性H5-1 RNA模板，用PE2400扩增仪进行PCR扩增，扩增条件见表2，以期得到大量的目的片段。PCR完毕，用1.8％琼脂糖凝胶电泳的方法检测扩增产物，紫外灯下见到一条分子量大小正确的特异性亮带、无非特异性扩增带，则证明扩增成功，保留PCR产物备用。

RT-PCR酶：安发玛西亚公司的Ready-To-GoTM RT-PCR Beads(Cat.No.27-9259-01)

RT-PCR反应循环参数

42℃：30min

94℃：5min

95℃：5sec，55℃：30sec，72℃：60sec，40个循环

2.纯化目的核酸片段

采用Promega公司的Wizard PCR Preps DNA Purification System(Cat#A7170、Lot#11356102)试剂盒纯化上述PCR产物中的目的核酸片段。再用1.8％琼脂糖凝胶电泳的方法对纯化的扩增产物进行粗略定量。

3.连接反应

用Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II(Cat#A1380、Lot#86893)试剂盒将目的片段与T载体相连接。

      表3连接反应体系

组分	体积
		2×buffer	5ul
T-vector	1ul
		PCR product	Xul
T4DNA Ligase	1ul
		补加去离子水至	10ul

连接反应中将PCR产物与T载体的数量的比值控制在1∶3-3∶1之间，因为此时连接效率最高。连接反应的条件为：4℃过夜，如不立即进行后续步骤，连接产物保存在4℃。

4.转化

按照Promega公司的PGEM-T Easy Vertor System II的说明书要求，将上述连接产物转化入JM109感受态细胞，然后将转化的感受态细胞涂于含有X-Gal和IPTG的琼脂平板，37℃培养12-16小时。

5.克隆菌落鉴定

从平板上长出的蓝色、白色菌落中随机挑取3-4个白色菌落，提取质粒，用PCR反应液检测，扩增阳性的为合格的克隆菌落。

6.质粒扩增

挑取经鉴定为阳性的菌落，用3-5ml液体LB培养基培养，37℃摇床振荡培养12-16小时。

7.质粒纯化

用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System(Cat#A7100、Lot#10454011)试剂盒进行质粒的提纯，用1.0％琼脂糖凝胶电泳的方法对提纯的质粒进行纯度检测。

8.体外转录

以纯化的质粒为模板，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7(Cat#P1300、Lot#125575)试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后，即得到制备AIV阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

体外转录体系见表4。反应条件为37℃温浴2-4小时。

              表4 T7体外转录体系

组分	终浓度
		5×buffer	20ul
dNTPs(25mMATP，CTP，GTP，TTP)	30ul
		Linear DNA template(5-10ug total)	X ul
Enzyme Mix(T7)	10ul
		补加Nuclease-Free水至	100ul

9.阳性对照品的检验

(1)阳性对照品母液的检验

用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值应在1.8-2.0之间，用合格的试剂进行检定应为阳性。

(2)阳性对照品的检验

将阳性对照品母液用1×TE进行10倍梯度稀释，得到多个梯度稀释液。各个梯度稀释液用合格禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(适用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亚型)进行Ct值标定，取Ct值在22.0～28.0之间的稀释液作为试剂盒的阳性对照，分装后-70℃保存。

实施例2.筛选禽流感病毒H5亚型引物和探针序列

一.材料：涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存，如下：

禽流感病毒H5-1株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-2株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-3株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-4株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-5株：禽流感病毒H5亚型

二.方法

(一)设计合成引物和探针序列

禽流感病毒H5亚型(AIV H5)的基因组由8个单独的单链RNA片段组成，选择HA基因作为靶区域。分两个区域选择其中缺乏二级结构且保守的基因区设计多对引物和探针。引物长度一般为20个碱基左右，GC含量为50％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。

引物和探针从不同厂家合成，如上海生工、大连宝生物、国外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE纯或HPLC纯，到货时同时提供厂家对该产品的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。收到引物后做HPLC分析，应该得到单吸收峰图谱、用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6-2.0之间，则视为合格引物。

(二)筛选和配对

1.通过引物、探针的筛选实验将上述上游引物和下游引物结合探针位置进行配对，PCR反应体系同表2。

2.PCR循环参数如下：

42℃：30min；92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec  40个循环，60℃时设置收集荧光；

3.采用上述条件对禽流感病毒的毒株尿囊液10⁵倍稀释提取RNA，选取合适的引物搭配进行扩增，同时对阳性模板(用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀释10^-1至10^-9，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA备用)10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8进行扩增，得到效率和升幅较高的引物及与之配对的探针序列。

三.结果

上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探针：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

探针的5’端和3’端分别连接荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(TAMRA)，委托美国Integrated DNA Technologies，inc合成。该组引物和探针序列用于特异性地检测H5亚型禽流感病毒。

实施例3.禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒

一.荧光RT-PCR反应体系的优化

(一)方法：将实施例1最终得到的引物浓度从0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L递增，探针浓度从0.025umol/L至0.2umol/L以0.025umol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，其他条件均同表2。

采用上述配比对毒株BJCIQ-H9(北京出入境检验检疫局保存)尿囊液10^-6稀释所提取的核酸进行扩增，循环条件同表3，每组均采用复管进行实验。

(二)结果：从多次重复实验中发现，不同浓度的引物、探针对于该阳性模板，CT值基本稳定在27.6-28.2，但引物浓度为0.2umol/L，探针浓度为0.1umol/L时荧光增幅较高，所以选定引物浓度为0.2umol/L，探针浓度为0.1umol/L作为禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(适用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亚型)引物和探针浓度。

二.试剂盒的组成

(一)样本处理试剂：裂解液(购自INVITROGEN公司，货号10296)

(二)核酸扩增试剂：

1.RT-PCR反应液：同表1。

2.RT-PCR酶：含量12颗，0.25颗/test(购自安发玛西亚公司公司，货号27-9259-01)

3.Taq酶：5U/ul(购自上海普洛麦格公司)

4.DEPC水：自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，电阻率≥18.0MΩ.cm

(三)对照品

1.阴性对照：灭活尿囊液

2.阳性对照：体外转录的RNA(用禽流感病毒H5-1株尿囊液，PBS稀释10^-1至10^-9，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA备用。)

RT-PCR反应液中的引物I、引物II和探针序列为禽流感病毒通用引物、探针序列：

上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA

下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA

探针：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA

本试剂盒适用于检测A型禽流感病毒H1、H2、H3、H5、H7、H9和H13亚型。

实施例4.禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测试剂盒

RT-PCR反应液中的引物I、引物II和探针序列为禽流感病毒H5亚型特异引物、探针序列：上游引物：CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGG

下游引物：ATAAGCCATACCACATTTCTGAAAAAGG

探针：FAM-CCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCC-TAMRA

阳性对照：体外转录的RNA(用禽流感病毒H5-N1尿囊液，PBS稀释10^-1至10^-9，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA备用。)

其余同实施例3。本试剂盒用于检测禽流感病毒H5亚型。

实施例5.检测禽流感病毒的方法

一.样本采集、存放及运输

(一)样本采集：所用取样器材必须经高压或干热灭菌。

若样品为活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。

若样品为新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强，也可取50克肉样，加入50ml无菌的PBS液，用Bagmixer均质器处理后，取上清备用。

若样品为血清、血浆或冷冻组织渗出液，则直接取用。

(二)存放：分离后的样本在2℃-8℃条件下保存应不超过24hr；-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融。

(三)运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。

二.样本处理

(一)取n个1.5ml灭菌离心管(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，作好标记。

(二)首先加入600ul裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec。

(三)于12,000r/min离心15min(如有条件，于4℃进行离心)。

(四)取与步骤(一)中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇(-20℃预冷)，作好标记。

(五)吸取步骤(三)各管中的上清液相转移至相应的管中(上清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层)，颠倒混匀。

(六)12,000r/min离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600ul 75％乙醇(-20℃预冷)，颠倒洗涤。

(七)12,000r/min离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。

(八)4,000r/min离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，室温干燥3min。

(九)每管加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000r/min离心5sec，冰上保存备用。

三.RT-PCR扩增

(一)扩增试剂准备：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000r/min离心5sec。设所需PCR管数为n(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

               表5：

试剂	RT-PCR反应液	Taq酶
			用量	15ul	0.25ul

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/4颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15ul。

(二)加样

在各设定的PCR管中分别加入上述样本处理步骤中制备的RNA溶液各10ul，盖紧管盖，于400r/min离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

(三)RT-PCR反应

循环条件设置：42℃：30min；

              92℃：3min；

              92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

              92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光。

四.结果判定

(一)结果分析条件设定：读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

(二)结果判定：

1.质控标准：阴性对照的检测结果为阴性。

阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。

2.结果判断：Ct值无数值的样本为阴性样本。Ct值≤30.0的样本为阳性。

Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。

实施例6.禽流感病毒通用引物和探针的特异性和灵敏性试验

将建立的检测禽流感病毒的荧光RT-PCR方法检测不同稀释度的鸡胚感染尿囊液，并与鸡胚分离方法比较，评估该方法的灵敏度；检测不同亚型的禽流感病毒标准抗原，评估该方法的敏感性；用该方法检测常见禽类病毒，以评估该方法的特异性。

一.材料与方法

(一)材料

1.病毒株：由北京出入境检验检疫局分离保存，所有毒种均经相应部门鉴定：

禽流感病毒H5N1-AC1株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5N1-AC2株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5N1-AC3株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5N1-AD1株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5N1-AD2株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5N1-AD3株：禽流感病毒H5亚型

BJCIQ-H7-BJV1：禽流感病毒H7亚型

BJCIQ-H7-BJV2：禽流感病毒H7亚型

BJCIQ-H7-GDV1：禽流感病毒H7亚型

BJCIQ-H7-SDV1：禽流感病毒H7亚型

BJCIQ-H9：三株禽流感病毒H9亚型

新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒。(来源于北京出入境检验检疫局动检实验室)

2.SPF鸡胚：购自北京实验动物中心。

3.禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(实施例2)

(二)方法

1.灵敏度试验：

将10株禽流感病毒(6株禽流感病毒H5亚型、2株禽流感病毒H7亚型、2株禽流感病毒H9亚型)的感染尿囊液作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分成两份，一份做荧光RT-PCR，一份接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每天观察两次。

2.对不同亚型的禽流感病毒检测：

用建立的禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(适用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亚型)检测禽流感病毒标准抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13(H1、H2、H3、H13来源于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，H5、H7、H9来源于北京出入境检验检疫局动检实验室)，以验证该方法是否对所有禽流感病毒均可检测。

3.特异性试验：

用禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒检测收集到的常见禽类病毒：新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒。观察是否出现假阳性反应。

二.结果和讨论

1.检测10株禽流感病毒感染尿囊液的敏感性以及与鸡胚病毒分离比较见下表：

表6禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的灵敏度

病毒株	试剂盒测极限	鸡胚最小致死量
			H5N1-AC1	10-7	10-8
H5N1-AC2	10-7	10-8
			H5N1-AC3	10-7	10-8
H5N1-AD1	10-7	10-8
			H5N1-AD2	10-7	10-8
H5N1-AD3	10-7	10-8
			H7-BJV1	10-7	10-8
H7-BJV2	10-7	10-8
			H9N2	10-7	10-5
H9N2	10-6	10-6

从表6中可以看出，在检测禽流感病毒感染鸡胚尿囊液时，鸡胚病毒分离较荧光RT-PCR敏感。荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10^-7，最低为10^-6。

2.检测禽流感病毒标准抗原H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13，结果对于所有抗原该试剂盒均可检出阳性，Ct值基本一致。由此可见：本试剂盒能够检测到可以购买到的禽流感病毒所有的亚型，说明禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的探针、引物具有通用性。

3.检测常见禽类病毒结果，见下表：

表7禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的特异性

病毒株	荧光RT-PCR检测结果
		新城疫F48E9	-
新城疫I系苗	-
		新城疫II系苗	-
新城疫IV系苗	-
		IBDV	-
IBV疫苗(H120)	-
		IBV(H52)	-
KIBV	-

CAAV	-
		鸭瘟病毒	-
鸭肝炎病毒	-

从表7中可以看出，建立的禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒(适用于H1、H2、H3、H5、H7、H9、H13亚型)检测禽流感病毒方法与常见的禽类病毒无交叉反应，说明设计的引物、探针特异性良好。

实施例7.禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR方法的灵敏度、敏感性和特异性实验

将建立的检测禽流感病毒H5亚型的荧光RT-PCR方法检测不同稀释度的鸡胚感染尿囊液，并与鸡胚分离方法比较，评估该方法的灵敏度；用该方法检测其余禽类病毒，以评估该方法的特异性。

一.材料与方法

1.材料

病毒株：该试验涉及的毒种由北京出入境检验检疫局分离保存，具体如下：

禽流感病毒H5-1株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-2株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-3株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-4株：禽流感病毒H5亚型

禽流感病毒H5-5株：禽流感病毒H5亚型

所有毒种均经相应部门鉴定。

SPF鸡胚：购自北京实验动物中心。

2.方法：

(1)禽流感H5亚型荧光RT-PCR检测方法的灵敏度实验：

将5株禽流感病毒H5亚型的感染尿囊液作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10倍稀释，分成两份，一份做荧光RT-PCR，一份接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每天观察两次。

(2)禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测方法对不同亚型的禽流感病毒检测：

用建立的禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测方法检测禽流感病毒标准抗原Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，以验证该方法是否对所有禽流感病毒H5亚型均可检测。

(3)禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测方法的特异性

用禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测方法检测收集到的常见禽类病毒：禽流感H7亚型、禽流感H9亚型、新城疫F48E9、新城疫I系苗、新城疫II系苗、新城疫IV系苗、IBDV、IBV疫苗(H120、H52)、KIBV、CAAV、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒。观察是否出现假阳性反应。

二.结果

1.禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测5株禽流感病毒H5亚型感染尿囊液的敏感性以及与鸡胚病毒分离比较见表8：

        表8 H5亚型荧光RT-PCR检测方法的灵敏度

病毒株	H5亚型荧光RT-PCR检测极限	鸡胚最小致死量
			H5N1-1	10-7	10-8
H5N1-2	10-7	10-8
			H5N1-3	10-7	10-8
H5N1-4	10-7	10-8
			H5N1-5	10-7	10-8

从表8中可以看出，在检测禽流感病毒H5亚型感染鸡胚尿囊液时，鸡胚病毒分离较荧光RT-PCR敏感。荧光RT-PCR检测鸡胚感染尿囊液的最高稀释度为10^-8，最低为10^-7。

2.禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR检测常见禽类病毒结果，见表9：

 表9禽流感病毒H5亚型荧光RT-PCR的特异性

病毒株	荧光RT-PCR检测结果
		禽流感H7亚型	-
禽流感H9亚型	-
		新城疫F48E9	-
新城疫I系苗	-

新城疫II系苗	-
		新城疫IV系苗	-
IBDV	-
		IBV疫苗(H120)	-
IBV(H52)	-
		KIBV	-
CAAV	-
		鸭瘟病毒	-
鸭肝炎病毒	-

从表9中可以看出，建立的H5亚型荧光RT-PCR检测禽流感病毒方法与常见的禽类病毒无交叉反应，说明设计的引物、探针特异性良好。

                             序列表

<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局

     深圳市匹基生物工程股份有限公司

<120>检测禽流感病毒的核苷酸序列、试剂盒及检验方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒通用引物序列

<400>1

cgtcaggccc cctcaaa                   17

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒通用引物序列

<400>2

aagatctgtg ttctttcctg caaa                24

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒通用探针序列

<400>3

cgagatcgcg cagagacttg aagatgt             27

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒H5亚型引物序列

<400>4

cagatcatcc ccaaaagttc ttgg               24

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒H5亚型引物序列

<400>5

ataagccata ccacatttct gaaaaagg            28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>禽流感病毒(avian influenza virus)

<220>

<223>禽流感病毒H5亚型探针序列

<400>6

cctcatcagg ggtgagctca gcatgtcc            28

Claims (7)

1.一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.1-No.3所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的一组用于检测各型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。

3.一组用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQ ID No.4-SEQ ID No.6所示的碱基序列。

4.根据权利要求2所述的一组用于检测H5亚型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQ ID No.6的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团TAMRA。

5.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：采用权利要求1-4所述的核苷酸序列作为检测禽流感病毒的引物I、引物II或探针序列。

6.根据权利要求5所述的一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：其组成如下：

1)裂解液；

2)RT-PCR反应液，终浓度配制成：10×PCR缓冲液；1u TaqE；0.2umol/L引物I；0.2umol/L引物II；0.1umol/L探针；0.1umol/L DNTP；

3)RT-PCR酶：0.25颗/test；

4)Taq酶5U/ul；

5)DEPC水；

6)阴性对照：灭活阴性尿囊液；

7)阳性对照体：外转录的RNA。

7.一种检测禽流感病毒的方法，使用权利要求1或2所述的禽流感病毒通用引物和探针或者权利要求3或4所述的禽流感病毒H5亚型特异引物和探针，灭活尿囊液为阴性对照，对样本进行RT-PCR反应，并判断结果，其中：

(一)RT-PCR反应的循环条件为：

42℃：30min；

92℃：3min；

92℃：10sec，45℃：30sec 72℃：1min  5个循环

92℃：10sec，60℃：30sec 40个循环，60℃时设置收集荧光；

(二)结果判定标准：

(1)阴性对照的检测结果为阴性；阳性对照的Ct值应小于等于28.0；否则，此次实验视为无效；

(2)Ct值无数值的样本为阴性样本；Ct值≤30.0的样本为阳性；

(3)Ct值大于30.0的样本建议重做：重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。