CN1670221A

CN1670221A - 用于禽流感h5、h7和h9亚型多重实时荧光rt－pcr检测的引物、探针序列和方法

Info

Publication number: CN1670221A
Application number: CN 200410027815
Authority: CN
Inventors: 林镜中; 肖性龙; 秦智锋; 吕建强; 钟安清; 刘胜利; 金显忠
Original assignee: SHENZHEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PRC; SHENZHEN TAITAI GENETIC ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2005-09-21
Also published as: WO2006000140A1

Abstract

用于高致病性禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT－PCR检测的核苷酸引物、探针序列和方法；涉及高致病性禽流感H5、H7和H9核苷酸片断的RT－PCR扩增引物和探针及其互补序列，以及同时进行禽流感H5、H7和H9亚型的分型检测方法。

Description

用于禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测的引物、探针序列和方法

技术领域

本发明涉及高致病性禽流感H5、H7和H9亚型核苷酸片断的RT-PCR扩增引物和探针，及同时进行禽流感H5、H7和H9亚型的分型检测方法。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)也叫欧洲鸡瘟或真性鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种急性高度接触性传染病，是国际公认的一种毁灭性疾病，其可以经猪或其它动物传播给人，因此又具有十分重要的生态学和公共卫生学意义，尤其是高致病性禽流感被世界动物卫生组织列为A类传染病。

自1878年Perroncito首次报道了禽流感在意大利的流行后，在欧洲、美洲相继分离到了禽流感病毒，从而开始了禽流感长期伴随人类的历史。目前发现禽流感病毒共有16个血清型，其中高致病性禽流感病毒主要包括H5、H7和H9亚型，潜伏期短、高死亡率和猝死是其主要特征，在短时间内可导致感染鸡群全军覆没，其发病率和死亡率可达100％，造成严重的经济损失。目前，禽流感病毒已广泛分布于世界各地，而且每次暴发都给世界养禽业造成巨大的经济损失。1993年美国宾夕法尼亚州暴发禽流感，投资6000万美元用于捕杀1700万只鸡；1995年由于禽流感的原因，墨西哥淘汰1800万只鸡，封锁3200万只鸡，对1.3亿只鸡进行了紧急疫苗接种，造成10亿美元直接经济损失；1997年香港特区政府曾斥资1亿港币捕杀150万只鸡，2001年再度斥资8000万港币捕杀120万只鸡。可见禽流感严重制约影响着我国乃至世界养禽业的发展，对养禽业造成了极大的打击，已经成为各国进出口检验检疫和疾病监控的重点对象。

近些年发现，禽流感不仅严重危害禽类，而且也危害哺乳动物，尤其是可以感染人并致人死亡。禽流感病毒属于RNA病毒，和所有的RNA病毒一样，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，基因组转录时有较高的错误率，而且其基因组是分节段的，极易发生重排，因而禽流感病毒具有高度的变异性。其基因组中编码糖蛋白HA和NA的基因片段及编码非结构蛋白NS1和NS2的基因片段，在不同的流感毒株之间存在较大差异，而其它基因在禽流感病毒基因组中相对保守。研究发现，禽流感病毒的致病力主要取决于宿主与病毒之间的相互作用关系，而病毒的不同基因片段在决定病毒致病性方面也有不同的作用，其中起主要作用的是编码HA蛋白的基因。通过对大量禽流感病毒HA核苷酸序列和氨基酸序列的分析、比较，发现HA裂解位点的氨基酸序列决定禽流感病毒的毒力，高致病性禽流感的HA裂解位点有6个连续的碱性氨基酸，而低致病性禽流感有2个碱性氨基酸。

尽管人们对禽流感进行了广泛深入的研究，并建立了一些诊断检测方法，但是目前还没有可同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的方法，而实时荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得到了广泛应用，因此可以利用其解决禽流感病毒多血清型和高变异性给临床检测造成的难题。实时荧光定量PCR技术是于1996年被首次推出的，该技术不仅实现了PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

常规反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是先将RNA反转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶在体外快速扩增目的DNA片断的技术。荧光实时RT-PCR是在普通RT-PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，从而检测不到该探针荧光基团所发出的荧光信号，而在PCR扩增时，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在目的扩增片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，此时可以检测到荧光报告基团的荧光信号，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比。

多重实时荧光PCR是在同一反应体系中加入多对引物和探针，同时检测多个目的片断的方法，在类症疾病的鉴别和多血清型病原的分型检测中具有重要意义。与普通PCR方法相比，具有以下优点：a.使用了荧光标记探针，进一步提高了检测的特异性和准确性；b.通过自动化检测荧光信号的变化，使检测具有更高的灵敏度；c.进行全封闭检测反应，不用对PCR产物进行后期处理，避免了污染；d.可以实时监测结果，提高了检测速度和效率；e.可以实现一管多检，达到省时省力的目的。

由于禽流感病毒具有多个亚型且变异快，疫情的发生情况又较复杂，所以迫切需要建立一种特异敏感、准确可靠、快速简便的高致病性禽流感“一步法”分型检测方法，用于快速检测国内外主要流行的高致病性禽流感病毒亚型，从而满足进出口检验检疫和疫病监控的需要。

发明内容

本发明的目的是提供用于禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测的引物、探针序列和方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：通过分析所有已报道的禽流感H5、H7和H9亚型基因组序列，分别设计引物和荧光探针。在常规RT-PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(R)标记在探针的5’端，荧光淬灭基团(Q)标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，荧光淬灭基团(Q)的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行禽流感H5、H7和H9亚型的检测。实时荧光RT-PCR检测反应原理见图1。

引物和探针设计：通过分别对所有已经报道的禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的核苷酸区段设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，而且应分别特异性地针对禽流感病毒H5、H7和H9亚型，相互间不存在交叉反应，可以在一个反应管中同时用于区分H5、H7和H9亚型。

用于检测禽流感H5亚型的核苷酸扩增用引物序列和探针序列包括：

由上游引物H5pf1673序列为GACCAGCTACCATGATTGCCA及互补序列为CTGGTCGATGGTACTAACGGT，下游引物H5pr1600序列为GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG及互补序列为CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC组成的引物对，以及该引物对的上游引物位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列；探针H5pb1655序列为TGCTAGGGAACTCGCCA，互补序列为ACGATCCCTTGAGCGGT以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

用于检测禽流感H7亚型的核苷酸扩增用引物序列和探针序列包括：

1.由上游引物H7pf1292序列为CGTGTCCAATTAATGACATTTCC及互补序列为GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG，下游引物H7pr1202序列为ATCACAGGCAAATTGAATCGT及互补序列为TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA组成的引物对，以及该引物对的上游引物位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列；探针H7pb1247序列为TTTGAGCTGATAGACAATGA及互补序列为AAACTCGACTATCTGTTACT，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

2.由上游引物H7pf1664序列为GCCATTGCAATGGGCCT及互补序列为CGGTAACGTTACCCGGA，下游引物H7pr1736序列为AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA及互补序列为TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT组成的引物对，以及该引物对的上游引物位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列；探针H7pb1712序列为CGGTGCACTATTTGTATA及互补序列为GCCACGTGATAAACATAT，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

用于检测禽流感H9亚型的核苷酸扩增用引物序列和探针序列包括：

由上游引物H9pf151序列为CCTGTGACACATGCCAAAGA及互补序列为GGACACTGTGTACGGTTTCT，下游引物H9pr302序列为CTTTCGACRATGTAGGACCATTC及互补序列为GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG组成的引物对，以及该引物对的上游引物位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物位置向3’端方向延伸10个碱基、向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列；探针H9pb175序列为CTCCACACAGAGCACAAT及互补序列为GAGGTGTGTCTCGTGTTA，该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。

将上述引物、探针序列优化组合后，建立同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重实时荧光RT-PCR检测方法，并制成用于同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测的方法采用以下步骤：

(1)选取权利要求1-9中所述的引物和探针；

(2)制备待测模板，提取各种来源样品中禽流感病毒的基因组RNA；

(3)反应体系的建立，a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定反转录酶(AMV RnaseXL)用量；d、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；e、确定dNTPs浓度；f、确定最佳探针浓度；

(4)选择仪器的检测通道；

(5)上机检测。

禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法中待测模板的制备可采用方法QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取各种来源样品中禽流感病毒的基因组RNA。

本发明的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对一个样品进行一次检测操作即可完成高致病性禽流感H5和H7和H9亚型的检测，并可以确定血清型，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本、提高检测效率等优点。

附图说明

图1 Taqman探针的实时荧光RT-PCR检测原理图。

图2 禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR检测曲线图。

图3 禽流感H5和H9亚型二重实时荧光RT-PCR检测曲线图。

图4 禽流感H7和H9亚型二重实时荧光RT-PCR检测曲线图。

图5 禽流感H5和H7亚型二重实时荧光RT-PCR检测曲线图。

具体实施方式

反应体系的建立和优化：利用灭活的禽流感病毒H5、H7和H9亚型毒株作为待检样品，利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR反应体系的建立和优化：

(1)引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将禽流感H5、H7和H9的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比连续稀释，互相组合后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。

(2)镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。

(3)反转录酶(AMV RnaseXL)用量的优化经过使用不同浓度AMV RNaseXL的试验结果比较，选定5U作为试剂盒反应体系中AMV RnaseXL的用量。

(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。

(5)dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选1mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。〕

(6)探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将禽流感H5、H7和H9亚型的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.2μmol/L。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的禽流感H5、H7和H9实时荧光RT-PCR反应体系为50μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。

表1禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR反应中的各组分情况

组分		用量/终浓度
组分		用量/终浓度	10×Buffer		1×
25mmol/L MgCl₂		5mmol/L	10×Buffer		1×
25mmol/L MgCl₂		5mmol/L	dNTP Mixture		1mmol/L
RNase Inhibitor		40Unit	dNTP Mixture		1mmol/L
RNase Inhibitor		40Unit	引物	H5(上、下游)	0.4μmol/L each
H7(上、下游)	0.4μmol/L each			H5(上、下游)	0.4μmol/L each
H7(上、下游)	0.4μmol/L each	H9(上、下游)		0.4μmol/L each
探针	H5、H7、H9	H9(上、下游)		0.4μmol/L each	分别为0.2μmol/L
探针	H5、H7、H9	模板	H5、H7、H9	分别为10μl	分别为0.2μmol/L
AMV RNaseXL		模板	H5、H7、H9	分别为10μl	5Unit

AMV Taq

5Unit

注：1.在多重实时荧光RT-PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。

2.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

3.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

仪器检测通道的选择：

在进行禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

实施例1

(1)待测模板的制备

方法一利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各种来源样品中禽流感病毒的基因组RNA，具体操作步骤如下：

a.取560μl含载体RNA的AVL缓冲液至1.5ml的微量离心管中；

b.加入140μl血浆、血清、尿样、细胞培养上清液或拭子的PBS清洗液，旋涡振荡15sec；

c.于室温(15-25℃)下孵育10min；

d.瞬时离心以便将盖上的液体离心至离心管内；

e.再加入560μl无水乙醇，旋涡振荡15sec，瞬时离心，将盖上的液体离心至离心管内；

f.小心吸取630μl上述液体至QIAamp离心柱内(置于2 ml的收集管内)，不要弄湿管口边缘，8000rpm离心1min。弃去含有液体的收集管，将QIAamp离心柱放置于另一2ml的收集管中；

g.小心打开QIAamp离心柱盖，重复步骤f；

h.小心打开QIAamp离心柱盖，加入500μl的AW1缓冲液，8000rpm离心1min。将QIAamp离心柱放置于另一个干净的2ml的收集管上，弃掉含有液体的收集管；

i.小心打开QIAamp离心柱盖，加入500μl的AW2缓冲液，14000rpm离心3min。将QIAamp离心柱放置于另一个干净的2ml的收集管上，弃掉含有液体的收集管，再次14000rpm离心1min；

j.将QIAamp离心柱放置于一个干净的1.5ml的离心管中，小心打开柱盖，加入60μl AVE洗脱缓冲液，室温孵育1min后，8000rpm离心1min即获得病毒RNA，-20℃储存备用。

方法二用Trizol核酸抽提试剂的提取方法

a.收获禽流感病毒致死鸡胚的尿囊液，12000rpm离心去除大分子杂质。将100μl上清液加入1.5ml的离心管中，再向其中加入300μl的TrizoL组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后13000rpm离心15min，将上清移至1.5ml的离心管中；

b.向上清液中加400μl的预冷异丙醇，在振荡器上充分振荡后；

c.13000rpm离心10min以便获得RNA沉淀；

d.小心倒掉上清，加入600μl 75％乙醇，用手上下颠倒数次洗涤。(注意：不能剧烈振荡，防止RNA的断裂和RNA沉淀溶解后难以重新沉淀)；

e.13000rpm离心10min，缓慢吸弃上清，室温干燥约25min，待乙醇完全挥发后加25-40μl无RNA酶的水溶解(充分弹动混匀，或用枪反复吹打)，-20℃储存备用。

(2)禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR反应的扩增条件根据表1加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：

50℃ 30min进行RNA的反转录，95℃ 3min灭活反转录酶；95℃ 15sec变性，55℃ 30sec退火，72℃ 1min延伸，如此重复5个循环进行预扩增；95℃ 10sec变性，60℃ 40sec退火、延伸，如此重复40个循环进行目的片段的扩增检测，试验结果可以实时监测。

(3)禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR的检测结果：在50μl反应体系中，利用针对禽流感H5、H7和H9亚型的特异性引物和探针进行三重实时荧光RT-PCR，检测含有禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线(图2)。

以上试验结果表明，本发明设计的引物和探针特异且工作性能良好，并建立了禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR检测的方法。

实施例2

禽流感H5和H9亚型二重实时荧光RT-PCR检测

在50μl反应体系中，利用针对禽流感H5和H9亚型的特异性引物和探针进行二重实时荧光RT-PCR，检测含有禽流感病毒H5和H9亚型基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线(图3)。

实施例3

禽流感H7和H9亚型二重实时荧光RT-PCR检测

在50μl反应体系中，利用针对禽流感H7和H9亚型的特异性引物和探针进行二重实时荧光RT-PCR，检测含有禽流感病毒H7和H9亚型基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线(图4)。

实施例4

禽流感H5和H7亚型二重实时荧光RT-PCR检测在50μl反应体系中，利用针对禽流感H5和H7亚型的特异性引物和探针进行二重实时荧光RT-PCR，检测含有禽流感病毒H5和H7亚型基因组RNA的阳性样品，结果可以得到特异性的荧光曲线(图5)。

实施例5

按常规方法制备合成相应引物和探针后，与实时荧光RT-PCR所需试剂及阳性对照核苷酸组装成禽流感H5、H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。

H5-H7-H9序列表

序列表

<110>深圳太太基因工程有限公司

中华人民共和国深圳出入境检验检疫局

<120>用于禽流感H5、H7和H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测的引物、探针序列和方

法

<140>200410027815.5

<141>2004-06-25

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaccagctac catgattgcc a 21

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ggagtcaaat ttggaatcaa tgg 23

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctggtcgatg gtactaacgg t 21

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cctcagttta aaccttagtt acc 23

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

H5-H7-H9序列表

<400>5

tgctagggaa ctcgcca 17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acgatccctt gagcggt 17

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgtgtccaat taatgacatt tcc 23

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atcacaggca aattgaatcg t 21

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

gcacaggtta attactgtaa agg 23

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

tagtgtccgt ttaacttagc a 21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tttgagctga tagacaatga 20

H5-H7-H9序列表

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aaactcgact atctgttact 20

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gccattgcaa tgggcct 17

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

agtagaaaca agggtgtttt ttcca 25

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cggtaacgtt acccgga 17

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tcatctttgt tcccacaaaa aaggt 25

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

cggtgcacta tttgtata 18

H5-H7-H9序列表

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gccacgtgat aaacatat 18

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

cctgtgacac atgccaaaga 20

<210>20

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

ctttcgacra tgtaggacca ttc 23

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ggacactgtg tacggtttct 20

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gaaagctgyt acatcctggt aag 23

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

ctccacacag agcacaat 18

<210>24

<211>18

H5-H7-H9序列表

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

gaggtgtgtc tcgtgtta 18

Claims

1、一种能同时检测禽流感H5、H7和H9亚型的多重实时荧光RT-PCR方法，其特征在于所述的方法包括：

(1)通过对禽流感病毒H5、H7和H9亚型已知基因组序列的比较分析，设计出能分别检测禽流感病毒H5、H7和H9亚型的引物和探针序列；

(2)采用Joe、Rox、Ned、Hex、Tet、Fam或Vic荧光素分别标记用于检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的探针序列；

(3)将分别用于禽流感病毒H5和H7或H5和H9或H7和H9两种不同亚型的引物和探针，或分别用于禽流感病毒H5、H7、H9三种不同亚型的引物和探针置于同一个反应管中，使用荧光PCR检测仪进行实时荧光RT-PCR反应。

2、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H5亚型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：

由上游引物Hfpf1673序列为GACCAGCTACCATGATTGCCA和下游引物Hfpr1600序列为GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG组成的引物对；以及上游引物的互补序列CTGGTCGATGGTACTAACGGT和下游引物的互补序列CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC；该引物对的上游引物Hfpf1673位置向5’端方向延伸10个碱基，下游引物H5pr1600位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。

3、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H5亚型的探针序列，其特征在于所述的探针H5pb1655序列为TGCTAGGGAACTCGCCA，互补序列为ACGATCCCTTGAGCGGT，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列。

4、根据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H7亚型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：

由上游引物H7N2pf1292序列为CGTGTCCAATTAATGACATTTCC和下游引物H7N2pr1202序列为ATCACAGGCAAATTGAATCGT组成的引物对；以及上游引物的互补序列GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG和下游引物的互补序列TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA；该引物对的上游引物H7N2pf1292位置向3’端方向延伸10个碱基，下游引物H7N2pr1202位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。

5、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H7亚型的探针序列，其特征在于所述的探针H7N2pb1247序列为TTTGAGCTGATAGACAATGA，互补序列为AAACTCGACTATCTGTTACT，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列。

6、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H7亚型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：

由上游引物H7Nxpf1664序列为GCCATTGCAATGGGCCT和下游引物H7Nxpr1736序列为AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA组成的引物对，以及上游引物的互补序列CGGTAACGTTACCCGGA和下游引物的互补序列TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT；该引物对的上游H7Nxpf1664位置向3’端方向延伸10个碱基，下游引物H7Nxpr1736位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。

7、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H7亚型的探针序列，其特征在于所述的探针H7Nxpb1712序列为CGGTGCACTATTTGTATA，互补序列为GCCACGTGATAAACATAT，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列。

8、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H9亚型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括：

由上游引物H9pf151序列为CCTGTGACACATGCCAAAGA和下游引物H9pr302序列为CTTTCGACRATGTAGGACCATTC组成的引物对；以及上游引物的互补序列GGACACTGTGTACGGTTTCT和下游引物的互补序列GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG；该引物对的上游引物H9pf151位置向3’端方向延伸10个碱基，下游引物H9pr302位置向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的引物序列及互补序列。

9、据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒H9亚型的探针序列，其特征在于所述的探针H9pb175序列为CTCCACACAGAGCACAAT，互补序列为GAGGTGTGTCTCGTGTTA，以及该探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及互补序列。