CN107937622A - 一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒。一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。

Description

一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian influenza)是由A型流感病毒引起的一种人与动物共患病，不仅引起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病，而且可导致人的感染和死亡，严重威胁人类健康。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)最显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁，按病原体类型的不同，可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为一类动物疫病。

检测禽流感的技术有酶联免疫(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)，目前比较主流的是PCR检测技术。PCR又分为普通PCR和荧光定量PCR两种，与普通PCR相比，荧光定量PCR操作简单、特异性更强、自动化程度更高。

禽流感因为亚型比较多，一般的禽流感病毒H5、H7、H9都需要检测，所以建立一种禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒很有必要。

然而一般的荧光定量检测前需要提取样本中的核酸，这就无形中增加了检测成本，降低了检测效率。因此，建立一种免核酸提取的禽流感H5、H7、H9三重荧光定量PCR试剂盒检测技术，具有重要的现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为检测禽流感病毒提供良好的基础。

本发明的第二目的在于提供一种禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。

本发明的第三目的在于提供一种禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法，采用免核酸提取进行禽流感病毒的荧光定量PCR检测，节约检测成本，节约人力，并且三种亚型的病毒可以同时检测，根据探针5′端标记荧光报告基团的不同判断阴性和阳性，提高检测效率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；

第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ IDNO：3所示；

第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ IDNO：6所示；

第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ IDNO：9所示。

本发明提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强，稳定性好，为定量检测禽流感病毒提供良好的基础。

其中，第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型。

进一步地，所述探针为自身淬灭探针。

进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种。

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。

进一步地，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。

由于不同的引物对及其相应的探针用于检测不同的禽流感病毒亚型，通过设置不同的探针5′端标记荧光报告基团，不同荧光报告基团在进行实时荧光定量检测时，吸收峰不同，据此，可同时检测不同的禽流感病毒亚型。

经试验发现，不同的引物对对应的探针的报告基因具有偏好性，即不同探针采用特定的报告基团检测效果更佳。

进一步地，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；

所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；

所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC。

优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了禽流感病毒的检测试剂盒，包括上述的核酸序列，即为上述引物对及其对应的探针中的一种或多种。

本发明提供的禽流感病毒的检测试剂盒，为检测的进行提供便利。

进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

进一步地，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；

优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-1000.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS41～51g/L以及50～70mMNaCl；

优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mMNaCl。

进一步地，所述试剂盒包括盒体，所述盒体内设置有带有孔的衬垫；

不同的试剂放置在贴有不同颜色标签或不同颜色的容器中，所述容器插入所述孔中，所述孔的个数不小于容器的个数。

本发明提供的试剂盒，通过容器如瓶的颜色或者标签的不同，更好的区分放入的组成成分是否正确，减少出错几率。

优选地，所述衬垫优选为高密性发泡模具。高密性发泡模具，具有固定、缓冲、支撑的作用。

本发明还提供了禽流感病毒的检测方法，待检测病毒的核酸以上述的核酸序列进行实时荧光定量PCR检测。

进一步地，所述待检测病毒的核酸通过以下步骤制备：

取待检测物，加入裂解液，振荡，然后加入中和液，混匀，离心，得到的上清液即为所述待检测病毒的核酸；

所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-401.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

进一步地，所述裂解液与所述中和液的添加比例为1:1±0.1；

进一步地，所述待检测物包括禽类咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、血液、血清、血浆、组织。

其中，液体类(血液、血清或血浆样本)的待检测物取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可；相应地，对于固体组织来说，取1-5mg的组织进行研磨，然后加入1ml PBS溶液混匀，离心取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可；相应地，对于固咽喉腔拭子、泄殖腔拭子来说，取样后，离心取10-50μl，加入4-6倍的裂解液，振荡后加入与裂解液等体积的中和液，混匀，离心，取50-120μl的上清液进行荧光定量PCR检测即可。

进一步地，本申请提供的待检测物采用上述的核酸序列同时实时荧光PCR检测。

反应体系为：样本2μl，反应液10μl，逆转录酶2μl，引物探针混合液5.4μl，无核酸水0.6μl，总体积是20μl。

引物探针混合物中，含有第一引物对以及对应的探针、第二引物对以及对应的探针和第三引物对以及对应的探针，上下游引物的浓度均为2.22pmol/μl，探针的浓度为1.11pmol/μl。

进一步地，所述实时荧光PCR检测的反应条件：

第一步：42℃保持15-20min；

第二步：94±1℃保持2-5min；

第三步：94±1℃保持10-15s，60℃保持28-35s，40±2个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

进一步地，所述第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，所述第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，所述第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型，检测结果均采用以下方法判定：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；

待检测物CT值<30并有明显的扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值介于30和37之间则判为可疑，需重复检测，若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。

另外，需要说明的是，阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；阳性对照和阴性对照需要同时满足该条件，否则本次实验无效，需要重新进行。

一般地，本发明中，实时荧光定量反应体系中所用的核酸拷贝数在10¹-10⁷均可用于上述方法判断。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的用于检测禽流感病毒的核酸序列，特异性强、敏感性高、稳定性好。

(2)本发明提供的检测禽流感病毒的核酸序列，不同探针5′端标记不同的荧光报告基团，实现了同时检测不同禽流感病毒亚型的目的。

(3)本发明提供的禽流感病毒的检测方法，采用免核酸提取方法，解决了污染，节约人力；不同亚型的禽流感病毒同时检测，节约检测成本，提高检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1提供的第一种荧光报告基团进行实时荧光定量得到的曲线图；

图2为本发明实施例1提供的第二种荧光报告基团进行实时荧光定量得到的曲线图；

图3为本发明实施例3提供的试剂盒的结构示意图。

图中：

1-盒体；2-孔；3-衬垫。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、配置溶液：

裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

2、得到待检测物的病毒核酸：

2.1血液、血清、血浆样本：

1)将样本混匀，取20μl加入1.5ml离心管中，然后加入100μl裂解液，旋涡振荡1min。

2)加入100μl中和液，震荡混匀。

3)12000rpm离心2min，取上清100μl于新的离心管中待检。

2.2咽喉腔拭子、泄殖腔拭子

1)将样本混匀，离心取20μl上清加入1.5ml离心管中，然后加入100μl裂解液，旋涡振荡1min。

2)加入100μl中和液，震荡混匀。

3)12000rpm离心2min，取上清100μl于新的离心管中待检。

2.3组织

1)将组织用研磨器磨碎，加入1ml PBS溶液混匀，离心取20μl上清加入1.5ml离心管中，然后加入100μl裂解液，旋涡振荡1min。

2)加入100μl中和液，震荡混匀。

3)12000rpm离心2min，取上清100μl于新的离心管中待检。

对提取的核酸进行检测，提取得到的核酸杂质含量少，提取得到的核酸含量同现有市售提取试剂或传统提取方法结果无明显差别，提取得到的核酸质量优。

3、实时荧光定量PCR检测

3.1荧光定量PCR试剂盒(购自THemo)的反应体系(20μl)：

待检测样本2μl，反应液10μl，逆转录酶2μl，引物探针混合液5.4μl，无核酸水0.6μl，总体积是20μl。

引物探针混合物中，含有第一引物对以及对应的探针(5′端标记荧光报告基团FAM)、第二引物对以及对应的探针(5′端标记荧光报告基团Hex)和第三引物对以及对应的探针(5′端标记荧光报告基团VIC)，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1，每个上下游引物的浓度均为2.22pmol/μl，探针的浓度均为1.11pmol/μl。引物探针的荧光报告基团分两种情况，第一种情况是第一对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团FAM，第二对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团Hex，第三对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团VIC；第二种情况是第一对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团FAM，第二对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团JOE，第三对引物对应的探针的5′端标记荧光报告基团Hex。

阳性对照组采用阳性样本替换待检测样本；

阴性对照组采用无核酸水替换待检测样本。

3.2实时荧光定量PCR检测的反应条件：

第一步：42℃保持20min；

第二步：94℃保持2-5min；

第三步：94℃保持15s，60℃保持30s，40个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

本发明所用的PCR扩增仪为ABI 7500。

第一种情况的引物探针的荧光报告基团的结果如图1所示，第二种情况的引物探针的荧光报告基团的结果如图2所示。可见，不同的探针所用的荧光报告基因不同，得到的曲线不同。为了检测的更准确和灵敏，选用第一种情况的引物探针的荧光报告基团。

经多次试验，采集的荧光信号结果采用以下方法判定：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；

待检测物CT值<30并有明显的扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值介于30和37之间则判为可疑，需重复检测，若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。

实施例2

采用实施例1提供的方法共检测200只禽类，每个禽类分别取咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、组织、血液、血清、血浆进行相应的检测。同时设置阳性和阴性对照。

200份禽类咽喉腔拭子采集物、200份泄殖腔拭子采集物和200份组织，采用实施例1的裂解免提取核酸的方法提取核酸，得到的提取物进行荧光定量PCR(步骤同实施例1)，得到以下结果：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线。

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线。

120份禽类咽喉腔拭子采集物的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份禽类咽喉腔拭子采集物的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性。

120份泄殖腔拭子采集物的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份泄殖腔拭子采集物的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性。

120份组织的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份组织的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性。

120份血液的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份血液的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性；

120份血清的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份血清的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性；

120份血浆的CT值<30并有明显的扩增曲线，判为阳性，80份血浆的CT值>37并无扩增曲线，则判为阴性。

经后续验证，检测准确率为100％。

实施例3

本发明还提供了禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，如图3所示，所述试剂盒包括盒体1，所述盒体1内设置有带有孔的衬垫3；

不同的试剂放置在贴有不同颜色标签或不同颜色的容器如瓶子中，所述容器插入所述孔2中，所述孔2的个数不小于容器的个数。

不同的试剂包括上述的引物对和探针，进一步地，还包括阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

具体地，图中不同的孔2可以插入含有不同试剂的容器如瓶子。但为了更好的区分放入的组成成分是否正确，减少出错几率，一般按照如下排序放入不同组分的容器盖上贴有不同颜色的分别标签，从左上方依次放入蓝色标签(引物)瓶子、棕色标签(探针)瓶子、黄色标签(酶)瓶子、无色透明标签(无核酸水)瓶子、绿色标签(阴性对照)瓶子、红色标签(阳性对照)瓶子。另有样本裂解液和中和液放在侧面空隙中。

本发明提供的试剂盒，通过瓶的颜色或者标签的不同，更好的区分放入的组成成分是否正确，减少出错几率。

优选地，所述衬垫3优选为高密性发泡模具。高密性发泡模具，具有固定、缓冲、支撑的作用。

本发明提供的禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，便于禽流感病毒的检测进行，为禽流感病毒的检测提供良好的条件。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大有泰莱生物技术有限公司

<120> 一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒

<130> 2010

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgtatgact atccacaata ctcag 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaccagcta ccatgattgc 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaacagtgg cgagttccct agca 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atagaataca gattgaccca gt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtgcaccg catgtttcca 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggtttagct tcggggcatc atg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gataaaattt gcattggata cca 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtcccagatt tgttgcacat a 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aacaatgttc ctgtgacaca tgcca 25

Claims (10)

1.一种用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括以下引物对及其对应的探针中的一种或多种；

第一引物对如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一探针的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；

第二引物对如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示，第二探针的核酸序列如SEQ ID NO：6所示；

第三引物对如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三探针的核酸序列如SEQ ID NO：9所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针；

进一步地，所述探针的5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团；

进一步地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC或JOE中的任一种；

进一步地，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ或MGB中的任一种。

3.根据权利要求1-2任一项所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列至少包括两个引物对及其对应的探针，不同探针的5′端标记荧光报告基团不同。

4.根据权利要求3所述的用于检测禽流感病毒的核酸序列，其特征在于，所述第一引物对对应的第一探针的5′端标记荧光报告基团FAM；

所述第二引物对对应的第二探针的5′端标记荧光报告基团Hex；

所述第三引物对对应的第三探针的5′端标记荧光报告基团VIC；

优选地，不同引物对对应的探针的3′端均标记淬灭基团BHQ1。

5.禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的核酸序列；

进一步地，所述检测试剂盒还包括样品处理液、阴性对照、阳性对照、反应扩增液、逆转录酶、无核酸水中的任一种或多种。

6.根据权利要求5所述的禽流感病毒荧光定量PCR的检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液包括裂解液和/或中和液；

优选的，所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-1000.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

优选的，所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-1000.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

7.禽流感病毒的检测方法，其特征在于，待检测病毒的核酸以权利要求1-4任一项所述的核酸序列进行实时荧光定量PCR检测；

进一步地，所述待检测病毒的核酸通过以下步骤制备：

取待检测物，加入裂解液，振荡，然后加入中和液，混匀，离心，得到的上清液即为所述待检测病毒的核酸；

所述裂解液的主要成分为：13～17mM EDTA、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、NP-40 1.5～2.5v/v％、CHAPS 35～45g/L、2～3mM DTT、SDS 41～51g/L以及50～70mM NaCl；

所述中和液的主要成分为：甘油8～12v/v％、Triton X-100 0.8～1.2v/v％、0.15～0.25mM PMSF、1.7～2.3mM DTT、pharmalyte 1.7～2.3v/v％以及100～120mM NaCl。

8.根据权利要求7所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述裂解液与所述中和液的添加比例为1:1±0.1；

进一步地，所述待检测物包括禽类咽喉腔拭子采集物、泄殖腔拭子采集物、血液、血清、血浆、组织。

9.根据权利要求7或8所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述待检测物采用权利要求3-4任一项所述的核酸序列同时实时荧光PCR检测；

进一步地，所述实时荧光定量PCR检测的反应条件：

第一步：42℃保持15-20min；

第二步：94±1℃保持2-5min；

第三步：94±1℃保持10-15s，60℃保持28-35s，40±2个循环，其中60℃设置采集荧光信号。

10.根据权利要求9所述的禽流感病毒的检测方法，其特征在于，所述第一引物对对应检测禽流感病毒H5亚型，所述第二引物对对应检测禽流感病毒H7亚型，所述第三引物对对应检测禽流感病毒H9亚型，检测结果均采用以下方法判定：

阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线；

阴性对照：无CT值或者CT值>37，无明显扩增曲线；

待检测物CT值<30并有明显的扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值>37并无扩增曲线，则判为阳性；

待检测物CT值介于30和37之间则判为可疑，需重复检测，若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。