CN107267665A - 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用 - Google Patents

用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107267665A
CN107267665A CN201710369846.6A CN201710369846A CN107267665A CN 107267665 A CN107267665 A CN 107267665A CN 201710369846 A CN201710369846 A CN 201710369846A CN 107267665 A CN107267665 A CN 107267665A
Authority
CN
China
Prior art keywords
influenza virus
avian influenza
subtype avian
seq
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710369846.6A
Other languages
English (en)
Inventor
贾伟新
曹琛福
廖明
花群义
林彦星
谢淑敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
South China Agricultural University
Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University, Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201710369846.6A priority Critical patent/CN107267665A/zh
Publication of CN107267665A publication Critical patent/CN107267665A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。本申请用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，包括引物对和探针，引物对上/下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；探针中，第27个碱基修饰BHQ1‑dT，第30个碱基修饰6‑FAM‑dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。本申请的H5亚型检测试剂，能准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性检测出H5亚型，为H5亚型防控提供了一种有效的方法和途径。本申请的检测方法，耗时短、灵敏度高、硬件设备要求低，不需复杂的样本处理，特别适合现场快速检测。

Description

用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
技术领域
本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。
背景技术
自1996年H5N1高致病性禽流感在我国广东地区发生以来，该病毒所感染的宿主范围越来越广，包括了很多的鸟类、哺乳动物甚至人类。H5N1病毒不仅给许多国家的养禽业带来了沉重打击，同时也向全人类的健康提出了严峻挑战。2004年开始，韩国、越南、中国、日本等多个亚洲国家相继发生高致病性H5N1亚型禽流感疫情。此后，病毒扩散范围逐步扩大，欧洲、中东及非洲地区也相继出现疫情，目前该亚型病毒已传播到全世界范围内的60多个国家。1997年，被认为只局限于禽类宿主中存在的H5N1亚型禽流感病毒，却造成了人类的感染并能够引起死亡，这也是全世界首例不需要中间宿主而使人直接感染禽流感病毒的事件。此后人感染H5N1亚型流感病例时有发生，截至2017年2月14日，H5N1亚型禽流感病毒已在全世界范围内16个国家造成共856例感染病例，其中死452例。虽然目前H5N1禽流感病毒还没有获得在人与人之间的高效传播的能力，但是病毒表面HA基因不断变异，内部基因频繁重组，大大加快了该病毒的遗传进化和传播扩散，使其宿主范围不断扩大的同时对人类的安全威胁也越来越大。H5亚型高致病性禽流感病毒除了H5N1亚型之外，还存在多种其他NA亚型病毒，目前我国H5亚型高致病性禽流感呈现了H5N1、H5N2、H5N6和H5N8等多个血清亚型的毒株同时在禽群中流行的特点。2014年以来我国H5亚型高致病性禽流感主要流行的亚型为H5N6亚型，2014年我国四川也出现了首例人感染H5N6亚型禽流感病例。H5亚型禽流感病毒的基因型也不断发生着变化，从早期的0分支发展进化为目前多分支同时存在的局面，我国当前主要流行2.3.4.4分支和2.3.2.1分支毒株，每个进化分支又分化为多个小分支，这为H5亚型禽流感病毒的早期检测和防控带来挑战。
重组酶聚合酶核酸扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，RPA能够在15分钟内进行37℃-42℃常温的单分子核酸扩增。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，其扩增原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。目前尚没有H5亚型禽流感病毒的RPA检测研究和报道。
发明内容
本申请的目的是提供一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；
Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’
Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’
Seq ID No.3：
5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAG TG-3’
Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。
需要说明的是，在荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用Seq ID No.3所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用Seq ID No.3所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上，探针的修饰方式不变。
还需要说明的是，本申请的引物对和探针，是特别针对H5亚型禽流感病毒的RPA检测而设计的，不同于常规PCR引物或一般的实时荧光PCR探针。此外，本申请的引物对和探针能够特异性的检测H5亚型禽流感病毒，虽然目前已经有关于H5N8、H5N6等致病毒株的特异性检测方法，但是，考虑到H5亚型禽流感病毒分支庞大，而危害性强，如果单独对其中个别毒株进行检测，一方面，容易存在漏检，另一方面，每个毒株采用一套试剂检测，成本高，且工作量大；因此，本申请特别研制了针对H5亚型禽流感病毒的特异性引物对和探针，能够对所有H5亚型禽流感病毒的毒株进行特异性检测，包括H5N8、H5N6等毒株；这对H5亚型禽流感病毒的早期检测和防控具有重要意义。可以理解，在本申请的基础上，还可以进一步的采用H5N8、H5N6等致病毒株的特异性检测方法，对H5亚型禽流感病毒的具体毒株进行鉴定，以方便后续进行针对性的整治，在此不做具体限定。
本申请的试剂包括引物对和探针，其中，探针是为了方便对RPA产物进行荧光检测，可以理解，如果不是采用荧光检测对RPA产物进行检测，则整个试剂可以不包含探针，只要一对引物即可完成RPA扩增。
本申请的另一面公开了本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。
本申请的另一面公开了本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在制备H5亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。
可以理解，本申请的试剂，实际上就针对H5亚型禽流感病毒设计的特异性探针和引物对，当然可以用于H5亚型禽流感病毒的检测，或者用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒或设备。
本申请的再一面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂。
本申请的再一面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由RT-RPA反应缓冲液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探针0.6μL组成；上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列，并且，No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3Spacer。
需要说明的是，本申请的试剂实际上是针对H5亚型禽流感病毒的RPA检测而设计的，为了方便使用，本申请将反应体系中使用的反应缓冲液、引物和探针统一配制成混合试剂，每一组混合试剂就是一个反应体系，直接向其中加入RNA样品、水和/或添加剂就可以进行检测，使用简单方便，不仅避免了配制反应体系的繁琐步骤，而且避免了配制反应体系过程造成的污染。本申请试剂盒的混合试剂中，各组分的用量是在本申请的试验条件和环境下，根据本申请的优选实施方式而得出的，可以理解，根据不同的试验环境，混合试剂中各组分的用量可以进行适当调整，在此不做具体限定。
本申请的再一面公开了一种用于H5亚型禽流感病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的核酸；
(2)采用本申请的试剂盒，向试剂盒的混合试剂中加入步骤(1)提取的核酸，再加入DEPC水和醋酸镁，配制成反应溶液；
(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃恒温反应，整个反应过程采集荧光信号。
需要说明的是，本申请的试剂盒或者本申请的试剂，其关键就是针对H5亚型禽流感病毒设计的特异性的RPA检测引物和探针，试剂盒的混合试剂，实际上就是本申请的RPA检测反应体系。
优选的，40℃恒温反应具体包括，先将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃保温5min，然后取出装反应溶液的PCR管上下轻轻颠倒数次，瞬时离心，再继续40℃下反应15min，整个反应过程采集荧光信号。
需要说明的是，反应5min后取出混匀，目的是使反应能够更均匀的进行。
优选的，采集荧光信号的过程中，FAM荧光通道光源强度设置为11％。
优选的，本申请的检测方法还包括，采集40℃恒温反应前5min各点荧光值，计算其平均值，作为第一荧光值；采集40℃恒温反应5min后任意时间点的荧光值，作为第二荧光值；根据荧光增量判断待测样品为阳性或阴性，具体的，荧光增量大于55％，且持续的时间超过2分钟，判为阳性，否则判为阴性；
荧光增量＝[(第二荧光值-第一荧光值)/第一荧光值]×100％。
优选的，步骤(1)提取待测样品的核酸，采用MagMAXTM-96Viral RNA IsolationKit磁珠提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。
本申请的有益效果在于：
本申请的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，对禽流感H5亚型具有很强的特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性的检测出H5亚型，并且可以同时检出H5亚型中的各个毒株，为H5亚型禽病毒的预防和监控提供了一种有效的方法和途径。并且，基于本申请的试剂或试剂盒的H5亚型禽流感病毒检测方法，耗时短、灵敏度高、对硬件设备要求低，不需要复杂的样本处理，特别适合于现场快速检测，这对于控制流感的流行，减少经济损失，最大限度的保护全社会人群的健康和生命安全具有重大意义。
附图说明
图1是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为39℃时的扩增曲线；
图2是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为40℃时的扩增曲线；
图3是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为41℃时的扩增曲线；
图4是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为7％时的扩增曲线；
图5是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为11％时的扩增曲线；
图6是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为15％时的扩增曲线；
图7是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为19％时的扩增曲线；
图8是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为22％时的扩增曲线；
图9是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为25％时的扩增曲线；
图10是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法FAM通道的荧光强度设置为28％时的扩增曲线；
图11是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法的特异性检测结果；
图12是本申请实施例中H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法的灵敏度检测结果；
图13是本申请实施例中作为对比的H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法的灵敏度检测结果。
图1-图10中曲线末端，由上到下依序为H5亚型禽流感病毒核酸浓度0.0262μg/mL、浓度2.62ng/mL、浓度0.262ng/mL、浓度0.0262ng/mL的检测曲线；图11中具有荧光信号的曲线为H5亚型禽流感病毒核酸样品的检测曲线，其余未阴性对照；图12中曲线末端，由上到下依序为H5亚型禽流感病毒核酸浓度0.0262μg/mL、浓度2.62ng/mL、浓度0.262ng/mL的检测曲线；图13中具有荧光信号的曲线由左到右依序为H5亚型禽流感病毒核酸浓度0.0262μg/mL、浓度2.62ng/mL、浓度0.262ng/mL、浓度0.0262ng/mL的检测曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
一、材料
1.病毒RNA
本例分别采用了禽流感H3N2、H5N1、H7N9、H11N9、H6N2、H4N9、H1N1亚型和新城疫病毒的RNA进行试验。
2.RT-RPA和qRT-PCR试剂
TwistAmpTMexo lyophilized kit(TwistDx,Cambridge,UK)；AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Reagents；MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(ThremoFisherScientific,USA)；
RPA试验用引物及探针、实时荧光RT-PCR试验用引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
3.主要仪器设备
便携式等温扩增荧光检测仪(T16-ISO)，购置于英国TwistDx公司；ABI7500-Fast实时荧光PCR检测仪，购置于美国AB公司；超微量核酸检测仪；离心机；微量移液器。
二、方法
1.引物探针的设计
选取禽流感H基因作为靶标基因，采用DNASTAR软件对10株H5亚型禽流感病毒株及其它亚型禽流感病毒株，包括H1、H3、H4、H6、H7、H9和H11，的H基因核苷酸全序列进行序列比对。选择H5亚型禽流感特异性序列来设计引物和探针，并与NCBI数据库核苷酸序列进行BLAST比对，确定其序列的特异性。
为建立快速敏感的RPA检测方法需要选择合适的扩增引物，而目前无法跟实时荧光PCR方法一样可利用商业软件来设计并预测扩增性能。因此本例自行设计了一系列候选引物及探针，用于试验筛选，如表1所示。
此外，本例还采用了实时荧光PCR检测作为对照，实时荧光PCR的引物和探针为OIE推荐用引物与探针，如表1所示。OIE为Office International Des Epizooties缩写，即世界动物卫生组织。
表1 引物和探针序列
名称 序列(5’→3’) Seq ID No.
H5-1469-P GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG 3
H5-1314-F TGGAAGACGGATTCCTAGATGTCTGGACTTA 4
H5-1431-F GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG 1
H5-1572-R CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG 2
H5-1657-R1 GGAACTCGCCACTGTTGAATAAATTGACAGTATTTGG 5
H5-1657-R2 GGAACTCGCCACTGTTGAATAAATTGACAG 6
AIV-H5-F ACG TAT GAC TAC CCG CAG TAT TCA 7
AIV-H5-P FAM-TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA-BHQ1 8
AIV-H5-R AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC 9
注：H5-1469-P探针标记与修饰为，第27个碱基修饰BHQ1-dT、第30个碱基修饰6-FAM-dT、第28个碱基替换为dSpacer、3’端修饰C3Spacer。
2.病毒核酸的提取
采用MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit磁珠提取试剂盒提取上述病毒核酸，并用超微量核酸检测仪测定核酸浓度，作为RPA试验用样品模板。
3.引物和探针筛选
以提取的H5亚型禽流感病毒核酸作为模板，将设计好的引物，从H5-1314-F和H5-1431-F中任选一个作为上游引物，从H5-1572-R、H5-1657-R1和H5-1657-R2中任选一个作为下游引物，上游引物和下游引物两两配对，再配以H5-1469-P探针，进行RT-RPA反应，筛选快速敏感的最佳引物对和探针。
RT-RPA反应体系为：反应缓冲液(即Rehydration Buffer)29.5μL，然后加入10μM浓度的上、下游引物各2.1μL，10μM浓度的探针0.6μL，再加入模板及DEPC水13.2μL，共47.5μL，混匀，加入280mM醋酸镁2.5μL，反应体系共计50μL。
反应条件为：在38℃保温5min，然后取出装反应溶液的PCR管上下轻轻颠倒数次，瞬时离心，再继续38℃下反应15min，整个反应过程采集荧光信号。FAM通道的荧光强度设置为15％。
4.RT-RPA反应体系与条件的优化
(1)RT-RPA反应体系的配置
取出TwistAmpTMexo lyophilized kit试剂盒反应管并置于冰上，里面含有白色固体小颗粒，为冻干混合酶，包括能结合单链核酸即寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白(缩写SSB)和链置换DNA聚合酶，加入试剂盒中的反应缓冲液(即Rehydration Buffer)29.5μL，然后加入10μM浓度的上、下游引物各2.1μL，10μM浓度的探针0.6μL，再加入模板及DEPC水13.2μL，共47.5μL，混匀，加入280mM醋酸镁2.5μL，反应体系共计50μL，混匀后放入T16-ISO仪器后开始试验。
(2)RT-RPA反应条件的基本设置
将配置好的反应混合液置于T16-ISO仪器中，设置反应程序，38-42℃反应5min，然后从仪器中取出PCR管上下轻轻颠倒数次，迅速置于离心机上2000rpm/min，离心30s，放入T-16中继续在38-42℃下反应15min。设置荧光通道光源强度，并在整个反应过程收集FAM荧光信号。
RT-RPA反应条件的优化具体如下：
本例将提取到的H5亚型禽流感病毒核酸作4个10倍系列稀释，再加上阴性对照的新城疫病毒核酸，共计5个样品模板，采用优化好的引物对与探针组合，配置反应体系。其中，H5亚型禽流感病毒核酸的4个10倍系列稀释的浓度分别为，0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL；新城疫病毒核酸的浓度为0.021μg/mL。
反应程序的优化具体如下：将配置好的反应管放入T-16仪器中，在38℃反应5min，然后从仪器中取出PCR管上下轻轻颠倒数次，迅速置于离心机上2000rpm/min，离心30s，再放入T-16中继续反应15min，整个反应过程全程收集FAM荧光。取同样的反应体系和样品数量，将反应温度分别设置为39℃、40℃和41℃，其它条件均不变，筛选出最优的反应温度。FAM通道的荧光强度的优化具体如下：采用优化的反应温度，并取同样的反应体系和样品数量，设置LED灯FAM通道的荧光强度，分别设置为7％、11％、15％、19％、22％、和25％六个不同的荧光强度进行检测，筛选出最优的LED灯FAM通道的荧光强度值。
5.RT-RPA方法判定标准的设定
将上述各样品的反应结果按下列公式进行计算：
首先，采集恒温反应前5min各点荧光值，计算其平均值，作为第一荧光值；然后采集5min后任意时间点的荧光值，作为第二荧光值。
检测各时间点荧光强度增加百分数，即荧光增量＝[(第二荧光值-第一荧光值)/第一荧光值]×100％。
分析各稀释度样品的荧光强度增加值，以及阴性样品的荧光强度增加值，选取合适的荧光强度增加值作为临界阈值，设定本例检测方法的判定标准。
6.RT-RPA方法特异性试验
以提取的H3N2、H5N1、H7N9、H11N9、H6N2、H4N9、H1N1和新城疫病毒的RNA为模板，采用筛选的引物对和探针，以及优化的反应条件进行H5亚型禽流感病毒RPA特异性检测。
7.RT-RPA方法灵敏性试验
本例将提取到的H5亚型禽流感病毒核酸作7个10倍系列稀释，再加上阴性对照的新城疫病毒核酸，共计8个样品模板，采用优化好的引物对与探针组合，配置反应体系，并按照优化的反应条件进行H5亚型禽流感病毒RPA灵敏度检测。其中，H5亚型禽流感病毒核酸的7个10倍系列稀释的浓度分别为，0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL、0.0262ng/mL、2.62pg/mL、0.262pg/mL和0.0262pg/mL；新城疫病毒核酸的浓度为0.021μg/mL。
同时，采用相同的8份核酸样品作为模板，以OIE推荐用引物与探针，按照其方法进行实时荧光检测，比较本例的RPA方法和现有的实时荧光RT-PCR方法两者的检测灵敏度。
8.RT-RPA方法的初步应用
采集来自多地养殖场、活禽交易市场的鸡泄殖腔拭子和咽拭子30份，以及标准毒株5份，分别采用OIE推荐用引物与探针，和本例的RPA检测方法，对采集的样品进行检测，比较两者的符合性。
三、结果
1.引物对和探针的筛选
将设计好的引物采取两两搭配的方式组合，筛选出快速敏感的最佳引物对和探针，本例的筛选结果显示，在相同的条件下，H5-1431-F和H5-1572-R引物对，配合H5-1469-P探针，其敏感度最高，即在相同的时间点，荧光增量更大。
2.最佳反应条件的确定
(1)不同反应温度RPA试验结果
反应温度设置为39℃时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量，即荧光增量；qRT-RPA试验具体结果见表2，扩增曲线结果见图1。
表2 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为39℃时的荧光值结果
表2中，荧光值1为相应时间下H5亚型禽流感病毒核酸浓度为0.0262μg/mL时检测的荧光值，荧光值1后面对应的荧光增量，即在相应时间下，荧光值1相对于恒温反应前5min各点荧光值的平均值的增量。荧光值2、3、4依序为H5亚型禽流感病毒核酸浓度为2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL的荧光值。以下各表相同。
反应温度设置为40℃时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量，即荧光增量；qRT-RPA试验具体结果见表3，扩增曲线结果见图2。
表3 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为40℃时的荧光值结果
反应温度设置为41℃时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表4，扩增曲线结果见图3。
表4 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法反应温度为41℃时的荧光值结果
本例选取最低浓度阳性样品的扩增效率来选择最优的反应温度，从实验结果来看，0.0262ng/mL浓度的H5亚型禽流感病毒核酸样品在反应温度设置为40℃时，其5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加百分数更大。因此，本例建立的检测H5亚型禽流感病毒qRT-RPA方法的最佳反应程序为：将配置好的反应体系放入温度设置为40℃的T-16仪器中反应5min，然后从仪器中取出PCR管上下轻轻颠倒数次，迅速置于离心机上2000rpm/min，离心30s，再放入T-16仪器中，继续在40℃下反应15min。整个反应过程全程收集FAM荧光。
(2)不同光源强度下的RPA试验结果
本例将LED灯FAM通道的荧光强度设置为7％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量，即荧光增量；qRT-RPA试验具体结果见表5，扩增曲线结果见图4。
表5 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为7％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为11％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表6，扩增曲线结果见图5。
表6 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为11％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为15％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表7，扩增曲线结果见图6。
表7 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为15％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为19％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表8，扩增曲线结果见图7。
表8 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为19％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为22％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表9，扩增曲线结果见图8。
表9 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为22％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为25％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表10，扩增曲线结果见图9。
表10 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为25％时的荧光值结果
将LED灯FAM通道的荧光强度设置为28％时，核酸模板为H5亚型禽流感病毒核酸，其浓度分别为0.0262μg/mL、2.62ng/mL、0.262ng/mL和0.0262ng/mL时的实时荧光值，以及5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加量。qRT-RPA试验具体结果见表11，扩增曲线结果见图10。
表11 H5亚型禽流感病毒qRT-RPA检测方法荧光强度为28％时的荧光值结果
本例选取最低浓度阳性样品的扩增效率来分析FAM荧光通道光源强度的最优设置，从实验结果来看，0.0262ng/mL浓度的H5亚型禽流感病毒核酸样品在荧光强度设置时，FAM通道强度占LED光源强度的11％时，其5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加百分数更大。因此，本例在建立检测H5亚型禽流感病毒qRT-RPA方法时，FAM荧光通道光源强度设置成11％为最佳。
3.结果判定标准的设置
根据上述实验结果选取最佳反应条件及设置，其中最佳反应温度为40℃，FAM通道强度设置为占LED光源强度11％时，按荧光增量＝[(第二荧光值-第一荧光值)/第一荧光值]×100％计算出图2和图5中最低浓度阳性样品的最大荧光增加值为106％和70％，其中图5增加值超过55％时持续时间为2分钟。
另外，在后续的应用试验中，本例采集的30份阴性鸡咽拭子样品，提取核酸后按最佳反应体系和反应条件进行试验，结果其5分钟后的荧光值与前5分钟的荧光平均值之比的增加值均低于15％，因此本例将试验结果判定标准设定为：试验5分钟后的采集点荧光值与前5分钟采集到的各点荧光值的平均值之比，即荧光增量大于55％，且持续的时间超过2分钟，则判为阳性；否则判为阴性。
4.RT-RPA方法特异性试验结果
本例qRT-RPA试验特异性检测结果见图11，结果显示，只有H5亚型禽流感病毒出现了扩增，其他亚型H1、H3、H4、H6、H7、H9和H11亚型流感病毒、新城疫病毒样品未见有扩增。
5.RT-RPA方法灵敏性试验结果
本例qRT-RPA试验灵敏性检测结果见图12，结果显示，本例建立的检测H5亚型禽流感病毒qRT-RPA方法的检测灵敏度可达0.262ng/mL。
取相同的8个核酸样品，采用OIE推荐用引物、探针和实时荧光PCR方法检测，结果见图13，结果显示，OIE推荐的实时荧光PCR检测方法灵敏度可达0.0262ng/mL。
可见，本例的用于H5亚型禽流感病毒检测的引物对和探针，及RPA检测方法，与目前使用的OIE推荐的实时荧光PCR方法相比，灵敏度相差10倍左右，而本例的RPA检测方法所用的时间大大缩短，所需设备也简便，适合于野外现场检测。
6.RT-RPA检测方法田间样本应用
本例对采集的30份鸡泄殖腔拭子和咽拭子，以及5份标准毒株，分别采用OIE推荐的引物与探针，和本例的RPA检测方法，进行检测。结果显示，两个检测方法的结果一致，30份鸡泄殖腔拭子和咽拭子为阴性，5份标准毒株为阳性。可见，本例的RPA检测方法可以替代现有的实时荧光PCR检测方法。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
<120> 用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
<130> 17I24393
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gactacagct tagggataat gcaaaggagc tggg 34
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctttttaatc ttgcttcttc tgaatactg 29
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtg 49
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaagacgg attcctagat gtctggactt a 31
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggaactcgcc actgttgaat aaattgacag tatttgg 37
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaactcgcc actgttgaat aaattgacag 30
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgtatgact acccgcagta ttca 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcaacagtgg cgagttccct agca 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaccagcta ycatgattgc 20

Claims (10)

1.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；
Seq ID No.1：5’-GACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGG-3’
Seq ID No.2：5’-CTTTTTAATCTTGCTTCTTCTGAATACTG-3’
Seq ID No.3：
5’-GGTTGTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTG-3’
Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3 Spacer。
2.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在H5亚型禽流感病毒检测中的应用。
3.根据权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂在制备H5亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。
4.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂。
5.一种用于H5亚型禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由RT-RPA反应缓冲液29.5μL、10μM的上游引物2.1μL、10μM的下游引物2.1μL和10μM的探针0.6μL组成；所述上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列，并且，Seq ID No.3所示序列的探针中，第27个碱基修饰BHQ1-dT，第30个碱基修饰6-FAM-dT，第28个碱基替换为dSpacer，3’端修饰C3 Spacer。
6.一种用于H5亚型禽流感病毒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待测样品的核酸；
(2)采用权利要求5所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的核酸，再加入DEPC水和醋酸镁，配制成反应溶液；
(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃恒温反应，整个反应过程采集荧光信号。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述40℃恒温反应具体包括，先将步骤(2)配制的反应溶液，在40℃保温5min，然后取出装反应溶液的PCR管上下轻轻颠倒数次，瞬时离心，再继续40℃下反应15min，整个反应过程采集荧光信号。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述采集荧光信号的过程中，FAM荧光通道光源强度设置为11％。
9.根据权利要求6-8任一项所述的检测方法，其特征在于：还包括，采集40℃恒温反应前5min各点荧光值，计算其平均值，作为第一荧光值；采集40℃恒温反应5min后任意时间点的荧光值，作为第二荧光值；根据荧光增量判断待测样品为阳性或阴性，具体的，荧光增量大于55％，且持续的时间超过2分钟，判为阳性，否则判为阴性；
荧光增量＝[(第二荧光值-第一荧光值)/第一荧光值]×100％。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)提取待测样品的核酸，采用MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit磁珠提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。
CN201710369846.6A 2017-05-23 2017-05-23 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用 Pending CN107267665A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710369846.6A CN107267665A (zh) 2017-05-23 2017-05-23 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710369846.6A CN107267665A (zh) 2017-05-23 2017-05-23 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107267665A true CN107267665A (zh) 2017-10-20

Family

ID=60064890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710369846.6A Pending CN107267665A (zh) 2017-05-23 2017-05-23 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107267665A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937622A (zh) * 2018-01-16 2018-04-20 北京大有泰莱生物技术有限公司 一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒
CN107937611A (zh) * 2017-12-18 2018-04-20 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 检测禽流感病毒亚型h5、h7和h9的引物探针组
CN109628643A (zh) * 2019-01-11 2019-04-16 中国动物卫生与流行病学中心 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法
CN118028542A (zh) * 2024-04-09 2024-05-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 用于检测h5亚型禽流感病毒的试剂盒及其使用方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894118A (zh) * 2015-06-01 2015-09-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、探针及试剂盒
CN105296673A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 江苏省疾病预防控制中心 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
CN105296670A (zh) * 2015-11-09 2016-02-03 山西省农业科学院畜牧兽医研究所 一种h1、h3和h9型禽流感病毒检测试剂盒及检测方法
CN106282414A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 深圳市检验检疫科学研究院 用于h5n6禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN106555012A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894118A (zh) * 2015-06-01 2015-09-09 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种检测牛病毒性腹泻病毒的引物、探针及试剂盒
CN105296670A (zh) * 2015-11-09 2016-02-03 山西省农业科学院畜牧兽医研究所 一种h1、h3和h9型禽流感病毒检测试剂盒及检测方法
CN105296673A (zh) * 2015-12-03 2016-02-03 江苏省疾病预防控制中心 一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
CN106282414A (zh) * 2016-10-08 2017-01-04 深圳市检验检疫科学研究院 用于h5n6禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN106555012A (zh) * 2016-10-25 2017-04-05 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 用于a型动物流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAHED YEHIA等: "Development of reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for avian influenza H5N1 HA gene detection", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937611A (zh) * 2017-12-18 2018-04-20 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 检测禽流感病毒亚型h5、h7和h9的引物探针组
CN107937622A (zh) * 2018-01-16 2018-04-20 北京大有泰莱生物技术有限公司 一种禽流感病毒检测方法及其试剂盒
CN109628643A (zh) * 2019-01-11 2019-04-16 中国动物卫生与流行病学中心 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法
CN109628643B (zh) * 2019-01-11 2023-04-25 中国动物卫生与流行病学中心 一种h5亚型禽流感病毒的快速检测方法
CN118028542A (zh) * 2024-04-09 2024-05-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 用于检测h5亚型禽流感病毒的试剂盒及其使用方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106636471B (zh) 同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测试剂盒
CN107142335A (zh) 用于h7亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
CN111187856A (zh) 一种用于新冠病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其制备方法与应用
CN107267665A (zh) 用于h5亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法和应用
Go et al. Evaluation and clinical validation of two field–deployable reverse transcription-insulated isothermal pcr assays for the detection of the middle east respiratory syndrome–coronavirus
Albertoni et al. Mini review: current molecular methods for the detection and quantification of hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus type 1
CN104342503A (zh) 一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法
Mekata et al. Development of simple, rapid and sensitive detection assay for grouper nervous necrosis virus using real‐time loop‐mediated isothermal amplification
CN107488745A (zh) 一种用于新城疫病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN110358866A (zh) 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒
CN103614489A (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
Günther et al. Detection of feline Coronavirus in effusions of cats with and without feline infectious peritonitis using loop-mediated isothermal amplification
Ma et al. Rapid detection of avian influenza A virus (H7N9) by lateral flow dipstick recombinase polymerase amplification
CN107177700A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
Zeng et al. A one‐step molecular biology method for simple and rapid detection of grass carp Ctenopharyngodon idella reovirus (GCRV) HZ08 strain
CN106755572A (zh) I型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒双重荧光定量pcr方法
CN107974514A (zh) 一种用于猪a型塞内卡病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN101985664B (zh) 检测a型流感病毒的核苷酸序列和试剂盒
CN106435019A (zh) 一种免疫捕捉‑反转录环介导等温扩增反应检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法
CN107312872A (zh) 同时鉴别h5亚型禽流感病毒及其na亚型的多重pcr引物组、试剂盒和检测方法
CN105400908B (zh) 一种利用焦磷酸测序技术检测斑点叉尾鮰病毒的引物、试剂盒和检测方法
Park et al. One-step reverse transcription-polymerase chain reaction for Ebola and Marburg viruses
CN103667527B (zh) 马铃薯纺锤块茎类病毒的液相芯片检测引物及检测方法
CN107488744A (zh) 用于n9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN105063238B (zh) 一种检测葡萄卷叶伴随病毒2号的rpa引物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171020