CN106435019A

CN106435019A - 一种免疫捕捉‑反转录环介导等温扩增反应检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法

Info

Publication number: CN106435019A
Application number: CN201610826246.3A
Authority: CN
Inventors: 饶雪琴; 李华平; 罗宝花; 刘娟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2016-09-18
Filing date: 2016-09-18
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明公开了一种免疫捕捉‑反转录环介导等温扩增反应检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法，还包括一组LAMP引物组，所述检测引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对CMV‑F3/CMV‑B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示，内引物对CMV‑FIP/CMV‑BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。本发明将血清学与RT‑LAMP法相结合，首先用特异性的CMV抗体捕获病毒粒子，并以该病毒粒子为模板，利用上述引物组进行RT‑LAMP扩增检测CMV。该方法操作简便，灵敏度高，特异性强，可作为香蕉植株、吸芽及组培苗中香蕉黄瓜花叶病毒特异性检测的有效手段，以便及时采取措施，减少病害带来的经济损失。

Description

一种免疫捕捉-反转录环介导等温扩增反应检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法

技术领域

本发明属于植物病原物检测技术领域，具体地，涉及一种免疫捕捉-反转录环介导等温扩增反应（IC-RT-LAMP）检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法，该方法适用于香蕉组培苗和田间香蕉植株上黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的快速检测。

背景技术

香蕉（Musa spp.）为芭蕉科（Musaceae）、芭蕉属（Musa）植物，原产于亚洲热带地区，是单子叶多年生常绿大型草本果树，在世界水果贸易中具有极其重要的地位。目前，全球大约有127个国家和地区种植香蕉，其中大部分是发展中国家。香蕉富含碳水化合物、膳食纤维、蛋白质、脂肪和维生素A等，是发展中国家4亿多人口的主要食物和经济来源，其作用仅次于水稻、小麦和玉米。在中国，香蕉已有3000多年的栽培历史，香蕉的种植也成为热带地区蕉农的重要经济收入来源，香蕉健康生产直接关系到蕉农的生活。由于香蕉没有种子，香蕉的繁殖方式主要是组织培养，香蕉的组培快繁技术可以满足市场对香蕉种苗日趋扩大的需求。然而，在香蕉产业大规模发展的同时，香蕉也受到来自各种生物病害（如细菌、真菌或病毒）的威胁。

香蕉花叶心腐病是由黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）引起的系统性病害，我国最早于1974年在广州市郊部分地区和东莞县等地发现该病害。由于广东省早期引进未经检疫的香蕉组培苗，导致该病害在上世纪八九十年代大面积传播，有些蕉园发病率甚至高达90%，严重影响了香蕉生产。

目前，尚无防治香蕉花叶心腐病的有效药剂，在香蕉病毒病防治中常采用的策略有生产无毒种苗、防治传毒虫媒、抗病毒基因工程、及时去除田间发病植株等，但以预防为主。最重要的防治方法是推广使用无毒种苗和清除田间病源。由于CMV能通过组培繁殖进行传播，因此，通过组培快繁生产无毒香蕉种苗，对于香蕉病毒病的防控非常重要。病毒检测技术是生产无毒香蕉种苗的关键，对病毒的鉴定及检测是防止香蕉病毒传播扩散及培育无病毒种苗的一个重要环节。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中香蕉花叶心腐病病原黄瓜花叶病毒（CMV）检测方法的缺陷和不足，提供一种免疫捕捉-反转录环介导等温扩增反应（IC-RT-LAMP）检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法。该方法可用于快速准确检测香蕉植株、吸芽、香蕉试管苗或组培苗中CMV，通过该方法可以检测显症、疑似症状或无症状的香蕉植株或组织中是否携带CMV，且操作简单，不需要特殊的仪器设备。

本发明的目的在于提供一组用于IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的引物组。

本发明的另一目的是提供一种利用IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法。

本发明的再一目的是提供上述方法在香蕉组培苗和/或田间香蕉植株上对香蕉黄瓜花叶病毒的快速检测方面的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一组用于IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的引物组，所述检测引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为CMV-F3/CMV-B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述内引物对为CMV-FIP/CMV-BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

引物设计是否合理是决定LAMP方法是否高效、特异的关键。本发明设计的LAMP引物组，通过4条特异引物，即上游内部引物（FIP）、下游内部引物（BIP）、上游外部引物（F3）、下游外部引物（B3），来识别靶基因的6个特异序列，即位于靶标基因5' 端的F1、F2和F3以及3' 端的B1c、B2c和B3c区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，6个不同位点完全匹配才能进行扩增，具有很高的特异性。

本发明所设计得到的上述引物组能够很好的应用于香蕉黄瓜花叶病毒的LAMP检测。

一种利用上述引物组以IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法，所述方法具体包括如下步骤：

S1. 用特异性的CMV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；

S2. 以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用上述引物组进行RT-LAMP扩增反应。

S3. 根据扩增结果判断待测样品中是否含有香蕉黄瓜花叶病毒。

其中，优选地，步骤S1所述病毒粒子的捕捉的方法为：将稀释后的CMV抗血清包被容器（如PCR管）；用碳酸盐包被缓冲液研磨香蕉待检测组织，取适量研磨组织的汁液加入上述容器（如PCR管）中进行孵育，以获得免疫捕捉的病毒粒子。

优选地，步骤S1所述CMV抗血清为多克隆抗体或单克隆抗体，自制或从商业途径获得。

优选地，步骤S2所述RT-LAMP扩增的体系如下：dNTPs（10 mmol/L each）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20 mmol/L）5 μL；10×Thermopol reaction buffer 5 μL；引物CMV-F3/B3（25 μmol/L）各0.2 μL；引物CMV-FIP/BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst酶（8U/μL）1 μL；RTase M-MLV（100 U/μL）0.2 μL；RNase inhibitor（40 U/μL）0.2 μL；ddH₂O 补至25 μL。

优选地，步骤S2所述RT-LAMP扩增的反应条件为：55～65 ℃恒温水浴中扩增反应60～70 min；80～90 ℃，6～10 min。

更优选地，步骤S2所述RT-LAMP扩增的反应条件为：60℃恒温水浴中扩增反应65min；85℃，8 min。

优选地，步骤S3所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有CMV的具体方法为荧光染料技术或电泳检测技术；

优选地，所述荧光染料技术为：取SYBR Green I荧光染料反应液加入步骤S2所述RT-LAMP扩增反应产物中，在紫外灯下，若扩增产物变化为绿荧光色即为阳性反应，表示样品中含有CMV；若扩增产物颜色不变则为阴性反应，表示样品中不含有CMV。

优选地，所述电泳检测技术为：将步骤S2所述RT-LAMP扩增产物进行电泳观察，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，即为阳性反应，表示样品中含有CMV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含有CMV。

一种利用IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的试剂盒，包含有上述引物组和/或特异性的CMV抗血清。

进一步优选地，所述试剂盒还包含有RT-LAMP扩增反应所需的试剂。

优选地，所述试剂盒还包含有如下试剂：

溶液1：碳酸盐包被缓冲液（0.05 M pH9.6）：称取0.2 g NaN₃，2.93 g NaHCO₃，1.59 gNa₂CO₃，双蒸水溶解后定容至1 L；

溶液2：磷酸缓冲液（PBS）（0.02 M pH 7.4）：取8.0 g NaCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 gNa₂HPO₄·12H₂O，0.2g KCl置于烧杯中，加800 mL ddH₂O 溶解并调pH值，双蒸水定容至1000mL，混匀；

溶液3：磷酸洗涤缓冲液（PBST，0.02 M pH 7.4）：取8.0 g NaCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O，0.2 g KCl置于烧杯中，加800 mL ddH₂O 溶解并调pH值，再加0.5mLTween-20，双蒸水定容至1000 mL，混匀。

溶液4：荧光染料检测液SYBR Green I 。

更优选地，利用所述试剂盒检测CMV的方法如下：

（1）用磷酸缓冲液（PBS）来稀释CMV病毒的抗血清（CMV单抗工作浓度为1:2000，或根据CMV抗体推荐浓度进行稀释），分装至200 μL 反应容器（如PCR管）中各100 μL，4℃过夜或37℃孵育2小时，洗涤3次；取1 mL 碳酸盐包被缓冲液（0.05 M，pH9.6）来研磨0.1 g 香蕉待测样品，从中取100 μL研磨液置于上述反应容器（如PCR管）中，在恒温箱中37℃放置3 h；磷酸缓冲液洗涤液（PBST）洗涤3次，甩干；即获得免疫捕捉病毒粒子。

（2）配制IC-RT-LAMP 反应缓冲液，按总体系25μL建立扩增体系为：dNTPs（10mmol/L each）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20 mmol/L）5 μL；10×Thermopolreaction buffer 5 μL；引物CMV-F3/B3（25 μmol/L）各0.2 μL；引物CMV-FIP/BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst酶（8 U/μL）1 μL；RTase M-MLV（100 U/μL）0.2 μL；RNase inhibitor（40 U/μL）0.2 μL；ddH₂O 补至25 μL。

（3）将配制好的IC-RT-LAMP反应液加入上述完成了CMV免疫捕捉的反应容器（如PCR管），置于冰上用移液器混匀，加入等体积的石蜡油，盖紧PCR管。

（4）在55～65 ℃金属恒温浴中扩增反应60～70 min；80～90 ℃，6～10 min（优选为60℃扩增65 min；85℃，8 min）。

（5）观察结果：取出反应后的反应容器（如PCR管），反应容器（如PCR管）盖内加1 μL10×SYBR Green I 荧光染料工作液，混匀。在紫外光下，呈阳性即绿色的表示样品中含有CMV；呈阴性即保持染料不变，则表示样品中不含有CMV。或者结果的观察可以采用电泳检测技术。

另外，上述引物组、方法或试剂盒在检测和/或鉴定香蕉黄瓜花叶病毒方面的应用也在本发明的保护范围之内。可应用于监控香蕉黄瓜花叶病毒发生、扩散和流行。检测对象可以为香蕉植株、吸芽或香蕉组培苗中CMV及其不同株系或分离物。

本发明将免疫捕捉和反转录环介导等温扩增反应结合起来的免疫捕捉-反转录环介导等温扩增反应（IC-RT-LAMP）技术是一种通过微量抗原的捕获并结合RT-LAMP扩增来检测病原物的方法，其检测对象是完整的病原物，通过固相化的特异抗体捕捉特定的病原物抗原，再利用病原物基因组序列特异的引物进行扩增，通过对扩增产物的检测和分析达到对完整病原物的检测。方法特异性强，灵敏度高，不需要特殊的仪器设备，简化了操作过程，提高了检测效率。

与相比现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明将血清学和RT-LAMP扩增技术有机结合，充分发挥两种检测方法的优势，并根据CMV复制酶基因保守的序列设计LAMP扩增引物，采用RT-LAMP技术建立一种简便、灵敏、特异的检测香蕉植株、吸芽及组培苗中CMV检测技术，结果分析简便，可以通过颜色反应直接判断检测结果，实现对香蕉束顶病的早期监测和有效控制，建立了一套快速、高灵敏度、稳定可靠的IC-RT-LAMP检测方法，以便及时采取有效的防控手段防治该病害的扩散与传播。

（2）本发明用特异性的抗血清捕捉CMV粒子，提高了检测的特异性，减少了假阳性。

（3）本发明用捕捉的病毒粒子直接作为检测对象进行RT-LAMP检测，避免了抽提植物总RNA和二次污染。

（4）本发明通过颜色反应可以直接判断结果，使检测结果更直观。

（5）本发明具有操作简单，不需要特殊的仪器设备，反应快速，成本低，特异性强，灵敏度高的优点，且用时短，其灵敏度比普通PCR高100倍，对病毒早期诊断灵敏高效。可利用本检测方法快速检测和鉴定CMV，监控预防该病害的进一步扩散和流行。可作为香蕉黄瓜花叶病毒特异性检测的有效手段，以便及时采取措施，减少病毒病带来的经济损失。

附图说明

图1为IC-RT-LAMP法检测香蕉病样；A为肉眼观察检测结果；B为紫外灯观察检测结果；C为电泳检测结果，1～9分别为1～9个香蕉样品；10为阳性对照；N为阴性对照；B为空白对照；M：DNA Marker 2000；检测结果：自左到右，第1、3～4、7～10个试管为绿色；2、5～6、N和B为染料颜色。

图2为RT-PCR和IC-RT-LAMP检测香蕉病株中CMV的灵敏度比较；图A为紫外灯分析IC-RT-LAMP检测香蕉病株中CMV的灵敏度；图B为电泳分析IC-RT-LAMP检测香蕉病株中CMV的灵敏度；图A和B中1～8为香蕉病株中CMV的浓度分别为8.76×10⁶～8.76×10^-1 copies/μL，9：健株的香蕉，10：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；图C为电泳分析RT-PCR检测香蕉病株中CMV的灵敏度，1～8：香蕉病株中CMV的浓度分别为8.76×10⁶～8.76×10^-1 copies/μL，9：健株的香蕉，10：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；检测结果：自左到右，第1～6个试管为绿色，7～10为为染料颜色。

图3为IC-RT-LAMP和RT-PCR检测香蕉病株中CMV的特异性分析；图A为紫外灯分析香蕉病株总RNA的IC-RT-LAMP检测特异性；图B为电泳分析IC-RT-LAMP检测香蕉病株总RNA的特异性；图C为电泳分析RT-PCR检测香蕉病株总RNA的特异性；图中1～8分别为CMV侵染的香蕉、BBTV侵染的香蕉、BSV侵染的香蕉、香蕉枯萎病病原菌Foc1侵染的香蕉、香蕉枯萎病病原菌Foc4侵染的香蕉、香蕉细菌软腐病菌株XJ8-3、香蕉细菌鞘腐病菌株XJ5-1侵染的香蕉、健康的香蕉，9：ddH₂O，M：DNA Marker 2000 bp；检测结果：自左到右，第1个试管为绿色；2～9为为染料颜色。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 IC-RT-LAMP检测田间采集的疑似香蕉样品

以田间采集的疑似感染CMV的香蕉样品作为待测样品，利用本发明的方法，进行IC-RT-LAMP检测，以健康香蕉植株为阴性对照，以感染CMV的香蕉植株为阳性对照。

1、引物设计

根据NCBI报道的CMV外壳蛋白(CP)基因保守序列设计引物，通过DNAstar软件分析后找出该病毒外壳蛋白(CP)基因保守区域序列作为模板参考序列，设计LAMP外引物对CMV-F3/BBTV-B3和内引物对CMV-FIP/BBTV-BIP，序列如下：

CMV-F3: 5’- CGCGCATCCAAATTCGAGTT-3’

CMV-B3: 5’- CGCATCGCCGAAAGATCA-3’

CMV-FIP:

5’- TGGCGGCAACGGATAAGTCCTTCTACCGTGTGGGTGACAG-3’

CMV-BIP:

5’- TCTCTGCTATGTTCGCGGACGTGTTGTTGGCTTGGACTCCA-3’

2、用具的处理

各种型号的枪头、离心管和PCR 管，配制和保存提取缓冲液之用的所有玻璃器皿，均用0.1% DEPC 水溶液浸泡24 h 后高压灭菌，在烘箱中烘干备用。

3、CMV的免疫捕捉（IC）

（1）用磷酸缓冲液（PBS）来稀释病毒的抗血清（CMV 单抗为1:2000，或根据CMV抗体推荐浓度进行稀释），分装至200 μL PCR 管中各100 μL，4 ℃过夜，洗涤3 次；

（2）取1 mL 碳酸盐包被缓冲液（0.05 M，pH9.6）来研磨0.1 g 香蕉待测样品，从中取出100 μL研磨液置于上述PCR 管中，在恒温箱中37℃放置3 h；

（3）磷酸缓冲液洗涤液（PBST）洗涤3 次，甩干；即获得免疫捕捉CMV。

4、RT-LAMP 扩增

（1）配制RT-LAMP 反应缓冲液（总体系25 μL），RT-LAMP 检测的反应体系为25 μl，扩增体系中各组分的含量为：dNTPs（10 mmol/L each）4 μL；betaine（5 mol/L）5 μL；MgSO₄（20mmol/L）5 μL；10×Thermopol reaction buffer 5 μL；引物CMV-F3/B3（25 μmol/L）各0.2μL；引物CMV-FIP/BIP（50 μmol/L）各0.8 μL；Bst酶（8 U/μL）1 μL；RTase M-MLV（100 U/μL）0.2 μL；RNase Inhibitor（40 U/μL）0.2 μL；ddH₂O补至25 μL。将配制好的RT-LAMP 反应液加入已捕捉CMV的PCR 管中，加入等体积的石蜡油。

（2）在金属恒温浴中60 ℃扩增65 min；85℃，8 min。

（3）反应结束后，在PCR管盖内加1 μL 10×SYBR Green I 荧光染料工作液，盖紧PCR管，混匀。

5、结果分析

实验结果通过肉眼观察，紫外灯以及电泳观察，以判断香蕉样品是否带毒（图1）。

肉眼观察，若扩增产物淡绿色，则为感染CMV的香蕉样品；若扩增产物颜色不变，为香蕉样品未感染CMV（图1A）。在紫外灯下，若扩增产物颜色有绿色荧光，则为感染CMV的香蕉样品；若颜色不变，则香蕉样品未感染CMV（图1B）。检测结果：自左到右，第1、3～4、7～10个试管为绿色；2、5～6、N和B为染料颜色。

电泳检测，若电泳呈明亮的弥散状核酸泳带，为感染CMV的香蕉样品；若电泳无弥散状核酸泳带，为未感染CMV的香蕉样品（图1C）。

这种检测植株上CMV方法的应用包括：在香蕉植株、香蕉组培苗、香蕉吸芽、以及其他芭蕉科作物上疑似病株的诊断和鉴定。

实施例2 RT-PCR和IC-RT-LAMP检测CMV的灵敏度比较

1、为了对RT-PCR和IC-RT-LAMP方法检测CMV的灵敏度进行比较，将CMV侵染的香蕉取适量混匀，分为二份，一份用Omege公司植物组织RNA抽提试剂盒提取总RNA，总RNA浓度调节至100 ng/μL，定量分析测定其初始核酸浓度为8.76×10⁶ copies/μL，进行10倍梯度连续稀释，进行RT-PCR；另一份CMV侵染的香蕉用作IC-RT-LAMP扩增。实验均重复3次。

2、IC-RT-LAMP检测香蕉CMV的灵敏度结果

分别用CMV抗血清捕捉病毒粒子，用实施例1中的IC-RT-LAMP检测体系进行反应。结果显示，在紫外灯下，稀释度为8.76×10⁶～8.76×10¹ copies/μL的香蕉样品有绿荧光色，而其他稀释度样品无绿荧光色（图2A）。

电泳结果显示，稀释度为8.76×10⁶～8.76×10¹ copies/μL的香蕉样品能够扩增出目的条带，其余样品均没有扩增出目的条带（图2B）。

这表明本发明IC-RT-LAMP检测香蕉CMV的灵敏度为8.76×10¹ copies/μL（图2A/B）。

3、RT-PCR检测CMV的灵敏度结果

根据NCBI报道的CMV外壳蛋白（CP）基因保守的序列设计RT-PCR引物CMV-CPF/CPR，序列如下：

CMV-CPF: 5’- ATGGACAAATCTGAATCAACCAGTGCT-3’

CMV-CPR: 5’-TCAAACTGGGAGCACCCCTGATGTGGGAATG-3’

对CMV侵染的香蕉总RNA10倍梯度稀释，用引物CMV-CPF/CPR对稀释的样品进行RT-PCR扩增。RT-PCR反应体系为10μL，扩增体系中各组分的含量为：2×1 Step Buffer 5 μL，CMV-CPF（10 μmol/L）0.4 μL，CMV-CPR（10 μmol/L）0.4 μL，RNA模板（100 ng/μL）1 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.2 μL，RNase-free ddH₂O 3 μL。

RT-PCR反应程序为：50 ℃逆转录30 min，预变性94 ℃5min，变性94 ℃30 s，延伸56 ℃30 s，退火72 ℃1 min（变性、延伸和退火共35个循环），终止72 ℃5 min。

反应结束后，分别取RT-PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。结果显示，RT-PCR检测香蕉中CMV的灵敏度为8.76×10³ copies/μL（图2C）。

4、RT-PCR和IC-RT-LAMP检测香蕉CMV的灵敏度结果比较

IC-RT-LAMP检测香蕉CMV的灵敏度为8.76×10¹ copies/μL（图2A/B）；RT-PCR检测香蕉中CMV的灵敏度为8.76×10³ copies/μL（图2C）。

结果表明，IC-RT-LAMP检测CMV的灵敏度比RT-PCR检测方法高100倍。

实施例3 IC-RT-LAMP检测CMV的特异性

1、为了分析IC-RT-LAMP检测CMV的特异性，分别以感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及香蕉枯萎病的病原菌生理小种1号（Fusarium oxysporum f. sp. Cubenserace 1,Foc1）、香蕉枯萎病菌生理小种4号（Fusarium oxysporum f. sp. Cubenserace 4, Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌（Dickeyazeae）菌株XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌（Dickeyadadantii）菌株XJ5-1的香蕉为样品，分别进行IC-RT-LAMP检测和RT-PCR检测。实验均重复3次。

2、IC-RT-LAMP检测CMV的特异性结果

为了分析IC-RT-LAMP检测CMV的特异性，分别以感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及分别感染香蕉枯萎病生理小种1（Foc1）、香蕉枯萎病生理小种4（Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌XJ5-1的香蕉为样品，分别用CMV抗血清进行免疫捕捉，用实施例1中的IC-RT-LAMP检测体系进行反应。

实验结果显示，CMV感染的香蕉扩增产物有绿荧光色；而扩增其他样品时均无绿荧光色（图3A）。电泳结果显示，除了感染CMV的香蕉能够扩增出目的条带外，其余样品均没有扩增出目的条带（图3B）。

这表明本发明建立的IC-RT-LAMP方法具有很好的特异性。

3、RT-PCR检测验证IC-RT-LAMP检测的特异性

根据NCBI报道的CMV外壳蛋白(CP)基因保守的序列设计RT-PCR引物CMV-CPF/CPR，序列如下：

CMV-CPF: 5’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAGTGCT-3’；

CMV-CPR: 5’-TCAAACTGGGAGCACCCCTGATGTGGGAATG-3’。

分别用Omege公司植物组织RNA抽提试剂盒感染CMV、BBTV或BSV病毒的香蕉，以及分别感染香蕉枯萎病生理小种1（Foc1）、香蕉枯萎病生理小种4（Foc4）、香蕉细菌性软腐病病原菌XJ8-3和香蕉叶鞘腐败病病原菌XJ5-1的香蕉植株总RNA，并以此为RT-PCR模板进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系为10μL，扩增体系中各组分的含量为：2×1 Step Buffer 5 μL，CMV-CPF（10 μmol/L）0.4 μL，CMV-CPR（10 μmol/L）0.4 μL，RNA模板（100 ng/μL）1 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.2 μL，RNase-free ddH₂O 3 μL。

RT-PCR反应程序为：50 ℃逆转录30 min，预变性94℃ 5min，变性94℃ 30s，延伸56℃ 30s，退火72℃ 1min（变性、延伸和退火共35个循环），终止72℃ 5min。

反应结束后，分别取RT-PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。

结果显示，除香蕉中感染CMV的香蕉能够扩增出目的条带外，其余样品均没有扩增出目的条带（图3C）。

同时，RT-PCR检测再次验证了本发明IC-RT-LAMP检测香蕉病株中CMV的方法的特异性，说明所建立的IC-RT-LAMP检测CMV特异性较好。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种免疫捕捉-反转录环介导等温扩增反应检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcgcatcca aattcgagtt 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcatcgccg aaagatca 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcggcaac ggataagtcc ttctaccgtg tgggtgacag 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctctgctat gttcgcggac gtgttgttgg cttggactcc a 41

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggacaaat ctgaatcaac cagtgct 27

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaaactggg agcacccctg atgtgggaat g 31

Claims

1.一组用于IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述检测引物组包含内引物对和外引物对；所述外引物对为CMV-F3/CMV-B3，序列如SEQ ID NO.1～2所示；所述内引物对为CMV-FIP/CMV-BIP，序列如SEQ ID NO.3～4所示。

2.权利要求1所述引物组在香蕉黄瓜花叶病毒的检测中应用。

3.一种利用IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 用特异性的CMV抗血清捕捉待测样品中的病毒粒子；

S2. 以步骤S1捕捉的病毒粒子为模板，利用权利要求1所述引物组进行RT-LAMP扩增反应；S3. 根据扩增结果判断待测样品中是否含有香蕉黄瓜花叶病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述CMV抗血清为多克隆抗体或单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述RT-LAMP扩增反应的体系如下：10mmol/L dNTPs 4 μL；5mol/L 甜菜碱5 μL；20 mmol/L MgSO₄ 5 μL；10×反应缓冲液5 μL；25 μmol/L引物CMV-F3/ CMV-B3各0.2 μL；50 μmol/L引物CMV-FIP/ CMV-BIP各0.8 μL；8U/μL Bst酶1 μL；100 U/μL RTase M-MLV 0.2 μL；40 U/μL RNase 抑制剂 0.2 μL；ddH₂O补至25 μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述RT-LAMP扩增的反应条件为：55～65 ℃恒温水浴中扩增反应60～70 min；80～90 ℃，6～10 min。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述捕捉待测样品中的病毒粒子的方法为：将CMV抗血清稀释后包被容器；用碳酸盐包被缓冲液研磨待检测组织并加入上述容器中，免疫捕捉得到病毒粒子。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3所述根据扩增结果判断待测样品站是否含有CMV的具体方法为荧光染料技术或电泳检测技术；所述荧光染料技术为：取SYBRGreen I荧光染料反应液加入步骤S2所述RT-LAMP扩增反应产物中，在紫外灯下，若扩增产物变化为绿荧光色即为阳性反应，表示样品中含有CMV；若扩增产物颜色不变则为阴性反应，表示样品中不含有CMV；

所述电泳检测技术为：将步骤S2所述RT-LAMP扩增产物进行电泳观察，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，即为阳性反应，表示样品中含有CMV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含有CMV。

9.一种利用IC-RT-LAMP法检测香蕉黄瓜花叶病毒的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1所述引物组和/或特异性的CMV抗血清。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包含有RT-LAMP扩增反应所需的试剂。